一种利用嗜热乳杆菌从L-谷氨酸生物转化法生产L-谷氨酰胺的方法

摘要

本发明涉及一种利用嗜热乳杆菌从L-谷氨酸生物转化法生产L-谷氨酰胺的方法，其特征在该方法是以L-谷氨酸为反应底物，以嗜热乳杆菌全细胞为生化反应的酶进行生物转化生产L-谷氨酰胺。本发明建立了一种直接以L-谷氨酸为底物，通过嗜热乳杆菌（Lactobacillus thermophilus ）全细胞酶转化，直接生物合成L-谷氨酰胺的方法。本发明方法生产周期短，原料成本和设备成本低廉，生产效率很高，产物积累浓度高，最终L-谷氨酰胺的产物积累浓度可达150g/L，对L-谷氨酸的分子转化率可达80%，具有极高的经济价值，产业化应用前景十分广阔。

说明书

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，特别是涉及一种利用嗜热乳杆菌从L-谷氨酸生物转化法生产L-谷氨酰胺的方法。

背景技术

L-谷氨酰胺占人体游离氨基酸的61％，是人体最普遍的、不可缺乏的条件性必需氨基酸。

近二十年前，科学家们只知道L-谷氨酰胺的存在但并不是十分了解它的作用。一般将其视为治疗消化道溃疡药物之一。但是十多年来这种情况有了巨大的改变。由于一系列的突破性发现，科学家们认为L-谷氨酰胺是“不可缺乏的非必需氨基酸”，它已经成为发展新型药物、临床治疗及运动营养保健的重要材料。

目前，生产L-谷氨酰胺的方法有发酵法、酶法和化学合成法。化学合成法生产过程中要用易燃易爆的二硫化碳，工人工作条件难以令人满意，产品带有或轻或重的醋酸硫化物臭味；酶法需要制备谷氨酰胺合成酶，制备费用高，技术难度大；发酵法是现在较通用的L-谷氨酰胺生产方法，现有技术中主要是采用以葡萄糖为底物，黄色短杆菌为菌种直接发酵法生产L-谷氨酰胺，该方法原材料便宜易得，产品质量可靠稳定，但是，存在着生产周期长，效率低，产品收率低，产品不易分离提取等缺陷。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种有效提高L-谷氨酰胺的生产效率，降低L-谷氨酰胺的生产成本，缩短生产周期，发酵过程产物积累浓度高，产物易分离提取的利用嗜热乳杆菌从L-谷氨酸生物转化法生产L-谷氨酰胺的方法。

为实现上述发明目的所采取的技术方案为：

一种利用嗜热乳杆菌从L-谷氨酸生物转化法生产L-谷氨酰胺的方法，其特征在该方法是以L-谷氨酸为反应底物，以嗜热乳杆菌全细胞为生化反应的酶进行生物转化生产L-谷氨酰胺。

上述嗜热乳杆菌全细胞的制备方法为：首先将斜面保存的嗜热乳杆菌进行摇瓶种子培养和发酵培养，然后离心分离，菌体破碎得到。

上述摇瓶种子培养和发酵培养所用的培养基组成为：酪朊水解物10g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏5g/L，葡萄糖20g/L，柠檬酸二铵2g/L，吐温801.0mL/L，KH2PO46g/L,MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4·4H2O 0.15g/L，FeSO4·7H2O0.03g/L，L-谷氨酸钠25g/L。

上述发酵培养条件为：发酵液接种量为5％～15％，pH值为5.5～6.5，培养温度为40℃～45℃，通风量为0.2～1.5vvm，搅拌转速为100～200r/min，发酵时间为15～24h。

上述离心分离是指在4000～6000r/min，4～6℃下离心10～15分钟。

上述菌体破碎采用超声波破碎，超声波工作频率20～25KHz，功率为500W～800W，间歇时间为30s～35s，破碎时间为10～15min。

所述生物转化生产过程为：首先配制质量百分比浓度为15％～20％的L-谷氨酸的水溶液，然后加入其质量的30％～40％的硫酸铵，用碱调整pH值为5.8～6.0，最后加入L-谷氨酸质量的10％～15％的嗜热乳杆菌全细胞，在温度45℃～50℃，搅拌转速200～300r/min的转化条件下进行生物转化。

在生物转化过程中流加氨水。

在生物转化反应开始5h后，根据pH值的变化情况流加一定量的氨水，使反应体系的pH值保持在5.8～6.0。

在生物转化过程中，当转化体系连续3小时pH值的变化小于0.1时，反应终止。

本发明的设计原理为：

通常来说，L-谷氨酰胺的生物合成途径是首先由葡萄糖生物合成谷氨酸，再由谷氨酸生物合成L-谷氨酰胺，其中由L-谷氨酸生物合成L-谷氨酰胺有两个步骤：

1.谷氨酸(GA)在谷氨酸激酶(glutamate kinase)和ATP参与下生成γ-谷氨酰磷酸；

2.γ-谷氨酰磷酸和NH₄⁺在谷氨酰胺合成酶(GM合成酶)和Mg2+参与下进一步生成谷氨酰胺。

从上面可以看出，谷氨酸激酶是谷氨酰胺生物合成中的关键酶，因为它催化了谷氨酰胺生物合成中的第一步。ATP分子中含有的两个高能磷酸键可以供给生物体活动时所需能量，也可供给磷酸基。

嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)ATCC8317同黄色短杆菌的GA激酶活性、ATP含量和GM产量之间的关系同表1所示：

表1：

①在540nm处测定的光密度代表所生成氧亏酸的量。

②用荧光素酶-荧光素仪和ATP光密度计测定的1*10^-15g菌体中的ATP含量。

由表1可知，嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)ATCC8317细胞内谷氨酸激酶的活性和ATP含量比之直接发酵法生产谷氨酰胺的菌种黄色短杆菌毫不逊色。

基于上述理由，本发明建立了一种直接以L-谷氨酸为底物，通过嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)全细胞酶转化，直接生物合成L-谷氨酰胺的方法。本发明的技术优势体现在：

第一，本发明所用的嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)具有嗜热的特点，在菌体培养过程温度可达45℃～50℃，在此温度下大部分细菌都难以生长，这大大降低了发酵过程染菌的几率，从而大大降低了生产成本。

第二，本发明所用的嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)细胞内谷氨酸激酶的活性和ATP含量比直接发酵法生产谷氨酰胺的菌种黄色短杆菌高，具体见表1。在L-谷氨酰胺的合成代谢上，本发明比直接发酵法所能积累的L-谷氨酰胺产量更高，生产周期更短，底物的转化率更高，生产成本更低，具体见表2。

表2：

项目直接发酵法本发明菌种黄色短杆菌嗜热乳杆菌底物葡萄糖L-谷氨酸底物转化率30％～35％95％～98％生产周期40h～50h18～20h

综上所述，本发明方法生产周期短，原料成本和设备成本低廉，生产效率很高，产物积累浓度高，最终L-谷氨酰胺的产物积累浓度可达150g/L，对L-谷氨酸的分子转化率可达80％，具有极高的经济价值，产业化应用前景十分广阔。

具体实施方式

1.嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)细胞的制备和收集破碎：

挑选1环斜面保存的嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)菌株，加入到体积100mL种子培养基中，在45℃～50℃，100～150r/min往复式摇床培养15～24h后得到一级种子液；再将一级种子液以5～15％的接种量接种发酵罐。发酵培养结束后将发酵液在4000～7000r/min，4℃下离心10～20分钟得到嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)湿菌体。

将湿菌体采用超声波破碎，超声波工作频率20～25KHz，功率为500W～800W，间歇时间为30s～35s，破碎时间为10～15min。

上述摇瓶种子培养基和发酵培养基由以下组分组成：

酪朊水解物10g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏5g/L，葡萄糖20g/L，柠檬酸二铵2g/L，吐温801.0mL/L，KH₂PO₄6g/L,MgSO₄·7H₂O 0.58g/L，MnSO4·4H₂O0.15g/L，FeSO₄·7H₂O 0.03g/L，L-谷氨酸钠25g/L。

发酵罐培养制备嗜热乳杆菌的发酵工艺条件为：发酵液接种量为5％～15％，pH值为5.5～6.5，培养温度为40℃～45℃，通气量为0.2～1.5(v/v·min)，搅拌转速为100～200r/min，发酵时间为15～24h。

2.以嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)全细胞为酶，以L-谷氨酸为反应的底物，生物转化法生产L-谷氨酰胺：

配制质量百分比浓度为15％～20％的L-谷氨酸水溶液，然后加入L-谷氨酸质量30％～40％的硫酸铵，用碱调节pH值为5.8～6.0，再加入过程1中所得的湿菌体破碎液，加入量为L-谷氨酸质量的10％～15％，然后在温度45℃～50℃，搅拌转速200～300r/min的转化条件下开始生物转化。

3.转化过程中流加氨水：

生物转化反应开始5h后，根据pH值的变化情况流加一定量的氨水，使反应体系的pH值保持在5.8～6.0。

4.生物转化体系的终止

当转化体系连续3小时pH值的变化小于0.1，即连续3小时氨水流加量为0时，全细胞转化反应终止，将反应液加热煮沸后备用，留待产物提取。

5.L-谷氨酰胺的提取纯化，包括以下四个步骤：

⑴收集终止反应后的反应液，将反应液离心去除菌体，离心机转速为6000～8000转/min，离心时间为10～15min；

⑵将经过步骤⑴离心后的清夜真空减压浓缩，真空度为0.1MPa，温度为40～50min；

⑶把经过步骤⑵的浓缩液调节pH至L-谷氨酰胺的等电点5.65左右(pH为5.4～5.7)，进结晶锅结晶，结晶温度为4℃；

⑷把经过步骤⑶的晶体母液混合料通过离心进行母液分离，离心机转速为3000～4000转/min，离心时间为5～10min；

⑸把经过步骤⑷的L-谷氨酰胺晶体真空干燥，干燥真空度为0.1MPa，干燥温度为50～60℃，干燥后的L-谷氨酰胺成品为白色粉末状，纯度98.5％以上。