特异性兴奋伏隔核中的GABA能神经元的组合物及其在改善精神分裂症异样行为中的应用

摘要

本发明提供了一种特异性兴奋伏隔核中的GABA能神经元的组合物及其在改善精神分裂症异样行为中的应用，所述组合物包括：用于感染伏隔核中的GABA能神经元的携带光感基因的病毒载体；该载体中包括启动子、光感基因、绿色荧光标记基因，其中，所述启动子为Syn启动子；能产生蓝光的光照装置，用于对感染后的伏隔核进行光照调控以使其兴奋。本发明组合物可以精确地特异性兴奋伏隔核中的GABA能神经元，可以有效改善精神分裂症异样行为。

说明书

技术领域

本发明是关于一种特异性兴奋伏隔核中的GABA能神经元的组合物及其在改善 精神分裂症异样行为中的应用。

背景技术

中国十二个地区精神疾病流行病学调查显示，目前全国约有1亿人有心理疾病， 严重精神疾病患者约1600万人，每年约有二十五万人死于自杀。中国十七岁以下的3.4 亿儿童、青少年中，约有三千万人受到情绪障碍和心理行为问题的困扰。当前神经精 神疾病在我国疾病总负担中排名第一，占全部疾病和外伤所致残疾及劳动力丧失的五 分之一。据专家预测，21世纪将是精神疾患流行的世纪，随着我国经济建设和社会发 展的步伐加快，生活节奏和竞争日益增强，精神疾病会继续增加,预计到2020年，精 神疾病在我国疾病总负担中将占到25％。世界卫生组织把新世纪的第一年定为精神卫 生年，所以不管我们愿意与否，我们正无情地进入到了“精神疾病时代”。

精神分裂症(schizophrenia)是人类最严重的精神性疾病之一，以基本个性改变， 思维、知觉、情感、行为的分裂，精神活动与环境的不协调为主要特征。流行病学调 查资料显示，目前全世界患有精神分裂症和神经两级错乱的病人约占总人口的2％。精 神分裂症具有致残率高、复发率高、预后不佳、社会负担沉重等特点，严重影响了我 国人口健康和经济发展。

目前主流认为精神分裂症患者出现的症状与大脑内部多巴胺功能的亢进有某种 联系。临床上把D2型多巴胺受体(Dopamine Receptor D2，DRD2)拮抗剂作为治疗精 神病药物表现出了明显的治疗效果。相反，在健康个体上反复使用苯丙胺这类增加多 巴胺释放的神经活性物质可以诱导出精神病，也可以加剧精神分裂症患者的精神病性 症状。同样，对帕金森病患者使用多巴胺的前体左旋多巴，可以在许多患者中诱发精 神病性症状(通常是幻觉和妄想)。

现在针对精神分裂症多巴胺类药物已持续了30多年，正反两方面的依据都有，但 都没有突破性的进展。而且，精神分裂症患者是否存在多巴胺水平异常也缺乏直接的 证据：与健康个体比，精神分裂症患者的神经元在刺激下是否向突触释放出更多的多 巴胺，至今没有定论；也有研究表明，精神分裂症患者可能存在对多巴胺运输和功能 的异常调节。因此，目前控制精神病的发病主要依靠药物治疗和家庭社会的支持，无 法对异常神经回路中多巴胺系统进行特异性的调控而无法实现真正治疗的目的，只是 “治标”而已。

近年来γ-氨基丁酸(GABA)能网络在精神分裂症、抑郁症、自闭症及焦虑症等 疾病中的作用正逐步被人们所认知。最新国际上的研究证据表明，GABA神经元的异 常在精神分裂症中扮演了非常重要的作用。伏隔核位于基底核与边缘系统交界处，隔 区的外下方，尾壳核的内下方，前方与嗅前核相连，后续终纹床核，腹侧为腹侧苍白 球和嗅结节，是基底前脑的一个较大的核团。该核团的基本细胞类型是中型多棘神经 元。这类神经元产生的神经递质是γ-氨基丁酸(GABA)。但伏隔核是否可作为调控精 神分裂症异常行为的靶点还未进行研究，现有技术也尚未提供一种特异性干预伏隔核 进而改善精神分裂症异常行为的方法。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种特异性调控靶标进而有效改善精神分裂症异常 行为的技术。

