与宫颈癌发生相关的HPV整合的基因位点及其应用

摘要

本发明涉及与宫颈癌发生相关的HPV整合的基因位点及利用与宫颈癌发生相关的HPV整合的基因位点制备的试剂盒。通过提取受试者宫颈组织DNA，首先用高通量病毒捕获测序，然后用PCR Sanger测序验证，检测受试者宫颈组织DNA中HPV整合基因位点中的任意一个或几个位点，并计算整合频率，来进行宫颈癌高危人群的检测。基于上述位点制备的检测宫颈癌高危人群的试剂盒具有检测结果准确、灵敏度高等特点。

说明书

技术领域

本发明涉及妇科肿瘤学和分子遗传学领域，具体地说，本发明涉及与宫颈癌发生相关的HPV整合的基因位点，以及这些HPV整合的基因位点在检测宫颈癌高危人群试剂盒中的应用。

背景技术

宫颈癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤之一，在世界范围内的死亡率占女性恶性肿瘤疾病的第三位。世界上每年大约有50万的新发宫颈癌患者，同时每年有26.8万人死于宫颈癌。宫颈癌的发病率和地区发达程度有很强的关联性，将近86％的宫颈癌病例和88％的死亡病例发生在欠发达地区(Arbyn M等，Ann Oncol，2011；22：2675-2683)。全球范围内宫颈癌已造成约780万的寿命损失年数(David Formana等，Vaccine，2012；30S：F12-F23)。在中国宫颈癌的发病率和死亡率也均高居世界第二，仅在2010年，就有76,884例新发宫颈癌和21,626例死亡。目前，宫颈癌的发病率在某些地区出现上升趋势，且患者趋于年轻化。随着社会经济的日益发展，宫颈癌这一危害广大妇女的恶性疾病越来越受到社会各界的关注。

对于宫颈癌的发病机制的研究一直是学界的热点之一。宫颈癌作为一种恶性肿瘤，其发病机制相对复杂，除了高危型人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)的持续感染外，还有宿主细胞基因组改变等其他因素。随着细胞遗传学和分子生物学的深入研究，人们逐渐发现高危型HPV感染者并非都发生了宫颈癌，HPV与宿主染色体的整合才是宫颈细胞永生化过程中的重要步骤(Wheeler CM，Obstet Gynecol ClinNorth Am，2013；40：165-176)。高危型HPV感染细胞后，在整合的病毒中HPV基因组的易变部分缺失，并整合入宿主基因组DNA，断裂点常在E1、E2基因开放读码框(ORF)处，其中以发生在E2基因的“铰链区”最多(Choo KB等，Virology，1987；161：259-261)。E2基因的缺失，能抑制整合病毒启动子所调控的转录，同时也可导致E6和E7基因表达失控，提高了E6和E7的过表达和稳定性(Parish JL等，J Virol，2006；80：4580-4590)，而E6、E7两种癌蛋白能分别结合和破坏p53、pRb等细胞周期调节关键蛋白并干扰其作用(zur Hausen H，J Natl Cancer Inst，2000；92：690-698)，导致细胞的恶性转化或癌变能力增强。因此，宫颈癌HPV整合的研究是阐明宫颈癌发病机制的重要线索。

HPV整合在细胞染色体的位置不尽相同。研究发现HPV DNA整合入宿主细胞基因的位点有一定的倾向性，比如常整合在染色体的脆性位点(common fragile sites，CFSs)、原癌基因和染色体突变点附近等(Wentzensen N等，Cancer Res，2004；64：3878-3884)。这些倾向于高频发生的整合位点可能在宫颈癌发生过程中促进细胞获得选择性生长优势。阐明HPV的高频整合位点对于揭示宫颈癌发生的机制、鉴别诊断宫颈癌高位人群有重要的意义。

既往发展的HPV整合位点的检测方法有整合HPV病毒致癌基因转录子的扩增(Klaes R等，Cancer Res，1999；59：6132-6136)、Southern杂交(Cullen AP等，JVirol，1991；65：606-612)、实时定量PCR(Peitsaro P等，J Clin Microbiol，2002；40：886-891)、限制性酶切位点PCR(Thorland EC等，Cancer Res，2000；60：5916-5921)和DNA原位杂交(Evans MF等，J Pathol，2004；202：1-4)。虽然这些方法都能对HPV整合位点进行检测，但均存在敏感度低、操作繁琐、耗时、需大量的样品、对结果判断不确定等缺点。

最近新开发的高通量病毒整合检测技术是一种新的实验化和计算机化的方法，它能利用捕获测序在单一碱基对分辨率下有效的进行病毒基因整合检测。它利用HPV探针捕获宿主基因中的病毒插入片段，并把这些片段在测序平台进行进一步测序；基于所获得的DNA序列数据，用片段拼接策略定位整合位点，最后用PCR Sanger测序对检测出的整合位点进行验证(W.Li，Genomics，2013；102：338-344)。这种技术具有高特异性和敏感性，是确定人类基因组中的病毒整合的具有很好成本效益的方法(W.Li，Genomics，2013；102：338-344)。

目前，对于宫颈癌高危人群的检测方法及产品主要是针对HPV本身进行检测，即检测样本中是否存在HPV，但实际上并非所有的高危型HPV感染者都发生了宫颈癌，因此，此类对于宫颈癌高危人群的检测方法及产品具有检测结果不准确、灵敏度低等缺陷。而尚未有针对HPV的整合位点来检测宫颈癌高危人群的方法及产品，这主要是因为，检测是否有HPV的整合需要同时检测HPV的序列和宿主人基因组的序列，并且这两条序列形成了融合序列。现有检测HPV整合的技术如DIPS-PCR(Luft F等，Int J Cancer，2001，92(1)：9-17)和APOT(Klaes R等，Cancer Res，1999，59(24)：6132-6136)技术操作繁琐、稳定性差，检测结果不准确、不全面，检测技术仅停留在实验室研究探索水平，尚无法应用于临床检测。发明利用高通量病毒整合检测和PCR Sanger测序研究揭示与宫颈癌发生相关的整合位点，具有检测方法灵敏、检测结果全面等优点。

