密码子优化的严重发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白基因及其核酸疫苗

摘要

本发明属于生物医药技术领域，涉及密码子优化的严重发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白基因及其核酸疫苗。该密码子优化基因序列兼顾了哺乳动物细胞密码子使用偏好，序列如SEQ ID NO.2所示。所涉及的严重发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白核酸疫苗由密码子优化的严重发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白基因序列和真核表达载体pJW4303组成，其5’端连接tPA信号肽序列。该核酸疫苗在免疫哺乳动物后有效地刺激了免疫系统，产生了较好的体液免疫反应。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及密码子优化及携带tPA信号肽的严重发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白基因序列及其核酸疫苗。

背景技术

严重发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)是一种最近在我国首先发现的属于布尼亚病毒科白蛉病毒属的新的病毒，临床上可引起严重发热伴血小板减少综合征(Severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)。到目前为止，在湖北、河南、江苏、辽宁、山东、安徽等多个省份均有该病例报道。严重发热伴血小板减少综合征临床表现以发热、血小板减少、白细胞减少为主，不易与其他发热和出血性疾病相鉴别，病死率可高达30％，且已有多篇关于SFTSV人-人传播、聚集性发病的文献报道。因此，进一步研究该病毒致病机制并寻找合适的诊断用抗体、中和保护性抗体已经迫在眉睫。

现有研究揭示SFTSV的基因组由大、中、小3个单股负链RNA片段组成。其中，小片段含两个方向相反的读码框，分别编码核蛋白(NP)和非结构蛋白(NSs)。当前的研究结果显示，一方面，该病毒入侵机体后能诱发宿主强烈的细胞因子风暴，且与疾病的严重程度相关；另外一方面，中国疾病预防与控制中心等研究发现SFTS患者血清中的抗体主要针对的是核蛋白，由此推测核蛋白暴露于病毒表面且其量丰富、免疫原性强，介导免疫损伤。基于此，我们以核蛋白为靶抗原，构建其重组质粒进行核酸免疫，初步观察核蛋白的免疫原性及体液免疫应答特点。

核酸疫苗(nucleic vaccine)，又名基因疫苗(gene vaccine)或DNA疫苗(DNA vaccine)，其本质是含有抗原基因的真核表达载体被导入动物机体后为动物细胞所摄取并表达相应的抗原蛋白，从而诱导机体对该蛋白的免疫反应。它具有如下优点：能够充分模拟自然感染状态，在真核细胞内合成具有相应空间构象的蛋白，不仅可以激发机体产生体液免疫反应还能够诱导产生特异性CD8+细胞毒性淋巴细胞(CTL)的免疫反应；与重组的病毒活载体疫苗除了表达目的基因外还有其自身的许多蛋白要表达相比，核酸疫苗只有载体上的抗原基因在细胞内得到表达，载体本身没有免疫原性，不会刺激机体产生抗体，能更好的保证抗原蛋白的纯度；核酸疫苗能够避免直接接触危险性较高的病原体，并且可在DNA水平对密码子进行优化、修饰，使其能够更高效地表达、更有效地刺激机体的免疫系统；而且核酸疫苗成本低廉，稳定性好，适于大规模生产、运输、保 存等。但核酸疫苗也存在着诸多缺点，其中最主要的是核酸疫苗研究和应用的对象主要为真核生物，而目的基因绝大多数来自于病毒或细菌等原核生物，而原核生物与真核生物在密码子使用偏好上存在明显差异，这就导致了核酸疫苗的外源基因在真核细胞内不能高效地表达，不能有效地刺激机体的免疫系统产生应答。

发明内容

本发明的目的在于克服上述缺陷，提供一种密码子优化的SFTSV核蛋白基因序列。

本发明的另一目的是提供一种在优化基础上携带tPA信号肽的SFTSV核蛋白核酸疫苗。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种密码子优化的SFTSV核蛋白基因序列，序列为SEQ ID NO.2。原始SFTSV核蛋白基因序列，序列为SEQ ID NO.1。

SEQ ID NO.2所示的密码子优化的严重发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白基因序列在制备预防或治疗严重发热伴血小板减少综合征的药物中的应用。

