一种高效表达高分子量型腈水合酶的基因工程菌及其应用

摘要

本发明公开了一种高效表达高分子量型腈水合酶的基因工程菌及其应用，属于微生物基因工程技术领域。本发明所述的高分子量型腈水合酶基因nhhB(rbs)A(rbs)G是基于R.rhodochrous J1来源的腈水合酶基因bag，经密码子优化及表达元件改造之后化学合成得到，该基因全长1645bp，编码533个氨基酸，能够在大肠杆菌中成功表达。该方法高效安全，在24℃诱导16h即可获得96.7U/mL可溶性腈水合酶，纯化后比酶活高达234U/mg。该方法有利于生产过程中腈水合酶的提取纯化以及酰胺类物质的高效酶法合成。

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效表达高分子量型腈水合酶的基因工程菌及其应用，属于微生物基因 工程技术领域。

背景技术

腈水合酶(Nitrile hydratase，简称NHase，EC4.2.1.84)，是一种能将腈类物质水合成更 有价值的酰胺类化合物的金属酶。NHase在微生物中分布比较广泛，目前已经在红球菌属 (Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、芽孢杆菌属 (Bacillus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、丛毛单胞菌属(Comamonas)中都可以得到腈水合酶 的基因序列。红球菌Rhodococcus rhodochrous J1作为第三代生产菌株已经广泛用于丙烯酰胺 的工业生产。通过此方法生产的丙烯酰胺年产量近百万吨，将近总产量的三分之一。红球菌 中主要用于转化生成丙烯酰胺的是含有的腈水合酶。经过诱导可产生两种物理化学性质以及 底物特异性不同的腈水合酶：低分子量腈水合酶L-NHase和高分子量腈水合酶H-NHase。两 者均由β亚基、α亚基构成，β亚基基因位于α亚基基因的上游。两种腈水合酶同源性为58.1％。

而本发明中的高分子量型腈水合酶H-NHase与低分子量型腈水合酶L-NHase相比更稳 定，产物耐受性更好，目前工业上主要是通过诱导J1菌中H-NHase的表达，并以此来大量 生产丙烯酰胺。但是野生菌中合成的NHase稳定性差，且红球菌Rhodococcus rhodochrous J1 培养时间长(90h左右)，立体选择性弱，且表达量低。不利于大规模制备，并且对菌种的重 复使用次数有很大限制。

由于一些放线菌来源的腈水合酶基因在以大肠杆菌为宿主的体系中表达时，所受到的调 控机制与野生菌区别较大，表达出来的蛋白极易聚集形成包涵体，因而放线菌来源的腈水合 酶基因的异源表达在过去10多年中研究进展缓慢。Co-NHase的异源表达存在酶活力低， SDS-PAGE无法检测到目标表达条带，调控蛋白稳定性差，半衰期短，易降解等难题(Zhou Z， Hashimoto Y,Shiraki K,et al.Discovery of posttranslational maturation by self-subunit swapping. Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(39):14849-14854.)

大肠杆菌的密码子使用具有简并性，即一个氨基酸由两个以上的密码子编码。但是，大 肠杆菌并不是同等地使用每个密码子来编码氨基酸的，对某一个氨基酸而言，大肠杆菌通常 倾向于更多地使用它所对应的同义密码子中的一种或数中，而不是均衡地或随机地使用每一 种同义密码子来编码它，及大肠杆菌的密码子使用具有偏好性。分析之前Kobayashi等人直 接将高分子量型腈水合酶基因在大肠杆菌异源表达没有获得高表达量的原因，并考虑到大肠 杆菌密码子偏好性的因素，本发明将原始高分子量腈水合酶基因根据大肠杆菌密码子偏好性 进行同义突变，从而通过提高蛋白翻译速度和翻译精度以提高异源表达蛋白的量(Bulmer M. The selection-mutation-drift-theory of synonymous codon usage.Genetics,1991,129:897-907)。

另外，几乎所有天然的mRNA的起始密码上游都具有SD序列(Shine J,Dalgarno L.The 3’-terminal sequence of Escherichia coli16S ribosomal RNA:complementarity to nonsense triplets  and ribosome binding sites.Pro Natl Acad Sci U S A,1974,71(4):1342-1346.)。在翻译过程中， SD序列与原核生物中30S小亚基的16S rRNA的3’端的嘌呤互补，从而介导蛋白从起始密码 开始翻译。不同基因的mRNA有不同的SD序列与16S rRNA的结合能力不同，从而控制着 单位时间内翻译过程中起始复合物形成的数目，并最终决定了翻译的速度。AAGGA是大肠 杆菌强SD序列最偏好的模式。另外，SD序列与16S rRNA序列互补的程度以及从起始密码 子AUG到SD的距离也都强烈地影响翻译起始的效率(Steitz J A,Jakes K.How ribosomes  select initiator regions in mRNA:base pair formation between the3’terminus of16S rRNA and the  mRNA during initiation of protein synthesis in Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci U S A,1975, 72(12):4734-4738.)。分析起始密码子AUG到SD的距离，所起的调控作用也不相同。