发明内容

鉴于上述问题，本发明利用高通量病毒整合检测和PCR Sanger测序研究揭示与宫颈癌发生相关的50个HPV整合位点(POU5F1B、FHIT、KLF12、KLF5、HMGA2、LRP1B、LEPREL1、DLG2、SEMA3D、MSRB3、MAPK10、PCDH15、PLS3、PARK2、ZNF33B、FOXP2、CDH7、DMD、MACROD2、AGTR2、C9orf85、PRDM9、CADM2、MSX2、CPNE8、ROCK1、NEK11、DUSP6、EPHA6、LOC100132288、DCC、PARD3B、HS3ST4、DLG1、RALYL、IGF1、TRIM33、SLC8A1、DNAH11、CLSTN2、C9orf102、LOC728410、SORCS2、FSTL5、BDP1、FLJ37543、ZNF479、ERC2、SLC7A11、IL1RAPL1)；根据宫颈组织DNA中HPV整合至上述50个基因位点中的任意一个或几个位点，来制备检测宫颈癌高危人群的试剂盒，本发明的检测宫颈癌高危人群的试剂盒具有快速、方便、准确等优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供与宫颈癌发生相关的HPV整合的基因位点，HPV的部分或全部序列插入人基因组序列，形成整合的基因位点，所述整合的基因位点包括以下任意一个或几个基因的任意序列，所述基因包括：POU5F1B、FHIT、KLF12、KLF5、HMGA2、LRP1B、LEPREL1、DLG2、SEMA3D、MSRB3、MAPK10、PCDH15、PLS3、PARK2、ZNF33B、FOXP2、CDH7、DMD、MACROD2、AGTR2、C9orf85、PRDM9、CADM2、MSX2、CPNE8、ROCK1、NEK11、DUSP6、EPHA6、LOC100132288、DCC、PARD3B、HS3ST4、DLG1、RALYL、IGF1、TRIM33、SLC8A1、DNAH11、CLSTN2、C9orf102、LOC728410、SORCS2、FSTL5、BDP1、FLJ37543、ZNF479、ERC2、SLC7A11、IL1RAPL1。例如HPV的部分或全部序列可以分别整合到上述任意N个基因中的任意一个或几个位点中，其中N选自1至50任意一个数值。

进一步，所述HPV的部分或全部序列包括HPV16、HPV18、HPV33、HPV58的全部或部分序列。

进一步，HPV的部分或全部序列插入人基因组序列，所述人基因组序列的插入位点包括以下任意一个或几个位点：

chr8：128230632，chr3：60580190，chr13：75080260，chr12：66044325，chr13：74231438，chr2：142277627，chr3：189679114，chr11：84402641，chr7：84587024，chr12：66044686，chr4：87136569，chr10：56856238，chrX：114937892，chr6：162551151，chr10：42599645，chr7：114325898，chr18：63824312，chrX：33071182，chr20：15200988，chrX：115008129，chr9：74521711，chr5：23739233，chr3：85282358，chr5：174231749，chr12：39130515，chr18：18520045，chr3：130945456，chr12：89805199，chr3：96760090，chr21：9831305，chr18：50601053，chr2：206446164，chr16：25792328，chr3：197223493，chr8：85862571，chr12：102672730，chr1：114995675，chr2：40584069，chr7：1651378，chr3：140013931，chr9：98904388，chr4：18221，chr4：7711377，chr4：162695494，chr5：70874679，chr5：61009796，chr7：57211246，chr3：55593863，chr4：138874818，chrX：28786772。

进一步，所述HPV的部分序列包括以下任意一个或几个序列：

HPV16：18-5734，HPV16：3022-3153，HPV16：1613-1665，HPV16：3578-3667，HPV16：2911-3031，HPV16：3030-3063，HPV16：2618-2678，HPV16：718-821，HPV16：945-1015，HPV16：3596-3681，HPV16：2771-2860，HPV16：246-327，HPV16：3022-3152，HPV58：2200-2288，HPV16：212-300，HPV16：1830-1936，HPV16：1018-1107，HPV16：312-423，HPV16：727-798，HPV16：2726to2855，HPV16：3022-3151，HPV18：4457-4592，HPV16：10-84，HPV33：719-792，HPV16：1452-1602，HPV16：1613-1665，HPV16：416-510，HPV16：2640-2729，HPV16：2173-2250，HPV16：1613-1665，HPV16：175-244，HPV16：3993-3898，HPV16：1798-1874，HPV16：3158-3247，HPV16：445-354，HPV16：1613-1665，HPV16：3695-3842，HPV16：2362-2422，HPV16：1353-1287，HPV18：2932-3049，HPV16：1560-1679，HPV16：1616-1665，HPV16：1831-1913，HPV16：191-270，HPV16：4070-4126，HPV16：2366-2455，HPV16：3022-3150，HPV16：352-436，HPV16：4306-4201，HPV16：2337-2269。

以″HPV16：18-5734″为例，指整合在人基因组的HPV序列是HPV16的18到5734碱基。参考网址如下，根据编号可以找到相应的序列：

HPV16的网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_001526.2；

HPV58的网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/HQ537777.1；

HPV33的网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/HQ537688.1；

HPV18的网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY262282.1。

进一步，宫颈癌发生相关的HPV整合的基因位点包括下表所述任意一个或几个位点，

下表中第三列所示的″HPV断点″分别相应的插入第一列所示的″基因″的第二列所示的″人基因组上的断点″处，具体″基因″、″人基因组上的断点″、″HPV断点″如表1所示：

