一种筛选抗TMV烟草品种的引物及其方法和试剂盒

摘要

本发明提供了一种筛选抗TMV烟草品种的引物及其方法和试剂盒，该引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。通过PCR扩增反应检测N基因或CN基因两个抗性基因；若有613bp条带，则该检测品种具有TMV抗性；若无613bp条带，则该品种不具TMV抗性。本发明的试剂盒含上下游引物、2×PCR缓冲液和ddH

说明书

技术领域

本发明属于植物品种抗性检测领域，具体涉及一种筛选抗TMV烟草品种的引物及其方法和试剂盒。

背景技术

烟草普通花叶病(TMV，tobacco mosaic virus)是烟叶生产中主要的病害之一，TMV的发生严重影响烟叶的产量和品质，导致农民遭受严重损失。目前并没有有效的农药用于治疗TMV，选育抗病品种仍是预防普通花叶病最经济、最有效的手段。而选育抗病品种的一个重要环节是抗性鉴定。

传统的抗性鉴定方法主要是大田接种鉴定和温室接种鉴定。这两个方法操作繁琐、工作量大，鉴定周期要2-3个月，受种植环境的影响，不可控因素多，而且接种病毒的成功与否也直接影响鉴定结果。而近年来出现了PCR检测抗性基因的报道，但基本都是利用单个抗病基因设计的特异引物，而现已发现多个TMV抗性基因，如果单独针对某个基因设计引物可能会造成错将其他基因介导的抗性品种当初感病品种。

在己发现的抗TMV基因中，N基因是最有效的，可抗TMV和其它绝大多数烟草花叶病毒组成员。CN基因是张政云等从黄花烟HZNH中克隆的一个新的N基因的同源基因，HZNH是我国特有的地方种质资源，接种烟草花叶病毒TMV-U1后表现出超敏反应和系统获得性抗性。普通烟草中的安巴里玛(Ambalema)品种对TMV表现出抗病性，其抗性是由隐性等位基因rm1和rm2控制的，而且抗病基因与不良性状基因有连锁关系，较难利用其进行育种。虽然N基因已经被广泛应用于烟草抗TMV育种，但我国的地方烟草种质资源也是我们常用的育种材料，所以有必要重视在地方烟草种质资源发现的CN基因，且CN基因和N基因一样为单显性基因，很容易进入烟草的育种程序，含这两个基因的任意一个的品种即对TMV免疫。

发明内容

为克服上述技术缺陷，本发明提供了一种筛选抗TMV烟草品种的引物及其方法和试剂盒，该方法能在烟草TMV抗性育种中快速稳定且利用尽量多的抗性资源，筛选出抗TMV烟草品种。

为实现该目的，按以下技术方案进行。

本发明首先提供了一种筛选抗TMV烟草品种的引物，所述引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种筛选抗TMV烟草品种的方法，使用一对引物通过PCR扩增反应检测两个抗性基因，所述引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述两个抗性基因为N基因或CN基因；该筛选方法结果的判断标准如下：

PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳30min，用凝胶成像系统观察并拍照。若扩增出613bp的条带，则证明可扩增出N基因或CN基因条带，该检测品种具有TMV抗性；

若无613bp扩增条带，则不含N基因或CN基因，判断该品种不具N基因或CN基因介导的TMV抗性。

所述PCR扩增反应的反应体系如下：

待检模板50～100ng；

10μM上下游引物各1.0μL；

2×PCR缓冲液10μL；

ddH₂O补至20μL。

所述PCR扩增反应的反应程序为：

94℃5min；

94℃40s，55℃40s，72℃50s，30个循环；

72℃7min；

4℃60min。

引物由深圳华大基因科技服务有限公司合成，可用于扩增N基因的2345-2957区域片段和CN基因的2368-2980区域片段，图1为引物针对基因片段的比对结果。两个片段的长度均为613bp，相似性达到94％。

本发明还提供了一种筛选抗TMV烟草品种的试剂盒，所述试剂盒含上下游引物、2×PCR缓冲液和ddH₂O；所述下上游引物的浓度为10μM，所述引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述缓冲液由20mM Tris-HCl(pH8.3)、100μM dNTP、100mM KCl、3mM MgCl₂和0.1U Taq酶/μl组成。

这种一次检测两个基因的方法较单个基因检测具有较少操作步骤，节省材料、试剂，进而达到快速、成本低的优势；另外可以避免单基因检测而漏掉另外的抗性基因。

附图说明

图1为引物针对基因片段的比对结果；

图2为用本发明的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物扩增23个待测品种检测的电泳结果图；

图3为YK1058、Coker176、达子烟、岢岚小兰花品种检测的电泳结果图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例1：本发明的一种筛选抗TMV烟草品种的试剂盒的优选实施例

本实施例为本发明的一种试剂盒筛选抗TMV烟草品种的试剂盒的优选实施例，本试剂 盒含上下游引物、2×PCR缓冲液和ddH₂O；所述下上游引物的浓度为10μM，所述引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述缓冲液由20mM Tris-HCl(pH8.3)、100μM dNTP、100mM KCl、3mM MgCl₂和0.1U Taq酶/μl组成。