一种SFTSV核蛋白核酸疫苗，由SEQ ID NO.2所示的SFTSV核蛋白基因序列插入到真核表达载体所得。

其中，所述的真核表达载体为真核表达载体为pJW4303。

其特征在于所述的SFTSV核蛋白核酸疫苗优选将SEQ ID NO.2所示的SFTSV核蛋白基因序列插入到真核表达载体pJW4303的Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切位点之间所得。

所述的SFTSV核蛋白核酸疫苗优选将SEQ ID NO.2所示的SFTSV核蛋白基因序列插入到真核表达载体pJW4303的Nh eⅠ和BamH Ⅰ酶切位点之间所得，其5’端连接tPA信号肽序列。

本发明提供的密码子优化的SFTSV核蛋白基因序列及其核酸疫苗的构建步骤如下：

(1)原始序列的SFTSV核蛋白基因序列核酸疫苗的构建

以HB29株为参考序列(GenBank:HM745932.1)，选取其核蛋白编码基因N，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并装入载体pUC57，构成pUC57-N。用Hind III和Bgl II双酶切pUC57-N，并用DNA凝胶回收试剂盒(Omega Agarose Gel DNA Purification Kit，美国Omega公司)回收纯化目的片段，用于核酸疫苗的构建。

(2)密码子优化的SFTSV核蛋白基因序列的设计和合成

以HB29株为参考序列(GenBank:HM745932.1)，首先选取SFTSV核蛋白基因，全长738bp， 然后运用软件OptimumGene^TM分析其基因序列，找出其密码子使用偏好同时找出与哺乳动物密码子使用偏好不同的密码子位点，用哺乳动物偏好的密码子替代SFTSV核蛋白基因中使用偏好不同的密码子，然后设计出密码子优化的SFTSV核蛋白基因序列，并由南京金斯瑞生物科技有限公司化学合成得到该基因。密码子优化的基因序列所编码的蛋白质氨基酸序列与原有的氨基酸序列保持一致。密码子优化后的SFTSV核蛋白基因序列为SEQ ID NO.2，优化前的序列为SEQ ID NO.1。

(3)对南京金斯瑞生物科技有限公司提供的含有目标序列的重组载体pUC57-NP-opt用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切，用DNA凝胶回收试剂盒(Omega Agarose Gel DNA Purification Kit，美国Omega公司)回收纯化目的片段，该片段为密码子优化的SFTSV核蛋白基因序列，两端分别连接有Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切位点的基因序列，以便于核酸疫苗的构建。

(4)对南京金斯瑞生物科技有限公司提供的含有目标序列的重组载体pUC57-NP-opt，设计引物tPA-N-opt-F：GTCACTTCGCTAGCTCCGAGTGGAGTAGAATCGC；tPA-N-opt-R：CGCGGATCCTCATTACAGGTTCCGATAAGCG。分别引入酶切位点Nhe I和BamH I，PCR扩增密码子优化后的SFTSV核蛋白基因序列，扩增产物用Nhe I和BamH I双酶切，并用DNA凝胶回收试剂盒(Omega Agarose Gel DNA Purification Kit，美国Omega公司)回收纯化目的片段，该片段为密码子优化的SFTSV核蛋白基因，两端分别连接有Nhe I和BamH I酶切位点，以便于核酸疫苗的构建。

(5)将步骤(1)得到的基因片段克隆到真核表达载体pJW4303中，得到重组质粒pJW4303-N。将步骤(3)得到的基因片段克隆到真核表达载体pJW4303中，得到重组质粒pJW4303-N-opt。将步骤(4)得到的基因片段克隆到真核表达载体pJW4303中，得到重组质粒pJW4303-tPA-N-opt。经对重组质粒抽提、酶切、测序后，确定得到了与预期相符的质粒，即为本发明所述的SFTSV核蛋白核酸疫苗。

本发明的有益效果：

与野生型基因相比，密码子优化的SFTSV核蛋白基因序列中哺乳动物细胞偏好的密码子出现频率增加，但是其编码的SFTSV核蛋白氨基酸序列不变，从而使其更适于在哺乳动物细胞中的蛋白表达，更有利于刺激机体产生免疫应答。