本发明利用光遗传调控技术，特异性地调控精神分裂症动物伏隔核携带光敏通道 蛋白的细胞，同时监测行为学的改变，发现伏隔核脑区特异性地兴奋后，能显著改善 其先天恐惧弱化和/或焦虑的异常行为，从而认为伏隔核很可能是干预精神分裂症异 样行为的新靶点。

从而，一方面，本发明提供一种特异性兴奋伏隔核中的GABA能神经元的组合 物，该组合物包括：

用于感染伏隔核中的GABA能神经元的携带光感基因的病毒载体；该载体中包 括启动子、光感基因、绿色荧光标记基因，其中，所述启动子为Syn启动子；

能产生蓝光的光照装置，用于对感染后的伏隔核进行光照调控以使其兴奋。

本发明中将携带光敏基因的慢病毒载体注入到伏隔核区，其将会感染伏隔核区中 的GABA能神经元，在GABA能神经元内表达相应的光敏受体，通过光照系统对表达 了光敏受体的GABA能神经元进行光刺激，使其兴奋，GABA能神经元受光兴奋后， 发挥改善精神分裂症异样行为的功能。本发明通过高架迷宫实验证明通过本发明的组 合物刺激伏隔核兴奋后，能够明显的改善精神分裂症异样行为，例如先天性弱化恐惧 和/或焦虑，可有效改善精神分裂症动物模型对危险因素的错误判断，提高其回避相关 不利环境的能力。因此，本发明提供了针对精神分裂症患者缺乏安全意识的特征性异 常行为，提高其回避危险的认知能力新的治疗靶点；同时为研制开发新型药物提供了 新的策略。

根据本发明的具体实施方案，本发明中所述的特异性兴奋伏隔核中的GABA能 神经元的组合物也可以称为一种“套组”或“套件”，其中包括了本发明中特异性兴 奋伏隔核中的GABA能神经元所采用的各试剂、材料及仪器设备等组件，作为一种 产品例如试剂盒的形式，各组件可按照预定的位置在大包装中分别放置或是独立包装 后成套销售及使用。

根据本发明的具体实施方案，本发明中所述的特异性兴奋伏隔核中的GABA能 神经元的组合物还包括：使所述携带光感基因的病毒载体感染伏隔核中的GABA能 神经元的试剂材料。具体例如可包括：立体定位仪及相关进样系统，能够准确的将携 带光敏基因的病毒载体注入到伏隔核区，从而使其感染伏隔核区中的GABA能神经 元细胞。

在本发明的一具体实施方案中，构建了用于感染伏隔核中GABA能神经元细胞 或其前体细胞的携带光感基因的病毒载体；该载体中的启动子为Syn启动子；光感基 因为ChR2；绿色荧光标记基因为eYFP；所述病毒为慢病毒；具体的构建过程可以参 照所属领域中的现有技术进行。

根据本发明的具体实施方式，其中所述的携带光敏基因的病毒载体为含带有Syn 质粒的慢病毒载体。伏隔核中GABA能神经元细胞感染含带有Syn质粒的慢病毒载 体后，启动子Syn启动携带光敏基因开始转录，在伏隔核区中GABA能神经元细胞 内表达相应的光敏受体，在受到光刺激后从而使伏隔核脑区兴奋，起到改善精神分裂 症异样行为的作用。根据本发明的具体实施方式，本发明中所述的改善精神分裂症异 样行为的组合物，其中，所述的携带光敏基因的慢病毒载体为含带有Syn-ChR2-eYFP 质粒的慢病毒载体，其结构如图1A所示。在本发明的一具体实施例中，所述的 Syn-ChR2-eYFP可采用如下方法构建，将含有光敏基因、绿色荧光标记基因及用于特 定性标记神经元的启动子Synapsin(Syn)的质粒和与慢病毒包装相关的混合质粒 pCMVΔR8.74、pMD2.G.一起，利用脂质体一起转染至293FT细胞，培养后破膜得 到含带有Syn-ChR2-eYFP质粒的慢病毒载体。