本发明旨在开发出一种能在大肠杆菌中高效表达红球菌来源的高分子量型腈水合酶的方 法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是实现红球菌Rhodococcus rhodochrous来源的原始高分子量型 腈水合酶H-NHase在大肠杆菌BL21(DE3)的高效表达。本发明是通过NCBI检索到红球菌 (Rhodococcus rhodochrous)H-NHase的基因序列，并通过密码子优化和SD序列、间隔序列 改造后经化学合成得到该基因。

本发明以基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌株，将生物合成的高分子量型腈 水合酶基因转入其中。目的基因nhhB(rbs)A(rbs)G全长为1645bp，编码533个氨基酸。本发 明是一个新的经改造的人工合成的腈水合酶基因。将获得的基因与载体pET-24(a)连接，构建 重组表达载体pET-24(a)-nhhB(rbs)A(rbs)G，经过诱导后成功表达该基因，证实是一个具有表 达功能的基因。将表达的酶进行表征，HPLC分析结果表明，该基因表达的酶具有高催化活 性。

本发明的第一个目的是提供一种高产高分子量型腈水合酶的重组大肠杆菌。

所述重组大肠杆菌以E.coli BL21(DE3)为宿主，pET24a(+)为载体，表达腈水合酶； 所述腈水合酶由氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的nhhB 基因、nhhA基因、调控基因nhhG组成。

所述nhhB与nhhA基因、nhhA与nhhG基因，在本发明的一种实施方式中，均由核苷酸 序列如SEQ ID NO.4所示的SD序列和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的间隔序列按照“SD 序列-间隔序列”的方式相连。

所述腈水合酶的nhhB基因、nhhA基因、调控基因nhhG，在本发明的一种实施方式中， 其序列根据大肠杆菌密码子偏好性进行了优化。

所述腈水合酶，在本发明的一种实施方式中，其核苷酸序列是SEQ ID NO.6所示的序列。

本发明的第二个目的是一种构建权利要求1所述重组大肠杆菌的方法。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，是：(1)以NCBI上登录号为Genbank ID:X86737.1 的序列为基础，将腈水合酶的B、A基因之间以及A、G基因之间的序列替换成SD序列AAGGA 和间隔序列GATATAGAT，并根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化得到序列如SEQ ID NO.6 所示的nhhB(rbs)A(rbs)G的序列；(2)将上一步得到的序列克隆到表达载体pET24a(+)上， 筛选获得正确的重组质粒pET24a(+)-nhhB(rbs)A(rbs)G；(3)将重组质粒转化入E.coli BL21， 筛选得正确的重组菌BL21/pET24a(+)-nhhB(rbs)A(rbs)G。

所述克隆，在本发明的一种实施方式中，是在nhhB(rbs)A(rbs)G的序列两端分别添加酶切 位点Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ，然后克隆到pET24a(+)的相应酶切位点处。

本发明的第三个目的是提供一种所述重组大肠杆菌的应用方法。

所述应用方法，在本发明的一种实施方式中，是将重组大肠杆菌用于生产腈水合酶。

所述应用方法，在本发明的一种实施方式中，是将重组大肠杆菌接种于含有16g/L胰蛋 白胨、10g/L酵母提取物、5g/L NaCl的培养基中，于37℃培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，然后加入 IPTG和CoCl₂·6H₂O进行诱导，诱导温度为24℃，诱导16h。

所述应用方法，在本发明的一种实施方式中，所述加入IPTG和CoCl₂·6H₂O的终浓度分 别为0.4mM、0.1g/L。

本发明还要求保护按所述应用方法得到的腈水合酶以及其应用。

本发明的有益效果：

(1)实现了红球菌属来源的腈水合酶在大肠杆菌中的成功异源表达、高效表达；密码子 优化及表达元件改造后的高分子量型腈水合酶H-NHase，粗酶液酶活达1.61U/mg(为 Kobayashi等人在大肠杆菌异源表达的腈水合酶酶活的464倍)、可溶性酶活达96.7U/mL， 纯酶比活达234U/mg。

(2)显著缩短了菌体培养及发酵时间。原始菌株R.rhodochrous J1仅培养时间就至少需 要48h，诱导时间72h左右；而大肠杆菌培养及诱导表达，最多不超过20h，因此，在时间 上大肠杆菌具有明显优势，显著提高了生产效率，降低了生产成本。

(3)得到的重组菌的催化产物单一。在红球菌R.rhodochrous J1中同时存在腈类物质代 谢途径中三种关键酶：腈水合酶、腈水解酶与酰胺酶，在生产酰胺类物质的同时还有部分腈 类物质被腈水解酶直接水解氨和羧酸，而酰胺酶又会将部分水合酶作用下生成的酰胺类物质 进一步水合，生成羧酸。而本发明中，将单独的腈水合酶基因导入大肠杆菌中，与腈类物质 发生反应，生成的物质全部为目的产物——酰胺类物质。简化了工业提取工艺，提高产物纯 度，降低生产成本。