由于目前对基因序列的密码子优化尚没有统一的标准或原则，因此不同的研究人员完全会设计出不同的核苷酸序列用于目标蛋白质的表达，相应地表达效率也可能存在明显差异。根据我们优化的核苷酸编码序列，克服了上述缺陷，提高了SFTSV核蛋白表达水平；将该优化后的基因用于构建核酸疫苗，在免疫哺乳动物后更有效地刺激了免疫系统，产生了较好的体液免疫应答。同时，在密码子优化的基础上，将该序列与真核表达载体pJW4303的组织纤溶酶原激活物(tPA)信 号肽相连接，更有效地促进蛋白的分泌和提高目的蛋白诱导抗体产生的能力。

发明人将经过密码子优化的SFTSV核蛋白基因直接克隆入真核表达载体，构建了SFTSV核酸疫苗pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt，这两种疫苗能够在真核细胞293T细胞中有效表达，免疫动物能刺激产生特异性抗体；而pJW4303-tPA-N-opt与pJW4303-N-opt相比，引入tPA信号肽的pJW4303-tPA-N-opt能更有效地分泌及刺激机体产生特异性抗体。由此可见，pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt核酸疫苗具有良好的免疫原性。

附图说明

图1野生型和密码子优化的SFTSV核蛋白基因序列的密码子优化结果比较

其中，图A和B为密码子适应指数CAI(A)和优化密码子使用频率(B)，两幅小图中左侧的图为优化后的密码子适应指数(A)和优化密码子使用频率(B)，右侧图为未经优化的野生型基因的密码子适应指数(A)和优化密码子使用频率(B)，提示密码子优化后SFTSV核蛋白基因序列编码区同义密码子与哺乳动物细胞中密码子最佳使用的符合程度及所使用的最优密码子比例明显提高；图C为GC含量的调整，提示经密码子优化后的SFTSV核蛋白基因序列中碱基组分未见明显变化，保证了基因合成过程中均匀的退火温度，保证了动物体内mRNA的表达水平；图D为限制性内切酶及顺式作用元件的优化，提示原本会影响质粒构建的限制性内切酶基因序列通过密码子优化有效清除；图E为重复序列的优化，提示密码子优化后的基因序列不能形成茎环结构，从而保证了核糖体与核苷酸序列的有效结合及mRNA的稳定。

图2重组质粒pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt的酶切电泳图谱

1泳道，1Kb DNA ladder；2泳道，100bp DNA ladder；3泳道，质粒pJW4303-N经Hind Ⅲ单酶切；4泳道，质粒pJW4303-N-opt经HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切电泳图；5泳道，质粒pJW4303-N-opt经Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切电泳图。

图3pJW4303、pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt转染293T细胞后目的蛋白表达的Western blot分析结果

1：pJW4303转染上清液；2：pJW4303转染裂解液；3：pJW4303-N转染上清液；4：pJW4303-N转染裂解液；5：pJW4303-N-opt转染上清液；6：pJW4303-N-opt转染裂解液；7：pJW4303-tPA-N-opt 转染上清液；8：pJW4303-tPA-N-opt转染裂解液；目的蛋白表观分子量为28kD；内参β-actin为43kD。抗原为pJW4303空载体、pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt转染293T细胞的培养上清液或者裂解液，所用一抗为免疫BALB/c小鼠血清，稀释度为1:300。

图4pJW4303、pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt免疫BALB/c小鼠后IgG抗体应答时间曲线

pJW4303表示空载体pJW4303免疫BALB/c小鼠后的特异性IgG抗体时间曲线，共7只；

pJW4303-N表示pJW4303-N免疫BALB/c小鼠后的特异性IgG抗体时间曲线，共7只；

pJW4303-N-opt表示pJW4303-N-opt免疫BALB/c小鼠后的特异性IgG抗体时间曲线，共7只；

pJW4303-tPA-N-opt表示pJW4303-tPA-N-opt免疫BALB/c小鼠后的特异性IgG抗体时间曲线，共7只。

图5pJW4303、pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt免疫BALB/c小鼠后特异性IgG抗体最高滴度 