表1 HPV的基因组序列在人基因组上整合的位点

上表中以″chr8：128230632″为例，表示HPV整合在人8号染色体128230632位点。

各染色体所对应网址如下：

chr1的网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000001.10；

chr2的网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000002.11；

chr3的网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000003.11；

chr4的网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000004.11；

chr5的网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000005.9；

chr6的网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000006.11；

chr7的网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000007.13；

chr8的网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000008.10；

chr9的网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000009.11；

chr10的网址http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000010.10；

chr11的网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000011.9；

chr12的网址http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000012.11；

chr13的网址http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000013.10；

chr16的网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000016.9；

chr18的网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000018.9；

chr20的网址http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000020.10；

chr21的网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000021.8；

chrX的网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NW_004070891.1；

上述50个整合位点组合在一起，只要检测出其中至少一个，即提示检测结果阳性，说明属于宫颈癌高危人群。

与宫颈癌发生相关的整合序列，所述整合序列包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：50中的任意一个或几个，具体序列如表2所示：

表2 HPV基因组插入人基因组后形成的整合序列

本领域技术人员可以根据本发明表2中所述的整合序列，进行适当的增加、减少或改变，例如增加不同的限制性酶切位点序列、保护碱基等，减少本发明表2中所述的整合序列的长度(如删除部分碱基)，对于个别碱基进行改变；上述操作只要仍然保留了本发明表2所述的整合序列的大部分碱基，均在本发明的保护范围内。

本发明所述的整合序列指的是HPV部分或全部基因组序列融合后人染色体上得到的序列，即一部分是人基因组的序列，一部分是HPV的序列。

一种与宫颈癌发生相关的HPV整合的基因位点的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取人宫颈组织基因组DNA；本发明对于人宫颈组织基因组DNA的提取方法并无特别限制，只要保证提取的DNA样品的完整性即可，可以购买商品化的DNA提取试剂盒，也可以参照精编分子生物学实验指南第五版(F.M·奥斯伯等著)中所述的DNA提取方法或适当加以改进来提取人宫颈组织基因组DNA；

2)高通量病毒整合检测：设计含有17种亚型的HPV全长探针(HPV6，HPV 11，HPV 16，HPV 18，HPV 31，HPV 33，HPV 35，HPV 39，HPV 45，HPV 52，HPV 56，HPV 58，HPV 59，HPV 66，HPV 68，HPV 69，HPV 82，探针的序列详细内容参见http：//wenku.baidu.com/view/210563ad49649b6648d747fb。根据Illimina的要求构建DNA的测序文库，应用Covaris E-210(Covaris，Inc.，Woburn，MA)把样品基因组DNA打断为150-200碱基的小片段。然后把这些小片段纯化、末端填平、加A尾并连接接头引物。使用Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)确定DNA文库的浓度。根据MyGenostics GenCap目标富集方法进行杂交(http：//www.mygenostics.com/)。应用含有17种亚型的HPV探针，与基因组DNA文库在65℃杂交24小时，然后洗脱未杂交的DNA片段。获取的片段通过18轮PCR扩增建成测序文库。把测序文库加入HiSeq 2000测序仪进行测序；

3)高通量病毒整合检测结果分析：去除质量低、重复和接头引物污染的序列，剩余的序列同时向人基因组和HPV基因组比对，去除完全比对到人基因组或HPV基因组的序列，只保留同时部分比对人基因组和部分比对到HPV基因组的整合序列，把整合序列进行末端配对的组装确定准确的整合位点，再次比对末端配对组装后的序列，根据比对结果确定样品是否整合了HPV的部分序列，以及是否在下述基因中整合了HPV的部分序列：

所述基因包括POU5F1B、FHIT、KLF12、KLF5、HMGA2、LRP1B、LEPREL1、DLG2、SEMA3D、MSRB3、MAPK10、PCDH15、PLS3、PARK2、ZNF33B、FOXP2、CDH7、DMD、MACROD2、AGTR2、C9orf85、PRDM9、CADM2、MSX2、CPNE8、ROCK1、NEK11、DUSP6、EPHA6、LOC100132288、DCC、PARD3B、HS3ST4、DLG1、RALYL、IGF1、TRIM33、SLC8A1、DNAH11、CLSTN2、C9orf102、LOC728410、SORCS2、FSTL5、BDP1、FLJ37543、ZNF479、ERC2、SLC7A11、IL1RAPL1中任意一个或几个；进一步地，包括全部上述基因，优选的，如表1所示的整合位点；

4)利用常规PCR验证HPV与宫颈癌发生相关的HPV整合的基因位点；所述的基因位点包括：POU5F1B、FHIT、KLF12、KLF5、HMGA2、LRP1B、LEPREL1、DLG2、SEMA3D、MSRB3、MAPK10、PCDH15、PLS3、PARK2、ZNF33B、FOXP2、CDH7、DMD、MACROD2、AGTR2、C9orf85、PRDM9、CADM2、MSX2、CPNE8、ROCK1、NEK11、DUSP6、EPHA6、LOC100132288、DCC、PARD3B、HS3ST4、DLG1、RALYL、IGF1、TRIM33、SLC8A1、DNAH11、CLSTN2、C9orf102、LOC728410、SORCS2、FSTL5、BDP1、FLJ37543、ZNF479、ERC2、SLC7A11、IL1RAPL1；

5)结果分析：将步骤4)扩增的PCR产物进行测序，并与人基因组和HPV基因组进行比对，当同时比对到部分人基因组和部分HPV基因组时，说明所述基因被HPV基因组整合，在比对到的人基因组和HPV基因组的连接处即为HPV的整合位点。

为了进一步减少检测时间，本发明所述的与宫颈癌发生相关的HPV整合的基因位点，也可以不经过步骤2)和步骤3)的高通量病毒整合检测方法，直接利用步骤4)中所述的引物对宫颈组织DNA进行扩增。

进一步，利用常规PCR验证时所使用的引物包括SEQ ID NO：51至SEQ ID NO：150所示序列，其中上游下游引物设计在各自整合序列上，具体序列如表3所示：

