饮食品、补品和医药品等使用的特定多酚及其制造方法

摘要

本发明的目的是提供一种通过从多酚混合物精确地分离四聚体以上的多酚来制造较高纯度的四聚体以上的多酚的方法。本发明所述的特定多酚的制造方法为使用不含酸的洗脱液，从多酚混合物凝胶过滤分离四聚体以上的多酚。此外，所述凝胶过滤分离例如可以使用液相色谱或凝胶过滤色谱。

说明书

技术领域

本发明涉及在饮食品、补品和医药品等中有用的特定多酚及其制造 方法。

背景技术

人们都说，“多酚具有抑制被认为是癌症、动脉硬化等各种各样疾病 的原因的活性氧的作用”、“多酚具有抑制过敏的效果和缓解压力的效果 等”。因此，含有多酚的植物以及该植物的加工物和提取物等作为原料和 添加剂等被广泛使用于饮食品、补品和医药品等领域。特别是，与其他 植物相比，可可中含有丰富的多酚。因此，作为这样的原料、添加剂， 可可粉末、可可提取物等特别引人注目。

作为源自可可的多酚(以下简称“可可多酚”)，例如可以列举单体 儿茶素、二聚体的原花青素B2、三聚体的原花青素C1、四聚体的桂皮 鞣质A2等。

可是，一直以来，能够对活体产生上述各种各样的作用和效果的多 酚，在可可多酚中，被认为是可由肠道吸收的聚合度为3以下(即单体、 二聚体和三聚体)的多酚成分。正因为如此，过去有人提议“从可可多 酚分离(±)-儿茶素、(±)-表儿茶素以及它们的原花青素(包含二聚体、 三聚体)的方法”(例如，日本公表特许公报2009-501161号等)，有人 提议“从可可多酚提取分离‘儿茶素、表儿茶素以及它们的原花青素’ 或‘高级原花青素’的方法”(例如，日本公表特许公报2003-535111号)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本公表特许公报2009-501161号公报

专利文献2：日本公表特许公报2003-535111号公报

发明内容

发明要解决的问题

然而，近年来已经明确四聚体以上的多酚也具有有益的作用、效果 或者用途。

于是，本发明的目的在于提供一种从多酚混合物精确地分离四聚体 以上的多酚来制造较高纯度的四聚体以上的多酚的方法。

解决问题的手段

本发明的第一方面涉及特定多酚的制造方法，所述方法使用不含酸 的洗脱液(以下简称“不含酸洗脱液”)，从多酚混合物凝胶过滤分离四 聚体以上的多酚。另外，这里所说的“多酚”是指具有多个酚羟基的植 物成分的总称。并且，这里所说的“多酚混合物”例如是可可提取物。 进而，四聚体以上的多酚(以下简称“特定多酚”)优选四聚体以上的原 花青素。另外，“原花青素”是指儿茶素、表儿茶素等儿茶素类的低聚体。 并且，多酚或者原花青素的聚合度的上限优选20。此外，凝胶过滤分离 例如可以使用液相色谱(包括高效液相色谱)、凝胶过滤色谱。此外，此 时作为凝胶过滤材料，优选使用化学结合有甘油丙基(グリセロプロピル 基)的硅胶颗粒。

另外，在该特定多酚的制造方法中，凝胶过滤分离优选使作为洗脱 液的不含酸洗脱液的组成发生变化。并且，优选使不含酸洗脱液的组成 发生至少四个阶段的变化。可以有效地抑制在该特定多酚中混入三聚体 以下的多酚。

本申请发明者们深入研究的结果表明，利用该特定多酚的制造方法， 从多酚混合物精确地分离四聚体以上的多酚，可以制造较高纯度的四聚 体以上的多酚。此时，该特定多酚优选不含儿茶素、表儿茶素和三聚体 以下的原花青素。但是，这意味着“实质上”不含有儿茶素、表儿茶素 和三聚体以下的原花青素。总之，也可以说，该特定多酚是如下多酚混 合物：“四聚体以上的多酚的总质量”相对于“儿茶素、表儿茶素和三聚 体以下的多酚的总质量”的比例为9以上、优选10以上、较优选11以 上、更优选12以上。另外，这一比例的上限是无限大(∞)，这一比例 越高越好，然而，例如，这一比例的上限为100。

本发明的第二方面涉及特定多酚，所述特定多酚中，三聚体以下的 多酚含量在10质量％以下。另外，优选三聚体以下的多酚含量在9质量％ 以下、较优选8质量％以下、更优选7质量％以下、特别优选6质量％以 下、最优选5质量％以下。

此时，作为多酚，例如，如果使用可可多酚，从其安全性和风味、 物质性质等的观点出发，特定多酚优选作为饮食品用原料(材料、组合 物)、补品用原料(材料、组合物)和医药品用原料(材料、组合物)等， 较优选作为饮食品用原料和补品用原料，更优选作为饮食品用原料。

