HPV16整合至宿主基因组导致宫颈癌发生发展的机理研究

摘要

研究背景与目的:作为最常见的妇科恶性肿瘤之一,宫颈癌每年在全球约有50万新发病例和23万死亡病例,严重威胁着妇女的健康和生存。因此,宫颈癌的防治工作刻不容缓。2008年的诺贝尔奖向人们昭示着人乳头状瘤病毒(human papilloma virus,HPV),尤其是高危型 HPV感染是发生宫颈癌的主要风险因素,病毒的E6与E7两种癌蛋白可干扰细胞周期、凋亡和染色体的稳定性最终导致细胞的永生化,从而逐步发展为宫颈癌。然而,尽管95％以上的宫颈癌中均发现了HPV病毒的癌蛋白表达,但却不是每一个感染高危型 HPV的患者均发生了宫颈癌。因此,深入探索 HPV的致病机制极其与宫颈癌的内在关联,从而得到精确反映宫颈癌发生和预后的标记物并靶向性对宫颈癌的发生发展进行分子阻遏,已成为众多妇科肿瘤学者们研究的重要方向。随着分子生物学和细胞遗传学的进展,人们逐渐发现 HPV与宿主染色体的整合才是宫颈细胞永生化过程中的重要步骤,HPV整合位点附近宿主基因组的表达变化及整合后病毒癌基因的表达增强可能是宫颈癌发病过程中的重要导火索。然而,HPV的整合位点在宿主基因组上的分布规律至今存在争议,且缺乏中国人整合位点的研究资料。本项目拟从大量临床样本中寻求 HPV16的整合规律,锁定特定高发位点并同时具有临床和分子生物学特征的人群,探索 HPV16整合至该位点后发挥关键作用的靶基因,并通过构建模拟人体自然感染状态的细胞模型来在多基因水平对 HPV16整合至特定位点后的宫颈癌发生、发展过程进行验证,明确 HPV16整合至特定位点后其靶基因的变化在宫颈癌发病中的作用。从而为宫颈癌的分子分型平台提供新的理论基础,以期从 HPV16整合至特定位点这一特殊现象窥视宫颈癌整个群体的发病机理学研究,为推动宫颈癌的靶向基因阻遏技术的进展并早日实现其临床转化提供实用探索。
　　方法:
　　1.HPV16感染标本及感染状态的筛查:选取因子宫颈癌行广泛性全子宫切除术后获得的宫颈癌冰冻组织,按照 DNA提取试剂盒的要求逐步提取标本 DNA,PCR法反复筛查及验证 HPV16感染,对明确感染类型的标本行多次 PCR扩增法确定宫颈癌组织中HPV16感染状态。
　　2.宫颈癌组织中HPV整合位点的分布及其临床意义:选取已明确 HPV感染类型为16型的宫颈癌冰冻组织,采用Trizol消化法提取冰冻组织 RNA并逆转录相应的CDNA,用巢式 PCR法检测宫颈癌组织中HPV整合位点,并分析其宿主相邻基因及基因座特点;调取所有样本的临床资料,将患者的临床特征按照整合位点的分类进行对比分析,剖析 HPV整合位点与宿主临床表现之间的内在联系。
　　3.HPV整合至线粒体导致宫颈癌发生发展的关键靶基因筛选:用Real-time PCR的方法检测不同整合位点的宫颈癌样本的线粒体基因表达,并分为整合至线粒体、整合至宿主染色体、正常宫颈组织等三组进行对比;调取整合至宿主线粒体的样本的临床资料,分析该群患者的临床特征;随机选取整合至宿主染色体标本3例、整合至宿主线粒体标本4例与正常宫颈组织4例送基因芯片检测;根据芯片检测结果筛选出HPV整合至宿主线粒体后的关键靶基因并在不同级别宫颈病变的临床样本石蜡切片行免疫组化验证,利于相应组织 RNA进行靶基因表达的Real-time PCR验证;通过构建不同的细胞模型来模拟 HPV整合至宿主线粒体的发生发展过程,明确 HPV整合至线粒体导致宫颈癌发生发展的机制。
　　4.宫颈角化细胞原代培养模型的建立:选取在同济医院因非恶性肿瘤性疾病并排除宫颈癌前病变和HPV感染而行全子宫切除的新鲜正常宫颈上皮样本,分别用直接培养法和3T3细胞共饲法培养宫颈角化上皮;激光共聚焦显微镜鉴定细胞分类,排除成纤维细胞的污染;细胞周期阻滞后滴片行染色体核型分析验证细胞是否与正常二倍体细胞染色体形态一致。