表3 用于检测整合位点的引物

本领域技术人员可以根据本发明表3中所述的引物序列，进行适当的增加、减少或改变，例如增加不同的限制性酶切位点序列、保护碱基等，减少发明表3中所述的引物序列的长度(删除部分碱基，只保留3′的部分或全部序列)，对于个别碱基进行改变；上述操作只要不影响PCR扩增，均在本发明的保护范围内。

上述与宫颈癌发生相关的HPV整合的基因位点以及在检测过程中所使用的引物和试剂可以组装成检测宫颈癌高危人群的试剂盒中，用于宫颈癌高危人群的检测。

一种检测宫颈癌高危人群试剂盒，包括：DNA提取试剂、PCR扩增用试剂、引物；所述引物包括SEQ ID NO：51至SEQ ID NO：150所示序列中任意一个或几个，优选的，所述引物包括SEQ ID NO：51至SEQ ID NO：150所示的全部序列，可以使检测结果更加准确。

本发明对于人宫颈组织基因组DNA的提取的DNA提取试剂并无特别严格的限制，只要保证提取的DNA样品的完整性即可，可以购买商品化的DNA提取试剂盒，也可以参照精编分子生物学实验指南第五版(F.M·奥斯伯等著)中所述的DNA提取的试剂或适当调整后来用于提取人宫颈组织基因组DNA。优选的，可以选择以下DNA提取试剂：

1)Buffer ATL，购自天根生化科技(北京)有限公司，货号为19076，共200mL，每次用180uL；

2)Proteinase K，(＞600mAU/mL，solution)，共2mL，每次用10uL；

3)RNaseA(17,500U)(100mg/mL；7000units/mL，solution)，共2.5mL，每次用4uL

4)Buffer AL，购自天根生化科技(北京)有限公司，货号为19075，Lysis BufferAL，共216mL，每次用200uL；

5)Buffer AW1，Wash Buffer(1)浓缩液，购自天根生化科技(北京)有限公司，货号为19081，共242mL，使用前每19mL浓缩液加25mL无水乙醇。每次用500uL稀释液。

6)Buffer AW2，Wash Buffer(2)浓缩液，购自天根生化科技(北京)有限公司，货号为19072，共324mL，使用前每14mL浓缩液加30mL无水乙醇。每次用500uL稀释液。

7)Buffer AE(240mL)Elution Buffer AE，购自天根生化科技(北京)有限公司，货号为19077，共240mL，每次用100uL。

本发明所述的PCR扩增用试剂包括：DNA聚合酶，与DNA聚合酶配套使用的缓冲液以及含镁离子的溶液、水等。优选的，PCR扩增用试剂为2×EasyTaq PCR SuperMix反应预混液(购自北京全式金生物技术有限公司，货号为AS111)，使用的水为双蒸水。

本发明对于PCR扩增用试剂的生产厂家、浓度、体系并无特殊严格限制，只要能够保证扩增出目的条带即可，可以是预混型的PCR扩增用试剂，也可以单独包装的PCR扩增用试剂。

进一步，还包括样品保存管，所述样品管用于保存样品，优选的，样品保存管为1.5毫升EP管，并且每管中含有1毫升生理盐水；还包括阴性对照，所述阴性对照为未受HPV病毒感染的人宫颈组织。

一种检测宫颈癌高危人群试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)采集宫颈组织作为样本并利用DNA提取试剂提取宫颈组织DNA；

2)利用高通量病毒整合检测提取宫颈组织DNA序列，并进行分析，去除质量低、重复和接头引物污染的序列，剩余的序列同时向人基因组和HPV基因组比对，去除完全比对到人基因组或HPV基因组的序列，只保留同时部分比对人基因组和部分比对到HPV基因组的整合序列，把整合序列进行末端配对的组装确定准确的整合位点，再次比对末端配对组装后的序列，根据比对结果确定样品是否整合了HPV的部分序列，以及是否在下述基因中整合了HPV的部分序列：

所述基因包括POU5F1B、FHIT、KLF12、KLF5、HMGA2、LRP1B、LEPREL1、DLG2、SEMA3D、MSRB3、MAPK10、PCDH15、PLS3、PARK2、ZNF33B、FOXP2、CDH7、DMD、MACROD2、AGTR2、C9orf85、PRDM9、CADM2、MSX2、CPNE8、ROCK1、NEK11、DUSP6、EPHA6、LOC100132288、DCC、PARD3B、HS3ST4、DLG1、RALYL、IGF1、TRIM33、SLC8A1、DNAH11、CLSTN2、C9orf102、LOC728410、SORCS2、FSTL5、BDP1、FLJ37543、ZNF479、ERC2、SLC7A11、IL1RAPL1中任意一个或几个；进一步的，包括上述50个基因，优选的，包括表2所示的整合位点；

3)利用SEQ ID NO：51至SEQ ID NO：150所示序列对步骤2)获得的整合序列进行PCR扩增；

4)结果分析：将步骤3)扩增的PCR产物进行测序，并与人基因组和HPV基因组进行比对，当同时比对到部分人基因组和部分HPV基因组时，说明所述基因被HPV基因组整合，在比对到的人基因组和HPV基因组的连接处即为HPV的整合位点；检测到整合位点说明结果为阳性，即属于宫颈癌高危人群；否则，结果为阴性，即不属于宫颈癌高危人群。

为了进一步减少检测时间，本发明所述的检测宫颈癌高危人群试剂盒的使用方法，也可以不经过步骤2)的高通量病毒整合检测方法，直接利用步骤3)中所述的引物对宫颈组织DNA进行扩增。

本发明对于PCR扩增方法无特殊限制，试剂操作时可以根据PCR扩增试剂选择合适的扩增条件，只要保证能扩增出目的片段即可，优选的，所述PCR扩增方法为94℃3min，94℃30s，55℃30s，68℃1min，72℃10min，20-38个循环，可以根据实际条件对上述参数进行适当调整。