pJW4303表示空载体pJW4303免疫BALB/c小鼠后的特异性IgG抗体最高滴度，共7只；

pJW4303-N表示pJW4303-N免疫BALB/c小鼠后的特异性IgG抗体最高滴度，共7只；

pJW4303-N-opt表示pJW4303-N-opt免疫BALB/c小鼠后的特异性IgG抗体最高滴度，共7只；

pJW4303-tPA-N-opt表示pJW4303-tPA-N-opt免疫BALB/c小鼠后的特异性IgG抗体最高滴度，共7只。

具体实施方式

实施例1密码子优化的SFTSV核蛋白基因序列的设计与合成

首先用软件OptimumGene^TM分析编码SFTSV核蛋白基因序列SEQ ID NO.1，找出其密码子使用偏好以及与哺乳动物使用偏好不同的位点。对于使用偏好不同的密码子位点，用哺乳动物细胞偏好的密码子替代，设计出密码子优化的SFTSV核蛋白基因序列SEQ ID NO.2。上述密码子优化的基因序列所编码的蛋白质氨基酸序列与其原有的氨基酸序列SEQ ID NO.3一致。将上述密码子优化的基因序列交南京金斯瑞生物科技有限公司合成，装入载体pUC57，构建成重组质粒pUC57-N-opt。经测序证实合成的序列正确。

为了明确显示进行密码子优化的位点，现将密码子优化后的核酸序列N-opt与密码子优化前 的核酸序列N进行对比。比较结果如下(*为终止密码子)：

上述密码子优化的SFTSV核蛋白基因序列与野生型序列比较密码子偏好性发生了改变。从图1中由软件OptimumGene^TM模拟出的结果可以看出，与野生型基因(未经密码子优化)相比，密码子优化的基因中哺乳动物细胞偏好的密码子出现频率增加，但是它们所编码的氨基酸序列不变，从而使其更适于在哺乳动物细胞中的蛋白表达。

实施例2真核表达载体pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt的构建

(1)目的片段和载体的获得

1)N片段、质粒pJW4303线性大片段的获得：N片段由南京金斯瑞生物科技有限公司提供的pUC57-N用Hind III和Bgl II双酶切获得。并用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切载体质粒pJW4303。酶切反应体系为：10×Buffer Tango^TM 4μl，质粒pJW4303或PCR产物10μl，HindⅢ1.5μl，BamH I或Bgl II 1.5μl，补水至40μl，37℃，2h。

2)N-opt片段、质粒pJW4303线性大片段的获得：分别用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切南京金斯瑞生物科技有限公司提供的含有目标序列的重组载体pUC57-NP-opt和载体质粒pJW4303，酶切反应体系同1)。

3)tPA-N-opt片段、质粒pJW4303线性大片段的获得：用引物tPA-N-opt-F(GTCACTTCGCTAGCTCCGAGTGGAGTAGAATCGC(SEQ ID NO.4))和tPA-N-opt-R(CGCGGATCCTCATTACAGGTTCCGATAAGCG(SEQ ID NO.5))PCR扩增南京金斯瑞生物科技有限公司提供的含有目标序列的重组载体pUC57-NP-opt，扩增产物为含有Nhe I和BamH I酶切位点的密码子优化后的SFTSV核蛋白基因序列，扩增产物和载体质粒pJW4303用Nhe I和BamH I双酶切，酶切反应体系同1)。

(2)酶切产物纯化：上述酶切产物经10g/L的琼脂糖凝胶电泳后，置于紫外检测仪下，按照凝胶回收试剂盒(Omega Agarose Gel DNA Purification Kit，美国Omega公司)说明书，切下含目的片段的凝胶，分析天平称胶块的质量，按1mg＝1μl计算胶块的体积。加入至少1倍体积的Binding Buffer，置于75℃水浴中加热融化胶块，间断振荡混合，直至胶块完全融化。将离心吸附柱安置在收集管上，转移冷却的DNA-琼脂糖溶液至HiBind DNA吸附柱中，12000rpm，离心1min， 弃滤出液。加入700μl SPW Wash Buffer液，12000rpm，离心30s，弃滤出液。重复加入700μl SPW Wash Buffer液，12000rpm，离心30s，弃滤出液。将空柱子重新套回收集管中，10000rpm离心1min以甩干柱基质残余。将吸附柱安置在新的Ep管上，在吸附柱的膜中央滴加25μl灭菌蒸馏水，静置60s，12000rpm，离心1min，此时Ep管中的洗脱液即为目的DNA溶液。测定DNA溶液的浓度，用10g/L琼脂糖凝胶电泳分析割胶纯化效果，洗脱液保存在-20℃冰箱中备用。