　　结果:
　　1.HPV16在192例宫颈癌组织标本中的感染率为56.57％;在112例感染 HPV16的宫颈癌标本中,HPV16单纯整合感染的病例共有73例,阳性率达到65.18％(73/112),HPV16游离型样本有17例(占所有 HPV16感染样本的15.18％),HPV16游离型与整合型混合感染的样本有22例(占所有 HPV16感染样本的19.64％)。
　　2.112例 HPV16感染的样本中共有86例样本查出了整合转录体,得到整合位点98个,其中12例位于线粒体上,8例位于线粒体基因 ND3位点,4例位于线粒体 RNR2位点;86例位于宿主染色体上,除8号、9号、18号、22号等染色体外广泛分布在宿主各条染色体上,其中常见脆性位点26例,罕见脆性位点8例,非脆性位点52例。追踪以上患者的临床特征提示除淋巴转移率外,整合至宿主染色体各位点与整合至线粒体的患者在其他临床特征方面均无显著性差异。
　　3.整合至线粒体的标本中其9种线粒体基因表达较正常组织均有明显降低,仅整合至宿主核 DNA的标本其9种线粒体基因的表达较正常组织多有明显升高或有轻度降低;整合至线粒体的12例患者中有7例肿瘤为低分化且均为Ⅱa期及以上患者,4例为宫颈中分化鳞癌且其中1例虽为Ⅰb期但术后2年内即复发;芯片检测聚类结果提示:三组间差异明显,包括线粒体基因在内的数百个基因组间差异明显;芯片分析提示肿瘤组织与正常组织间代谢相关基因差异明显,HPV整合至线粒体较整合至染色体的宫颈癌组织间代谢相关基因亦有明显差异,但差异相对较小,提示 HPV整合至线粒体可能导致了宫颈癌的进一步代谢变化。
　　4.两种培养方法均获得原代培养的宫颈角化上皮;培养之上皮细胞角蛋白抗体免疫荧光检测阳性、vimitin抗体免疫荧光染色阴性,提示上皮细胞成分纯正,无成纤维细胞污染;染色体核型分析示每个细胞含有46条染色体,形态与人正常二倍体细胞染色体一致。
　　结论:
　　1.HPV16在宫颈癌组织中是最常见的HPV感染类型,其存在形式多以整合型存在,但仍有少部分样本以混合或游离型存在。
　　2.HPV16在宿主染色体的整合呈广泛分布,其脆性位点的整合几率为39.53％,以常见脆性位点为主;HPV16在宿主线粒体的整合具有相对高发性,且位点集中明显;HPV16在宿主染色体的整合位点分布与其临床特征并无特定关系,但整合至线粒体的标本淋巴转移率明显增高。
　　3.HPV16整合至宿主线粒体的样本具有其独特的临床特征、线粒体基因表达异常和独特的基因指纹,是一类特殊类型的宫颈癌,其发病机制尚待进一步研究。
　　4.原代培养的宫颈角化上皮模型可在体外稳定传代培养,可为宫颈癌发病机制的研究提供充足、可靠的正常人二倍体宫颈角化细胞模型。

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中文摘要

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研 究 背 景

第一部分宫颈癌组织中HPV16感染存在状态的研究

材料与方法

结果

讨 论

参考文献

第二部分宫颈癌组织中HPV16整合位点的分布及其临床意义

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第三部分HPV16整合至线粒体导致宫颈癌发生发展的关键靶基因筛选

材料与方法

结 果

讨论

参考文献

第四部分宫颈上皮细胞原代培养模型的建立

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述

HPV整合与宫颈癌

HPV整合与线粒体DNA

线粒体DNA突变、肿瘤与宫颈癌

展望

参考文献

致谢