本发明所述的宫颈癌发生相关的HPV整合的基因位点的检测方法、与宫颈癌发生相关的HPV整合的基因位点和用于检测HPV整合的基因位点的引物，不仅可以组装成检测宫颈癌高危人群试剂盒，还可以用于制作DNA芯片或者其他产品，所述产品可以用于宫颈癌高危人群的检测。

本发明的有益效果是：本发明利用高通量病毒整合检测和PCR Sanger测序获得了与宫颈癌发生相关的50个HPV整合位点(POU5F1B、FHIT、KLF12、KLF5、HMGA2、LRP1B、LEPREL1、DLG2、SEMA3D、MSRB3、MAPK10、PCDH15、PLS3、PARK2、ZNF33B、FOXP2、CDH7、DMD、MACROD2、AGTR2、C9orf85、PRDM9、CADM2、MSX2、CPNE8、ROCK1、NEK11、DUSP6、EPHA6、LOC100132288、DCC、PARD3B、HS3ST4、DLG1、RALYL、IGF1、TRIM33、SLC8A1、DNAH11、CLSTN2、C9orf102、LOC728410、SORCS2、FSTL5、BDP1、FLJ37543、ZNF479、ERC2、SLC7A11、IL1RAPL1)；根据宫颈组织DNA中HPV整合至上述50个基因位点中的任意一个或几个位点，制备了用于检测宫颈癌高危人群的试剂盒，本发明所述的检测宫颈癌高危人群的试剂盒具有快速、方便、准确、假阳性率低等优点。利用HPV整合来组装的试剂盒并应用于判断宫颈癌的高危人群，创新性好，对临床诊断很有帮助。

附图说明

图1为本发明所述检测宫颈癌高危人群试剂盒使用方法的流程图；

图2为正常样本、CINI样本、CINII样本、CINIII样本和宫颈癌样本中所有整合基因位点的HPV整合阳性率分布图；

图3为正常样本、CINI样本、CINII样本、CINIII样本和宫颈癌I期样本中所有整合基因位点的HPV整合阳性率分布图；

图4为CIN样本中50个基因位点(POU5F1B、FHIT、KLF12、KLF5、HMGA2、LRP1B、LEPREL1、DLG2、SEMA3D、MSRB3、MAPK10、PCDH15、PLS3、PARK2、ZNF33B、FOXP2、CDH7、DMD、MACROD2、AGTR2、C9orf85、PRDM9、CADM2、MSX2、CPNE8、ROCK1、NEK11、DUSP6、EPHA6、LOC100132288、DCC、PARD3B、HS3ST4、DLG1、RALYL、IGF1、TRIM33、SLC8A1、DNAH11、CLSTN2、C9orf102、LOC728410、SORCS2、FSTL5、BDP1、FLJ37543、ZNF479、ERC2、SLC7A11、IL1RAPL150)的HPV整合阳性率图，其中标号A代表了50个基因位点在CIN里的HPV的整合阳性率；

图5为宫颈癌样本中50个基因位点(POU5F1B、FHIT、KLF12、KLF5、HMGA2、LRP1B、LEPREL1、DLG2、SEMA3D、MSRB3、MAPK10、PCDH15、PLS3、PARK2、ZNF33B、FOXP2、CDH7、DMD、MACROD2、AGTR2、C9orf85、PRDM9、CADM2、MSX2、CPNE8、ROCK1、NEK11、DUSP6、EPHA6、LOC100132288、DCC、PARD3B、HS3ST4、DLG1、RALYL、IGF1、TRIM33、SLC8A1、DNAH11、CLSTN2、C9orf102、LOC728410、SORCS2、FSTL5、BDP1、FLJ37543、ZNF479、ERC2、SLC7A11、IL1RAPL150)的HPV整合阳性率图，其中，标号B代表了这50个基因位点在宫颈癌样本里的HPV整合阳性率；

图6为正常样本、CINI样本、CINII样本、CINIII样本和宫颈癌样本中50个基因位点(POU5F1B、FHIT、KLF12、KLF5、HMGA2、LRP1B、LEPREL1、DLG2、SEMA3D、MSRB3、MAPK10、PCDH15、PLS3、PARK2、ZNF33B、FOXP2、CDH7、DMD、MACROD2、AGTR2、C9orf85、PRDM9、CADM2、MSX2、CPNE8、ROCK1、NEK11、DUSP6、EPHA6、LOC100132288、DCC、PARD3B、HS3ST4、DLG1、RALYL、IGF1、TRIM33、SLC8A1、DNAH11、CLSTN2、C9orf102、LOC728410、SORCS2、FSTL5、BDP1、FLJ37543、ZNF479、ERC2、SLC7A11、IL1RAPL1 50)的HPV整合阳性率分布图；

图7为正常样本、CINI样本、CINII样本、CINIII样本和宫颈癌I期样本中50个基因位点(POU5F1B、FHIT、KLF12、KLF5、HMGA2、LRP1B、LEPREL1、DLG2、SEMA3D、MSRB3、MAPK10、PCDH15、PLS3、PARK2、ZNF33B、FOXP2、CDH7、DMD、MACROD2、AGTR2、C9orf85、PRDM9、CADM2、MSX2、CPNE8、ROCK1、NEK11、DUSP6、EPHA6、LOC100132288、DCC、PARD3B、HS3ST4、DLG1、RALYL、IGF1、TRIM33、SLC8A1、DNAH11、CLSTN2、C9orf102、LOC728410、SORCS2、FSTL5、BDP1、FLJ37543、ZNF479、ERC2、SLC7A11、IL1RAPL1 50)的HPV整合阳性率分布图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

分别选择30例正常人的宫颈组织(即未受HPV病毒感染的人宫颈组织)，10例CINI患者的宫颈组织、9例CINII患者的宫颈组织、7例CINIII患者的宫颈组织、52例宫颈癌I期患者的宫颈组织、104例宫颈癌患者的宫颈组织作为样本。