附图说明

图1表示实施例1的凝胶过滤分离的结果图。

图2表示实施例2的凝胶过滤分离的结果图。

图3表示实施例2的凝胶过滤分离后各组分中含有的高聚合度原花 青素的含量的分析结果图，[a)可可提取物(CLPr)，b)低聚组分(CLPr-L)， c)高聚组分(CLPr-H)]。

图4表示比较例1的凝胶过滤分离的结果图。

具体实施方式

本发明实施方式的四聚体以上的可可原花青素(以下简称“高聚原 花青素”)可以由可可提取物经凝胶过滤分离得到。另外，该凝胶过滤分 离使用“不含酸的洗脱液”作为洗脱液。另外，可可提取物也可以购买 市场上销售的产品等，也可以通过公知的方法从可可豆、可可粉末提取。 可以用于本发明实施方式的“可可豆”不受产地、生长状况、有无焙烧 等限制。

凝胶过滤分离可使用高效液相色谱法(HPLC)、凝胶过滤色谱法 (GFC)等公知的手段。另外，从在实验室规模上操作的容易度和再现 性等的观点来看，优选使用HPLC，在得到与实验室规模同等分离效率 的范围内，也可以放大为中试规模(パイロットプラント規模)和工业生 产规模(実機規模)。在该情况下，作为凝胶过滤材料的一种实施方式， 优选使用正相分离用的“化学结合有甘油丙基的硅胶颗粒”，利用极性低 的分子先被洗脱(在本发明中，由聚合度低的多酚开始按顺序被洗脱) 的原理，实施HPLC、GFC等。

这里所说的“不含酸的洗脱液”意思是实质上不含洗脱液中通常添 加的乙酸、磷酸、甲酸、三氟乙酸等的洗脱液。另外，在本发明的实施 方式中，作为这样的洗脱液，适合使用例如乙腈、甲醇等极性有机溶剂、 水或者它们的混合溶液。另外，“不含酸”可以由实质上不影响三聚体以 下的可可多酚和四聚体以上的可可多酚(可可原花青素)的凝胶过滤分 离为基准进行判断。

实施例

接下来，通过实施例对本发明进行更详细地说明。然而，本发明不 仅限于以下实施例。另外，以下的术语“低聚”是指聚合度在1以上、3 以下(即单体～三聚体)的意思，术语“高聚”是指聚合度在4以上(即 四聚体以上)的意思。

实施例1

(1)原料溶液的配制

将厄瓜多尔原产的可可提取物(以下简称“CLPr”)溶解于甲醇水溶 液(50质量％)，使CLPr的浓度为30mg/ml。然后，将该CLPr溶液使用 孔径0.45μm的再生纤维素膜过滤，制备原料溶液。

(2)凝胶过滤分离

将高效液相色谱(以下简称“HPLC”)系统的环境条件按照以下所 示进行设定。然后，将50μl上述的原料溶液注入HPLC系统，将原料溶 液注入后的8分钟至16分钟的洗脱组分作为低聚组分(以下简称 “CLPr-L”)，将原料溶液注入后的17分钟至25分钟的洗脱组分作为高 聚组分(以下简称“CLPr-H”)，各自分离收集(参照图1)。如图1所 示，本实施例中，三聚体和四聚体的峰完全分离。因此，CLPr-L中，主 要含有儿茶素、表儿茶素以及它们的二聚体和三聚体；CLPr-H中，主要 含有四聚体以上的原花青素。也就是说，各组分中含有高聚原花青素的 含量、各组分的收率与下述实施例2的结果相同。另外，作为该分离点， 设定为CLPr-H尽可能地不含有儿茶素、表儿茶素以及它们的二聚体和三 聚体的原花青素的时间点。

(HPLC系统的环境条件)

装置：半制备液相色谱系统(日本岛津社制造，系统构成：2台 LC-6AD、CBM-20A、CTO-20A、SIL-10AF、SPD-20A、FRC-10A、LC  solution软件)

柱：Deverosil 100Diol-58.0×300mm

流速：2.4ml/分钟

检测波长：UV 280nm

洗脱液：乙腈和97质量％的甲醇水溶液

梯度：(97质量％的甲醇水溶液的质量％)0(0分钟)，20(4～9分 钟)，40(13～18分钟)，0(20～30分钟)

实施例2

(1)原料溶液的配制

与实施例1同样，配制CLPr。

(2)凝胶过滤分离

将HPLC系统的环境条件按照以下所示进行改变：将1960μl上述原 料溶液注入该HPLC系统。然后，将原料溶液注入后的45分钟至85分 钟的洗脱组分作为CLPr-L，将原料溶液注入后的90分钟至135分钟的 洗脱组分作为CLPr-H，除此之外，与实施例1同样，各自分离收集(参 照图2)。