上游引物N5309U序列如SEQ ID NO：1：5`-GATGCCAGTGATACTCTAA-3`，

下游引物N5921L序列如SEQ ID NO：2：5`-ATACACTACTATCCCAACC-3`。

实施例2：利用实施例1的试剂盒对23个待测烟草品种进行抗性筛选的优选实施例。

利用实施例1所述的试剂盒对23个待测烟草品种进行抗性筛选。将23个待测烟草品种播种于育苗盘中，待烟苗长到2～3片真叶时剪取0.1g叶片装进1.5mL EP管中，用于提取DNA。23个待测烟草品种的名称及TMV抗性见表1。

表1

编号 品种 抗性 抗性来源 编号 品种 抗性 抗性来源 1 YK1058 免疫 N基因 13 达子烟 免疫 未知 2 94-33-1-1 免疫 N基因 14 蛤蟆烟 免疫 未知 3 97-7-1111 免疫 N基因 15 94-46-5-1 不免疫 无N基因 4 94-17-1 免疫 N基因 16 岢岚小兰花 免疫 未知 5 YK1158 免疫 N基因 17 Va80 免疫 N基因 6 MS95-55 免疫 N基因 18 NC567 免疫 N基因 7 94-47-4 免疫 N基因 19 Xanthi 不免疫 未知 8 MS云烟85 不免疫 无N基因 20 K326 不免疫 无N基因 9 MSG80 不免疫 无N基因 21 K326湘 不免疫 无N基因 10 YK1156 免疫 N基因 22 K326×K326湘 不免疫 无N基因 11 Coker176 免疫 N基因 23 Va45 免疫 N基因 12 云烟87 不免疫 无N基因        

DNA提取：

1、将EP浸入液氮中1min后取出，立即用预冷的研磨杵快速将叶片研磨成粉。

2、立即加入等体积(w/v)2×CTAB提取缓冲液，65℃保温30分钟，其间不时摇动。

3、加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下，12000r/min离心10分钟。

4、将上清液转入另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，室温12000r/min离心10分钟。

5、将上层水相转入新离心管中，加入2倍体积的预冷的无水乙醇，-20℃放置20分钟。

6、12000r/min离心5分钟，去上清液，70％乙醇漂洗两次，沉淀干燥。

7、加入50μl的TE缓冲液溶解DNA，检测DNA浓度，稀释到100ng/ul，-20℃保存备用。PCR扩增按如下步骤进行：

1、反应体系为20μl，模版50～100ng，上下游引物(10μM)各1.0μl，2×PCR缓冲液10μl，ddH₂O补至20μl。

2、反应程序：94℃5min；94℃40s，55℃40s，72℃50s，30个循环；72℃7min；

4℃60min。

3、PCR结束后，进行琼脂糖凝胶电泳30min，用凝胶成像系统观察并拍照。本筛选方法结果的判断标准如下：

若扩增出613bp的条带，则证明可扩增出N基因或CN基因条带，该检测品种具有TMV抗性；

若无613bp扩增条带，则不含N基因或CN基因，判断该品种不具N基因或CN基因介导的TMV抗性。

电泳结果见图2，图2为用本发明的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物扩增23个待测品种检测的电泳结果图。

图中dl2000为分子标准，1～23分别是YK1058、94-33-1-1、97-7-1111、94-17-1、YK1158、MS95-55、94-47-4、MS云烟85、MSG80、YK1156、coker176、云烟87、达子烟、蛤蟆烟、94-46-5-1、岢岚小兰花、Va80、NC567、Xanthi、K326、K326湘、K326×K326湘、Va45等23种品种。

由图2可看出，对TMV不免疫的品种8、9、12、15、19、20、21、22、23没有扩增， 说明其不含N基因和CN基因，与抗性情况一致；对TMV免疫含N基因的品种1、2、3、4、5、6、7、10、11、17、18、23均扩出613bp左右的片段；而对TMV免疫但抗性来源未知的13、14、16扩出613bp左右的片段，表明其可能含N基因或CN基因。该引物可以用于预测烟草品种的TMV抗性，有扩增出613bp左右条带的为含N基因或CN基因品种，对TMV免疫。

实施例3：抗性来源鉴定分析试验

实例1中，品种13、16(即达子烟、岢岚小兰花)对TMV免疫且扩增出613bp左右的片段，为了找出其抗性来源于N基因还是CN基因，对该引物的扩增产物进行测序。另外用YK1058和Coker176含N基因的品种与其作比较。

PCR体系为：反应体系为50μl，模板100～200ng，上下游引物(10μM)各2.5μl，2×PCR缓冲液25μl，ddH₂O补至50μl。反应条件和结果检测标准同实例1。

取5μlPCR产物进行电泳，结果显示该引物可以稳定地扩增出清晰的条带，把剩余的45μl送深圳华大基因科技服务有限公司测序。

图3为YK1058、Coker176、达子烟、岢岚小兰花品种检测的电泳结果图；图中dl2000为分子标准，1～4分别是YK1058、Coker176、达子烟、岢岚小兰花四个品种。

多重序列比较，YK1058和Coker176扩增出的片段序列一样，达子烟和岢岚小兰花扩出的片段序列一样，两个序列间相似性达95％。分别提交Genebank搜索，得到YK1058和Coker176扩出的片段序列与N基因(GeneBank登录号AB120513.1)2345-2957区域的序列完全一致，达子烟和岢岚小兰花扩增出的片段序列与CN基因(GeneBank登录号EF091690.1)2368-2980区域的序列相似性达99.5％。结果比对结果表明YK1058和Coker176含N基因，而达子烟和岢岚小兰花含CN基因，但设计引物能够同时检测两个基因。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

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