本发明所述的CIN指宫颈上皮内瘤变。CINI、CINII和CINIII分别指宫颈上皮内瘤变的不同的病理分期。

1)取25毫克宫颈组织切碎，置于1.5毫升管中，加180微升溶液Buffer ATL，震荡混匀；

2)加入20微升蛋白酶K(Proteinase K)，震荡，56℃水浴直到宫颈组织完全溶解；

3)小转速离心甩下管顶液体，加5微升100毫克/毫升RNAase A，震荡15秒；

4)加入200微升溶液Buffer AL，震荡15秒，70℃水浴10分钟；

5)简短离心，加入200微升无水乙醇，间断震荡15秒，简短离心，转入2毫升QIAamp Spin column，QIAamp Spin column购自天根生化科技(北京)有限公司，转速为8000转/分，离心1分钟，弃离心液体；

6)加入500微升溶液Buffer AW1，转速为8000转/分，离心1分钟，弃离心液体；

7)加入溶液Buffer AW2，转速为14000转/分，离心3分钟，弃离心液体；

8)将QIAamp Spin column吸附柱空转1分钟，充分离去酒精；

9)加入DNA洗脱液(即Buffer AE)洗脱DNA，洗脱的DNA存于1.5毫升管中，保存在-80℃冰箱中，获得1微克的宫颈组织的基因组DNA。

实施例2

利用高通量病毒整合检测方法检测宫颈组织基因组DNA中HPV的整合位点。

1)将实施例1中提取的宫颈组织的基因组DNA样品从-80℃冰箱中取出，放在加有干冰的保温盒中，送到北京迈基诺科技基因科技有限责任公司进行高通量病毒整合检测；

2)检测样品的完整性：制备质量分数1％的琼脂糖凝胶，取适量(2微升左右)样品与Syber Green混合后加入琼脂糖凝胶中，在电泳槽中，以150V电泳40分钟。在凝胶显像仪中曝光显示条带，出现单一没有拖带的条带，提示样品的完整性比较好；

3)检测样品浓度及含量：以DNA洗脱液作为空白对照，取适量样品在Nanodrop检测DNA样品，DNA样品的含量为1微克；

4)宫颈组织的基因组DNA样品的高通量病毒整合检测：设计含有17种亚型的HPV全长探针(HPV6，HPV 11，HPV 16，HPV 18，HPV 31，HPV 33，HPV 35，HPV 39，HPV 45，HPV 52，HPV 56，HPV 58，HPV 59，HPV 66，HPV 68，HPV 69，HPV 82，探针的序列详细内容参见http：//pan.baidu.com/s/1dj2YzA9。根据Illimina的要求构建DNA的测序文库，应用Covaris E-210(Covaris，Inc.，Woburn，MA)把宫颈组织基因组DNA打断为150-200碱基的小片段。然后把这些小片段纯化、末端填平、加A尾并连接接头引物。使用Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)确定DNA文库的浓度。根据MyGenostics GenCap目标富集方法进行杂交(http：//www.mygenostics.com/)。应用含有17种亚型的HPV探针，与基因组DNA文库在65℃杂交24小时，然后洗脱未杂交的DNA片段。获取的片段通过18轮PCR扩增建成测序文库。把测序文库加入HiSeq 2000测序仪进行测序。

5)高通量病毒检测结果分析：

首先，去除质量低、重复和接头引物污染的序列，剩余的序列同时向人基因组(NCBIbuild 37，HG19)和HPV基因组(HPV6：FR751337.1，HPV82：AF293961.1，HPV69：AB027020.1，HPV68：FR751039.1，HPV66：EF177191.1，HPV59：EU918767.1，HPV58：HQ537777.1，HPV56：EF177181.1，HPV52：HQ537751.1，HPV45：EF202167.1，HPV39：M62849.1，HPV35：HQ537730.1，HPV33：HQ537688.1，HPV31：HQ537687.1，HPV18：AY262282.1，HPV16：NC_001526.2，HPV11：HE574705.1)比对。

其次，去除完全比对到人基因组或HPV病毒基因组的序列，只保留同时部分比对到人和部分比对到HPV基因组的嵌合序列。把嵌合序列进行末端配对的组装确定准确的整合位点。应用Burrows-Wheeler Alignment tool(BWA，版本0.7.1)再次比对末端配对组装后的序列，在人基因组DNA和HPV基因组DNA的序列的连接处即为HPV的整合位点。根据比对结果可以确定样品是否有整合，以及是否有POU5F1B、FHIT、KLF12、KLF5、HMGA2、LRP1B、LEPREL1、DLG2、SEMA3D、MSRB3、MAPK10、PCDH15、PLS3、PARK2、ZNF33B、FOXP2、CDH7、DMD、MACROD2、AGTR2、C9orf85、PRDM9、CADM2、MSX2、CPNE8、ROCK1、NEK11、DUSP6、EPHA6、LOC100132288、DCC、PARD3B、HS3ST4、DLG1、RALYL、IGF1、TRIM33、SLC8A1、DNAH11、CLSTN2、C9orf102、LOC728410、SORCS2、FSTL5、BDP1、FLJ37543、ZNF479、ERC2、SLC7A11、IL1RAPL150个基因位点中的任意一个或几个位点的整合。

实施例3

利用PCR扩增以及Sanger测序验证HPV整合位点。

1.PCR扩增

设计能扩增所述HPV整合位点的上下游引物，所述引物如表3所示，按如下体系配制：

每管分别混匀，放到标准的PCR仪扩增并使用如下程序：

2.将扩增后得到的PCR产物送武汉天-辉远生物科技有限公司进行Sanger测序。

1)扩增后得到的PCR产物(含量大于200ng，体积大于20ul)，送武汉天-辉远生物科技有限公司进行Sanger测序；

2)PCR样品纯化，加入ABI3730XL测序仪检测PCR片段的序列。

3.根据测序结果分析检测HPV的整合位点，检测出50个整合位点。

1)应用文本文档打开测序结果。

2)利用NCBI BLAST进行测序结果比对。打开BLAST页面，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。点击Basic BLAST部分的nucleotide blast链接到一个新的页面。在Enter Query Sequence部分输入序列的或者把序列粘贴进去。Job Title部分还可以为本次工作命一个名字。在Choose Search Set部分选择“others”，在下拉对话框中选择NCBI chromosome。在Program Selection部分选择本次比对的精确度，通常选择highly similiar sequences。点击BLAST按钮后，出现比对结果。