根据本发明的具体实施方式，本发明所述的特异性兴奋伏隔核中GABA能神经 元细胞的组合物中，其中，所述蓝光为波长460～480nm的蓝光，优选为波长470nm 的蓝光。

另一方面，本发明提供特异性兴奋伏隔核中的GABA能神经元的组合物在制备 用于改善精神分裂症异样行为系统中的应用。例如特异性兴奋伏隔核中的GABA能 神经元的组合物为本发明所述的组合物，所述的应用为本发明的组合物在制备用于改 善精神分裂症引起的先天恐惧弱化和/或焦虑系统中的应用。

根据本发明的具体实施方式，在本发明所述的应用中，其中，所述的改善精神分 裂症异样行为系统是利用所述组合物中携带光感基因的病毒载体感染大脑伏隔核区 中的GABA能神经元，并通过光照装置对感染后的伏隔核进行蓝光光照刺激，以改 善精神分裂症异样行为。

根据本发明的具体实施方式，在本发明所述的应用中，其中，所述系统还包括用 于将蓝光传导至感染后的伏隔核的光纤。在本发明的一具体实施例中，采用200μm 的光纤将光照装置产生的光引入大脑伏隔核，用于对感染后的伏隔核进行光调控。

根据本发明的具体实施方式，在本发明所述的应用中，其中，所述蓝光光照条件 为：蓝光波长470～480nm，光纤的出口功率12～20mW左右，光照频率40～80Hz的 光；1：1的占空比，持续5min以上。

另一方面，本发明还提供一种改善精神分裂症异样行为系统，该系统包括本发明 所述的组合物。例如，所述的精神分裂症异样行为是先天恐惧弱化和/或焦虑。

本发明的有益技术效果：本发明的技术可以精确地特异性兴奋伏隔核中的GABA 能神经元，可以有效改善精神分裂症异样行为，较传统的多巴胺拮抗剂药物治疗，真 正实现了特异性，具有重要意义。

附图说明

图1A为Syn-ChR2-eYFP质粒示意图；

图1B～1C为小鼠伏隔核中GABA能神经元细胞成功表达Syn-ChR2-eYFP的示意 图，图中Acbc为伏隔核，Acbsh为伏隔核壳体；

图2为通过光照对小鼠伏隔核区进行光照的示意图，图中Acbc为伏隔核，Acbsh 为伏隔核壳体；

图3为实施例1中光照条件下提高了伏隔核脑区兴奋性的实验结果图；

图4为实施例1中野生型、DISC1::ChR2以及DISC1::eYFP型小鼠的高架十字迷宫 实验结果示意图；

图5为实施例1中野生型、DISC1::ChR2以及DISC1::eYFP型小鼠的高架十字迷宫 实验结果的统计结果图。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实例 对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于 限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照所属领域的 常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例中，所用原始试剂和材料均可商购获得，或可按照现有技术的记载制 备得到。

实施例1

(1)、携带Syn-ChR2-eYFP质粒的慢病毒载体的制备。

制备用于在动物活体感染伏隔核的慢病毒载体，其携带有Syn-ChR2-eYFP质粒： 将含有光敏基因、绿色荧光标记基因及用于特定性标记神经细胞的启动子Syn的质粒 (0.5μg)(该融合质粒结构如图1A所示)，和与慢病毒包装相关的混合质粒pCMV ΔR8.74、pMD2.G.(1.5μg)一起，利用脂质体(Invitrogen公司产品)一起转染至 293FT细胞(ATCC公司产品，该细胞传代至25代后即需要更换新的一批细胞株)中 (每200,000个细胞用6μL脂质体)。24小时后，培养293FT细胞的培养液换成无血清 含有5mM丙酮酸钠的DMEM后继续孵育。16小时后，利用超速离心机在50,000g速度 下破膜，将悬液通过20％的蔗糖滤柱，收集上清。该病毒滴度能达3×10⁸TU/mL以上， 产出的病毒颗粒以灭菌的磷酸盐缓冲液以1：1000的体积比进行重悬。将获取的病毒 重悬液按1：400的体积比混入无血清DMEM中，用于感染动物模型的目标脑区：伏隔 核。