附图说明

图1：高分子量型腈水合酶全基因片段；其中M为DNA分子量标准，1为腈水合酶全基因片 段；

图2：高分子量型腈水合酶全基因片段插入质粒pET24a(+)；其中M为DNA分子量标准， 1为重组质粒pET24a(+)-nhhB(rbs)A(rbs)G；

图3：腈水合酶表达的SDS-PAGE电泳图；其中M为蛋白分子量标准，1为不带目的基因的 空载质粒pET-24a，经IPTG诱导的E.coil BL21全细胞，2为重组菌株E. coli-BL21/pET24a(+)-nhhB(rbs)A(rbs)G，经IPTG诱导全细胞；

图4：20mM烟酰胺标样的HPLC图，出峰时间为3.53min；

图5：高分子量型腈水合酶催化烟腈后HPLC分析，在3.50min出现产物峰，与标样出峰时 间一致。

图6：H-NHase与L-NHase在50℃的热稳定性比较。

具体实施方式

2YT培养基：16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠。

腈水合酶HPLC检测条件：流动相乙腈水(乙腈：水＝1：2)缓冲液；检测波长210nm；色 谱柱为C18柱(HITACHI LaChrom C18,250×4.6mmI.D.,5μm)。腈水合酶的一个酶活力单 位定义为：该酶在25℃时每分钟催化产生1μmol尼克酰胺所需要的酶量。

实施例1：高分子量腈水合酶基因nhhB(rbs)A(rbs)G的获取

(1)首先经NCBI中GenBank数据库检索得到红球菌Rhodococcus rhodochrous J1来源 的原始高分子量型腈水合酶基因(bag)(Genbank ID:X86737.1)。

(2)数据库中得到的序列中，将腈水合酶基因B、A之间和A、G之间的序列替换成大 肠杆菌的SD序列(AAGGA)和间隔序列(GATATAGAT)。

(3)将上一步中经改造设计后的腈水合酶基因序列，根据大肠杆菌密码子偏好性进行优 化得到腈水合酶目的基因nhhB(rbs)A(rbs)G的序列，如SEQ ID NO.6所示，并在此基因片段 上下游两端分别添加酶切位点Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ。

(4)将上一步中最终获得的基因序列送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行目的 基因的人工合成。

实施例2：表达载体pET24a(+)-nhhB(rbs)A(rbs)G的构建

将化学合成的目的基因片段克隆于pET24a(+)的Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点，转化E.coli  JM109，在含有卡那霉素抗性的2YT平板上筛选重组子。提取重组质粒并进行PCR验证(如 图1所示)，获得了1645bp大小电泳条带，与目的基因大小相同；重组质粒用EcoR Ⅰ酶切 后获得6910bp电泳条带(如图2所示)，表明成功构建了pET24a(+)-nhhB(rbs)A(rbs)G重组 质粒。

实施例3：BL21/pET24a(+)-nhhB(rbs)A(rbs)G的诱导表达

将重组质粒pET24a(+)-nhhB(rbs)A(rbs)G，转化入E.coli BL21，获得 BL21/pET24a(+)-nhhB(rbs)A(rbs)G。BL21/pET24a(+)-nhhB(rbs)A(rbs)G重组子单菌落接种至5 mL的2YT培养基中37℃培养10h，取1mL培养液转接至100mL的2YT培养基中37℃培 养至OD₆₀₀为0.6～0.8时加入至终浓度为0.4mM的IPTG及0.1g/L的CoCl₂·6H₂O，24℃ 诱导表达16h后离心收集菌体，进行SDS-PAGE检测表达情况，结果见图3，与理论上α亚 基26KDa，β亚基29KDa相符。

实施例4：重组大肠杆菌的应用

取10μL没有诱导和经过诱导的重组大肠杆菌细胞分别于490μL400mM的烟腈于25℃ 下反应10min后，加入500μL乙腈终止反应，将1ml反应液用0.22μm的纤维素膜过滤后进 行HPLC分析。HPLC测定条件，日立C18柱，水：乙腈＝2：1作为流动相，流速0.8ml/min， 进样10μL。标准样品及酶催化后的HPLC图谱如图4和5，表明该重组酶可催化烟腈生成烟 酰胺，总酶活最高可达到96.7U/mL，纯化后的比酶活可达234U/mg。

本发明表达的H-NHase热稳定性较与同样来源于红球菌Rhodococcus rhodochrous J1的 L-NHase相比，具有较大优势(如图6所示)。本发明表达的H-NHase在50℃下的半衰期在 12min，在50℃处理40min也还能保持40％以上的酶活。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。