3)比对结果的判读。Description部分会提示一部分序列来自人基因组DNA，另一部分序列来自HPV基因组DNA。其中Max score，Total score，Max identity越高，相似程度越高。E value越低，相似程度越高。选择相似程度最高的人的DNA和HPV病毒DNA的比对结果。

4)结果统计。根据比对结果可以确定样品是否有整合，以及是否有POU5F1B、FHIT、KLF12、KLF5、HMGA2、LRP1B、LEPREL1、DLG2、SEMA3D、MSRB3、MAPK10、PCDH15、PLS3、PARK2、ZNF33B、FOXP2、CDH7、DMD、MACROD2、AGTR2、C9orf85、PRDM9、CADM2、MSX2、CPNE8、ROCK1、NEK11、DUSP6、EPHA6、LOC100132288、DCC、PARD3B、HS3ST4、DLG1、RALYL、IGF1、TRIM33、SLC8A1、DNAH11、CLSTN2、C9orf102、LOC728410、SORCS2、FSTL5、BDP1、FLJ37543、ZNF479、ERC2、SLC7A11、IL1RAPL150个基因位点中的任意一个或几个位点的整合。

实施例5

将来自HPV感染的CIN1、CIN2、CIN3、宫颈癌样本按照实施例1所述的方法提取基因组DNA，按照实施例2所述的方法利用高通量病毒整合检测来检测宫颈组织基因组DNA中HPV的整合位点，经过结果分析后获得了所有整合的基因位点，详细信息参见http：//pan.baidu.com/s/1hq7u7w4。(注明，此部分内容也是发明人的成果，由于在撰写本发明时，此部分内容过于复杂，就在撰写时，将关于所有整合的基因位点的内容置于上述网址上)。

实验结果分析

检测结果如表1和表2所示，表中的整合位点以及整合序列从所有宫颈病变的样本中汇集而来的，包括了CIN1、CIN2、CIN3、宫颈癌，是所有样品中检测出的整合位点的汇总。

当同时比对到部分人基因组和部分HPV基因组时，说明所述基因被HPV基因组整合，在比对到的人基因组和HPV基因组的连接处即为HPV的整合位点；检测到整合位点说明结果为阳性，即属于宫颈癌高危人群；否则，结果为阴性，即不属于宫颈癌高危人群。

图1为本发明所述检测宫颈癌高危人群试剂盒使用方法的流程图。本发明所述的检测宫颈癌高危人群试剂盒使用方法包括以下步骤：提取受试者宫颈组织基因组DNA，通过高通量病毒整合检测和常规PCR检测出HPV整合位点，通过检测结果作出受试者属于宫颈癌高危人群的分析判断。

图2和图3分别是不同样本针对所有整合基因位点的HPV整合阳性率分析结果。本发明所述的″所有整合基因位点″指发明人利用实施例1和实施例2所述的方法对宫颈组织DNA进行检测的过程中发现的大于2000种HPV整合的基因位点，详细信息参见http：//pan.baidu.com/s/1hq7u7w4。在″所有整合基因位点″中大部分出现频率都比较低，本发明所述的50个整合位点出现的频率较高。

图2为正常人群样本、CINI患者样本、CINII患者样本、CINIII患者样本和宫颈癌患者样本中所有整合基因位点的HPV整合阳性率分布图。所述整合阳性即检测到同时部分含有人基因组序列和部分含有HPV基因组序列。所述整合阳性率的计算方法，分母是某一病理分期检测的总病人数，分子是这一病理分期病人中检测出整合阳性的病人数。在统计的30例正常宫颈样本、26例CIN样本(包括CINI患者样本、CINII患者样本、CINIII患者样本)和104例宫颈癌样本中，检测出的所有HPV整合阳性率表现为从正常的HPV整合阳性率为0到CINI的50％、CINII的44％、CINIII的71％，再到宫颈癌的HPV整合阳性率为82％，呈现出一个不断上升的趋势，上述结果说明了说明HPV整合阳性率和宫颈病变恶性化程度密切相关，宫颈病变恶性化程度越高，HPV整合阳性率越高，因此HPV整合可以作为评价宫颈病变恶性化程度，预测宫颈癌风险的一个指标；

图3为正常人群样本、CINI患者样本、CINII患者样本、CINIII患者样本和宫颈癌I期患者样本中所有整合基因位点的HPV整合阳性率分布图。在30例正常宫颈样本、10例CINI样本、9例CINII样本、7例CINIII样本和52例宫颈癌I期样本这5个不同的阶段中，检测出的所有HPV整合阳性率为从正常宫颈样本的HPV整合阳性率为0到CINI样本的50％、CINII样本的44％、CINIII样本的71％，再到宫颈癌I期样本的88％，在宫颈癌I期的样本中检测出的HPV整合阳性率明显升高，上述结果说明了HPV整合阳性率和宫颈病变恶性化程度密切相关，宫颈病变恶性化程度越高，HPV整合阳性率越高，因此HPV整合可以作为评价宫颈病变恶性化程度，预测宫颈癌风险的一个指标；

图4为CIN样本中50个基因位点的HPV整合阳性率图。在26例CIN样本中，50个基因位点(POU5F1B、FHIT、KLF12、KLF5、HMGA2、LRP1B、LEPREL1、DLG2、SEMA3D、MSRB3、MAPK10、PCDH15、PLS3、PARK2、ZNF33B、FOXP2、CDH7、DMD、MACROD2、AGTR2、C9orf85、PRDM9、CADM2、MSX2、CPNE8、ROCK1、NEK11、DUSP6、EPHA6、LOC100132288、DCC、PARD3B、HS3ST4、DLG1、RALYL、IGF1、TRIM33、SLC8A1、DNAH11、CLSTN2、C9orf102、LOC728410、SORCS2、FSTL5、BDP1、FLJ37543、ZNF479、ERC2、SLC7A11、IL1RAPL1)的HPV整合阳性率40.6％，上述结果说明HPV整合阳性率和宫颈病变恶性化程度密切相关，宫颈病变恶性化程度越高，HPV整合阳性率越高，因此HPV整合可以作为评价宫颈病变恶性化程度，预测宫颈癌风险的一个指标；