(2)、将携带Syn-ChR2-eYFP质粒的慢病毒载体注入调控区使其感染细胞。

采用神经科学领域常规的立体定位技术以及微量进样系统将上述制备得到的携 带光敏基因的慢病毒注入到小鼠的伏隔核，注入量一般为0.4μL，注入后，等待3周， 取1～3只小鼠脑组织，进行免疫组织荧光染色鉴定，鉴定结果显示有绿色荧光，表明 Syn-ChR2-eYFP在原位表达成功(可参见图1B及图1C)，即可开展光调控下的患精 神分裂症的小鼠行为学检测，其中患精神分裂症的小鼠为采用他莫昔芬(tamoxifen) 诱导DISC1突变蛋白表达的转基因小鼠。

(3)、光调控下的患精神分裂症的小鼠行为学检测。

如图2所示，在上述Syn-ChR2-eYFP原位表达成功的小鼠的伏隔核脑区垂直插入 市售直径为200μm光纤，进行470nm的蓝光刺激，光强为1.1mW，光照频率为60Hz， 每隔50ms照射50ms，占空比为1:1，持续5min后，采用在体光-电一体刺激和记录的 方法对伏隔核脑区神经元放电特征进行提取分析，其结果如图3所示，图3结果表明光 刺激后，提高了大脑伏隔核脑区的兴奋性，然后对小鼠(编号为DISC1::ChR2)进行 高架十字迷宫实验，同时对野生型小鼠以及DISC1型及仅转染eYFP基因的精神分裂症 小鼠(编号为DISC1::eYFP)进行对比实验，其结果如图4所示，图5为其统计结果。 图4及图5中DISC1::ChR2表示患精神分裂症的伏隔核中的GABA能神经元细胞转染了 ChR2并表达了光敏感通道蛋白的DISC1转基因小鼠，DISC1::eYFP表示患精神分裂症 的伏隔核中的GABA能神经元细胞仅感染了eYFP并表达了该基因的DISC1转基因小 鼠，图中ON表示打开光刺激，所示的光刺激的方式如上所述，OFF表示关闭光刺激。

所述的高架十字迷宫(High plus maze)是利用动物对新异环境的探究特性和对 高悬敞开臂的恐惧形成矛盾冲突行为来考察动物的焦虑状态。高架十字迷宫具有一对 开臂和一对闭臂，啮齿类动物由于嗜暗性会倾向于在闭臂中活动，但出于好奇心和探 究性又会在开臂中活动，在面对新奇刺激时，动物同时产生探究的冲动与恐惧，这就 造成了探究与回避的冲突行为，从而产生焦虑心理。而抗焦虑药物能明显增加进入开 臂的次数与时间，十字迷宫距离地面较高，相当于人站在峭壁上，使实验对象产生恐 惧和不安心理。本实施例的迷宫离地高60cm，开放臂为25×5cm(长×宽)，闭合 臂25×5×14.3cm(长×宽×高)。

从图4及图5可以看出，高架十字迷宫实验表明，在调控前的OFF状态下，DISC1 精神分裂症型小鼠(DISC1::ChR2及DISC1::eYFP)对开放臂的先天恐惧低于野生型 小鼠，进入开放臂的概率大于野生型。但是在ON状态下，光遗传技术特异性调控 DISC1小鼠的NAc脑区(DISC1：：ChR2)后(注射含有光基因ChR2在NAc脑区， 并用光直接刺激该脑区)，其对比野生型对照组，其进入开放臂的概率就没有显著差 异，提示调控起效；另外，对比打了空壳病毒(DISC1：：eYFP)的DISC1小鼠，其 显著降低了进入开放臂的概率。