(3)连接反应：用T4DNA连接酶将目的片段N、N-opt、tPA-N-opt和各自线性化质粒pJW4303大片段连接，得到pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt重组表达质粒，即为本发明所提供的SFTSV核蛋白的核酸疫苗。其中重组表达质粒pJW4303-N-opt中优化后的目标序列位于真核表达载体pJW4303的Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切位点之间。重组表达质粒pJW4303-tPA-N-opt中优化后的目标序列位于真核表达载体pJW4303的Nhe I和BamH I之间，优化后的目标质粒的5’端连接真核表达载体pJW4303的tPA信号肽序列。连接反应体系为：10×T4DNA Ligase Buffer 1μl，线性化的pJW4303 1μl，纯化的N目的片段7μl，T4DNA Ligase 1μl，混匀，15℃放置16h。连接物转化HB101感受态细胞。

实施例3重组质粒pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt的鉴定

3.1pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt转化大肠杆菌HB101感受态细胞 

1)分别将10μl连接物加入到装有100μl HB101感受态细胞的Ep管中，轻轻拍动管壁数次，充分混匀，冰浴30min。

2)将Ep管置于42℃水浴中90s。

3)向Ep管中缓慢加入LB培养基0.5mL，37℃，80rpm，振摇45min。

4)将菌液涂布在含氨苄青霉素(0.1g/L)的LB平板上，37℃，培养过夜。

3.2筛选阳性克隆 

随机挑取单菌落，接种于培养试管(含0.1g/L氨苄青霉素的LB培养基)中，37℃，200rpm振摇，培养过夜。

3.3小量提取重组质粒pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt(质粒小量提取试剂盒为QIAGEN Plasmid Mini Kit，德国QIAGEN公司)

1)将3.2中培养过夜的细菌在无菌超净台中缓慢吸到1.5ml离心管中，培养试管中剩下少量菌液保存于4℃。

2)菌体收集：离心管中菌液，常温下13000rpm离心1min，弃上清。

3)悬浮菌体：加入250μl buffer P1充分悬浮细菌沉淀。

4)碱变性：加入250μl buffer P2，温和颠倒5-6次，形成透明溶液。

5)复性：加入400μl 4℃预冷的buffer N3，温和颠倒5-6次，然后室温静置2min。

6)离心将质粒与蛋白和基因组核酸分离：室温13000rpm，离心10min。

7)质粒DNA的吸附：Spin Column安置于Collection Tube上，将步骤7中上清液加入到Spin Column中，13000rpm离心1min，弃滤液。

8)充分去除蛋白：将500μl buffer PB加入Spin Column中，13000rpm离心30s，弃滤液。

9)洗涤：将700μl wash buffer加入Spin Column中，13000rpm离心30s，弃滤液。

10)重复洗涤一次：重复步骤10。

11)将Spin Column安置在1.5ml Ep上，在膜中央滴加50μl的灭菌蒸馏水，室温静置1min。

12)13000rpm离心1min，洗脱液即为含有质粒的溶液。

3.4酶切鉴定质粒pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt

质粒pJW4303-N用HindⅢ单酶切，质粒pJW4303-N-opt用HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切，质粒pJW4303-tPA-N-opt用Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切。酶切反应体系(10μl)：10×Buffer Tango^TM 1μl，重组质粒2μl，HindⅢ或Nhe Ⅰ或0.25μl，和(或)BamH Ⅰ0.25μl，补水至10μl。37℃孵育2h。加入1μl 10×Loading buffer终止酶切反应。10g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果，酶切后电泳图谱见图2。将酶切鉴定正确的细菌送上海生工生物工程公司测序，测序正确细菌划三次平板，挑取单克隆细菌保存。

实施例4质粒pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt大量制备(质粒大提试剂盒为QIAGEN Plasmid Mega Kit(5)，德国QIAGEN公司)

1)吸取鉴定正确的细菌保存液5μl接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃，200rpm，过夜生长。

2)按1:500将1)中培养菌液接种于1000ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃，200rpm，过夜生长。