图5为宫颈癌样本中50个基因位点的HPV整合阳性率图。在104例宫颈癌标本中，50个基因位点(POU5F1B、FHIT、KLF12、KLF5、HMGA2、LRP1B、LEPREL1、DLG2、SEMA3D、MSRB3、MAPK10、PCDH15、PLS3、PARK2、ZNF33B、FOXP2、CDH7、DMD、MACROD2、AGTR2、C9orf85、PRDM9、CADM2、MSX2、CPNE8、ROCK1、NEK11、DUSP6、EPHA6、LOC100132288、DCC、PARD3B、HS3ST4、DLG1、RALYL、IGF1、TRIM33、SLC8A1、DNAH11、CLSTN2、C9orf102、LOC728410、SORCS2、FSTL5、BDP1、FLJ37543、ZNF479、ERC2、SLC7A11、IL1RAPL1)的HPV整合阳性率为80、5％，上述结果说明了说明HPV整合阳性率和宫颈病变恶性化程度密切相关，宫颈病变恶性化程度越高，HPV整合阳性率越高，因此HPV整合可以作为评价宫颈病变恶性化程度，预测宫颈癌风险的一个指标；

图6为正常宫颈样本、CINI样本、CINII样本、CINIII样本和宫颈癌样本中50个基因位点的HPV整合阳性率分布图。所述50个基因位点包括：POU5F1B、FHIT、KLF12、KLF5、HMGA2、LRP1B、LEPREL1、DLG2、SEMA3D、MSRB3、MAPK10、PCDH15、PLS3、PARK2、ZNF33B、FOXP2、CDH7、DMD、MACROD2、AGTR2、C9orf85、PRDM9、CADM2、MSX2、CPNE8、ROCK1、NEK11、DUSP6、EPHA6、LOC100132288、DCC、PARD3B、HS3ST4、DLG1、RALYL、IGF1、TRIM33、SLC8A1、DNAH11、CLSTN2、C9orf102、LOC728410、SORCS2、FSTL5、BDP1、FLJ37543、ZNF479、ERC2、SLC7A11、IL1RAPL150。在正常样本、CINI样本、CINII样本、CINII样本I和宫颈癌样本中的这50个基因位点的HPV整合阳性比例分别为0，25％，37％，60％和80.5％，呈现不断上升趋势，上述结果说明了说明HPV整合阳性率和宫颈病变恶性化程度密切相关，宫颈病变恶性化程度越高，HPV整合阳性率越高，因此HPV整合可以作为评价宫颈病变恶性化程度，预测宫颈癌风险的一个指标；

图7为正常宫颈样本、CINI样本、CINII样本、CINIII样本和宫颈癌I期中50个基因位点的HPV整合阳性率分布图。所述50个基因位点包括：POU5F1B、FHIT、KLF12、KLF5、HMGA2、LRP1B、LEPREL1、DLG2、SEMA3D、MSRB3、MAPK10、PCDH15、PLS3、PARK2、ZNF33B、FOXP2、CDH7、DMD、MACROD2、AGTR2、C9orf85、PRDM9、CADM2、MSX2、CPNE8、ROCK1、NEK11、DUSP6、EPHA6、LOC100132288、DCC、PARD3B、HS3ST4、DLG1、RALYL、IGF1、TRIM33、SLC8A1、DNAH11、CLSTN2、C9orf102、LOC728410、SORCS2、FSTL5、BDP1、FLJ37543、ZNF479、ERC2、SLC7A11、IL1RAPL150。在正常宫颈样本、CINI样本、CINII样本、CINII样本I和宫颈癌I期样本中，这50个基因位点的HPV整合阳性比例分别为0，25％，37％，60％和83、5％，也同样呈现不断上升的趋势，上述结果说明了HPV整合阳性率和宫颈病变恶性化程度密切相关，宫颈病变恶性化程度越高，HPV整合阳性率越高，因此HPV整合可以作为评价宫颈病变恶性化程度，预测宫颈癌风险的一个指标；

上述所述的宫颈癌指包括了宫颈癌I在内的所有不同阶段的宫颈癌。

附图2和附图3是把所有整合位点都考虑在内的统计结果，附图4至附图7是只考虑50个基因位点的统计结果，在这50个基因位点中出现任意一个或几个整合的情况。根据上述结果，可以说明，这50个基因位点(POU5F1B、FHIT、KLF12、KLF5、HMGA2、LRP1B、LEPREL1、DLG2、SEMA3D、MSRB3、MAPK10、PCDH15、PLS3、PARK2、ZNF33B、FOXP2、CDH7、DMD、MACROD2、AGTR2、C9orf85、PRDM9、CADM2、MSX2、CPNE8、ROCK1、NEK11、DUSP6、EPHA6、LOC100132288、DCC、PARD3B、HS3ST4、DLG1、RALYL、IGF1、TRIM33、SLC8A1、DNAH11、CLSTN2、C9orf102、LOC728410、SORCS2、FSTL5、BDP1、FLJ37543、ZNF479、ERC2、SLC7A11、IL1RAPL150)有比较好的代表性，可以用于宫颈癌高危人群的检测。

单独检测其中任意一个或任意几个基因可以获得较好的效果，当把上述50个基因位点一起检测时，检测出的基因位点越多，提示人基因组DNA受HPV破坏导致的基因组不稳定性越高，发生宫颈癌的危险程度越高，会获得更好的效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。