3)第二天将细菌移到250ml离心瓶中，4℃，6000g离心15min，弃上清，收集细菌。

4)加入50ml缓冲液P1，反复振摇，使细菌全部重悬于溶液中。

5)加入50ml缓冲液P2，温和颠倒5-6次，溶液呈均匀蓝色，静置5min。

6)加入50ml缓冲液P3，温和颠倒5-6次，蓝色溶液消失，溶液分层，上层为结实的乳白色团块，下层为清亮液体，冰上放置30min。

7)4℃，21000g，离心30min，

8)将上清转移至另一离心瓶，4℃，21000g，离心15min。

9)在吸附柱中加入QBT缓冲液35ml平衡吸附柱。 

10)将步骤8中得到的上清加到吸附柱内，滤过，弃滤液。

11)加入洗涤缓冲液QC 200ml，过柱，弃滤液。

12)加入洗脱缓冲液QF 35ml，过柱，收集滤液。

13)向收集液体中加入24.5ml异丙醇，4℃，16000g，离心30min，弃上清。 

14)加入7ml 70％乙醇，常温16000g离心10min，弃上清。 

15)将有沉淀的Ep管于超净台自然晾干，然后用1ml生理盐水溶解质粒团块。

16)紫外分光光度法测定抽提所得溶液中的质粒浓度及260/280比值。

实施例5细胞转染

293T细胞用含100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素及10％胎牛血清的DMEM高糖培养基在37℃，5﹪CO₂饱和湿度培养箱内培养至对数生长期，用2.5g/L胰酶消化后，以5.0×10⁶个细胞(6mL)接种于10cm培养皿中，待生长至80％融合时，依据PEI转染法进行细胞转染。分别取PEI 75μl，分别取pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt 15μg，分别加含100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的DMEM高糖培养基至825μl，充分混匀，室温孵育15min，然后将上述混合液分别加到培养皿中并轻轻摇动使混合均匀，同时以pJW4303空质粒转染293T细胞作为阴性对照。6-8h后更换不含血清含100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的DMEM培养液。继续培养72h后收获培养上清及细胞裂解液，进行Western blot分析。

其中，转染细胞收获步骤为：吸取细胞上清液，2500rpm，室温，离心10min，吸取上清-20℃冻存。用PBS(浓度10mM，pH7.2)将细胞从培养皿中洗脱，收集细胞悬液，2500rpm，室温，离心10min，弃上清，加入裂解液(50mM Tris-HCl PH7.6，150mM NaCl，1％Triton，临用前加入2％100mM PMSF(苯甲基磺酰氟))，冰上孵育15min，12000rpm，4℃，离心60min，收集上清液，-20℃冻存。

实施例6Western blot检测pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt的体外表达

1)pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt转染293T细胞裂解及上清和载体pJW4303转染293T细胞裂解及上清各30μl，加入5x上样缓冲液5μl，100℃，煮沸10min。

2)制备15％的分离胶(7.5ml 30％丙烯酰胺溶液，3.7ml 1MTris/Cl pH8.8，150μl 10％SDS，150μl 10％过硫酸氨，6μl TEMED)，灌胶，液面顶端加水，室温下聚合20～30min。

3)倒弃水，再制备5％的积层胶(960μl 30％丙烯酰胺溶液，740μl 1MTris/Cl PH6.8，60μl10％SDS，60μl 10％过硫酸氨，5μl TEMED)，在积层胶上插入梳齿，待胶完全凝聚后，拔下梳齿。

4)将上述处理好的样品加入胶孔中进行电泳，先25mA，40min，然后45mA，1h。

5)100V，1h，将胶上的蛋白转到PVDF膜上。

6)转好的膜用5％脱脂奶粉封闭，37℃，1h。

7)用1×PBST洗膜两次。

8)将膜浸在1:300稀释的小鼠血清(一抗)中，4℃，过夜。 

9)弃掉血清，用1×PBST洗膜6次，每次间隔10min。

10)弃掉洗液，加入1:10000稀释HPR标记的羊抗鼠IgG(二抗)，37℃，1h。

11)弃掉二抗，用1×PBST洗膜6次，每次间隔10min。

12)发光剂加到膜上，Bio-RAD凝胶成像系统显影。

分析结果如图3所示。图3中显示pJW4303-N、pJW4303-N-opt转染293T细胞后上清液中未检出特异性蛋白表达，细胞裂解液中特异性蛋白表达良好；pJW4303-tPA-N-opt转染293T细胞后上清液和裂解液中均可见良好表达特异性蛋白，其表观分子量约为28kDa；内参β-actin为43kD。阴性对照空载体pJW4303转染293T细胞的上清液及裂解液均未检出特异性蛋白的存在。Western blot分析表明，pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt核酸疫苗可以在293T细胞内表达相应的蛋白，引入tPA信号肽之后，目的蛋白表达及分泌量明显提高。

实施例7密码子优化的重组核酸疫苗免疫原性的研究

在核酸疫苗构建和表达成功后，对实验动物进行免疫，通过ELISA方法检测其免疫原性。7.1pJW4303、pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt免疫BALB/c小鼠，实验设计如下：

表1pJW4303-N免疫BALB/c小鼠

如表1，用空载体pJW4303和pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt各免疫一组BALB/c小鼠。肌肉注射100μg相应质粒，注射后立即于注射部位用WJ-2005活体基因导入仪进行体内电转染(针头插入深度至少2mm，电转染参数：电压50V，脉冲次数正反各6次，波宽30ms，频率30Hz)，以小鼠腿部肌肉发生抖动视为电转染有效。于第0、2、4、8周进行DNA免疫，于每次免疫前、第6周、末次免疫后两周采血。

7.2ELISA检测血清中SFTSV核蛋白特异性IgG

用ELISA方法检测血清中特异的IgG抗体反应，评价pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt核酸疫苗在BALB/c小鼠模型中诱导产生体液免疫的能力。

1)以pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt转染上清作为抗原包被ELISA板(使用PBS pH7.2-7.4作为包被稀释液，转染上清1:5稀释)，每孔100μl，4℃，过夜。

2)弃包被液，用1×PBST洗板5次(PBST构成为10mMPBS和0.05％Tween-20)。

3)5％脱脂奶粉(PBS，0.05％Tween-20，5％脱脂奶粉)37℃，封闭1h，每孔200μl。

4)弃封闭液，用1×PBST洗板5次。

5)一抗为待检测血清，稀释度为1:200。每孔加入100μl，37℃，孵育1h(一抗稀释液：4％乳清蛋白，0.5％Tween-20，PBS)。

6)弃一抗，用1×PBST洗板5次。

7)二抗为链亲和素标记的羊抗鼠IgG，稀释度为1:5000，每孔加入100μl，37℃，孵育1h(二抗稀释液：4％乳清蛋白，0.5％Tween-20，PBS)。

8)弃二抗，用1×PBST洗板5次。

9)HRP标记的抗链亲和素抗体，稀释度1：4000，每孔加入100μl，37℃，孵育1h(抗体稀释液：4％乳清蛋白，0.5％Tween-20，PBS)。

10)弃HRP标记的抗链亲和素抗体，用1×PBST洗板5次。

11)TMB显色(TMB溶液配方：TMB片剂1片，0.1M磷酸枸橼酸缓冲液(pH值为5.0)5ml，双蒸水5ml，30％双氧水2μl)，每孔加入100μl，室温，3.5min，每孔加入50μl 1M的H₂SO₄终止显色。

12)酶标仪测定并记录各孔A450值，计算复孔平均值，以免疫前血清OD值的2.1倍作为cut-off值，而且免疫后孔OD值小于0.05去除。

BALB/c小鼠血清SFTSV核蛋白特异性IgG抗体应答时间曲线如图4所示。在pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt重组质粒免疫后，所有(7只BALB/c小鼠)免疫血清中均可检测到特异性IgG，且随着免疫次数的增加，免疫应答强度逐渐提高。和预期的一样，所有7只pJW4303 空载体免疫BALB/c小鼠的血清中未检测到特异的抗体应答。

BALB/c小鼠血清SFTSV核蛋白特异性IgG抗体最高滴度比较如图5所示。图中显示第四次免疫后2周的BALB/c血清中，pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt免疫组均有较高滴度的特异性抗体，而pJW4303空载体免疫组则未检测到抗体应答。pJW4303-tPA-N-opt组与pJW4303-N-opt组、pJW4303-N组和pJW4303组比较具有统计学差异(p<0.05)。pJW4303-N-opt组、pJW4303-N组和pJW4303组比较具有统计学差异(p<0.05)，而pJW4303-N-opt组和pJW4303-N组间比较无统计学差异(p>0.05)。

本发明未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现。

实施例中所涉及的试剂信息如下表：