(HPLC系统的环境条件)

装置：大量制备用液相色谱系统(日本岛津社制造，系统构成：2 台LC-8A、FCV-130AL、SIL-10AP、SPD-20AV、FRC-10A、LC solution 软件)

保护柱：Deverosil 100Diol-10 50×100mm

主柱：Deverosil 100Diol-10 50×300mm

流速：20.8ml/分钟

检测波长：UV 280nm

洗脱液：乙腈和97质量％的甲醇水溶液

梯度：(97质量％的甲醇水溶液的质量％)0(0分钟)，20(24～54 分钟)，40(78～108分钟)，0(120～180分钟)

(3)各组分中含有的高聚原花青素的含量分析

将上述CLPr-L和CLPr-H的各洗脱组分各收集2～4ml、在离心式蒸 发器中各自干燥固化。接着，使用100μl的甲醇水溶液(50质量％)，将 该干燥的各洗脱组分各自再次溶解，作为样品。

依据Kelm等的方法使用原花青素类正相HPLC测定法(参照Kelm, M.A.等人，J.Agric Food Chem 2006，54(5)；p.1571～1576)，以表儿茶素 当量对上述各样品进行分析，得到图3所示的分析图和表1所示的结果。

表1

CLPr-H中含有四聚体以上的原花青素90质量％以上。另一方面， CLPr-L中未检出四聚体以上的原花青素。另外，对于这些原花青素，以 反相HPLC分析方法为基准，以表儿茶素作成标准曲线，将各聚合度的 原花青素浓度换算为表儿茶素当量进行定量。

(4)各组分的收率

上述CLPr-L和CLPr-H的各洗脱组分在蒸发器中减压，除去有机溶 剂进行浓缩。然后，将该被浓缩了的洗脱组分使用超纯水清洗的同时转 移至金属容器，在-80℃冻干。然后，称量各洗脱组分的重量，求出CLPr-L 和CLPr-H各自的收率，CLPr-L的收率为33％，CLPr-H的收率为40％。 比较例1

(1)原料溶液的配制

与实施例1同样，配制CLPr。

(2)凝胶过滤分离

将HPLC系统的环境条件按照以下所示进行改变：将50μl上述原料 溶液注入该HPLC系统。然后，将原料溶液注入后的8分钟至18.5分钟 的洗脱组分作为CLPr-L，将原料溶液注入后的19分钟至30分钟的洗脱 组分作为CLPr-H，除此之外，与实施例1同样，各自分离收集(参照图 4)。如图4所示，本比较例中，三聚体和四聚体的峰接近。因此，CLPr-H 中较大量地含有儿茶素、表儿茶素以及它们的二聚体和三聚体的原花青 素，难以得到较高纯度的CLPr-H。

(HPLC系统的环境条件)

装置：半制备液相色谱系统(日本岛津社制造，系统构成：2台 LC-6AD、CBM-20A、CTO-20A、SIL-10AF、SPD-20A、FRC-10A、LC  solution软件)

柱：Deverosil 100Diol-58.0×300mm

流速：2.4ml/分钟

检测波长：UV 280nm

洗脱液：乙酸的乙腈溶液(2质量％)以及乙酸-甲醇水溶液(乙酸： 2质量％、甲醇：95质量％)

梯度：(乙酸-甲醇水溶液的质量％)0(0分钟)，40(18～23分钟)， 0(25～35分钟)

从实施例和比较例的结果的研究

将“表示实施例1以及实施例2的凝胶过滤分离结果的图1和图2” 与“表示比较例1的凝胶过滤分离结果的图4”对比可知，前者中，三聚 体的检出峰与四聚体的检出峰的时间间隔相比后者的时间间隔更长。因 此，可以认为，与以往相比，实施例1和实施例2分离得到了更高纯度 的高聚原花青素(即，四聚体以上的原花青素)。通常，为了从多酚粗提 物更精确地分离多酚，一般在凝胶过滤分离洗脱液中添加酸。对此，在 本实施例的凝胶过滤分离方法中，特意地不添加酸，由此可使三聚体的 检出峰和四聚体的检出峰的时间间隔变宽。于是，其结果可以得到高纯 度的高聚原花青素。

工业实用性

在本发明所述的特定多酚的制造方法中，可以得到高纯度的高聚可 可原花青素(即，四聚体以上的可可原花青素)。另外，本发明的特定多 酚的制造方法不限于从可可粉末和可可提取物通过凝胶过滤分离提取高 聚原花青素，也可从含有多酚的其他植物和饮食品等(例如，茶、果实 (葡萄、苹果、蓝莓等)、谷类(芝麻、大豆、荞麦等)或者它们的粉末 以及它们的提取物)通过凝胶过滤分离提取多酚时应用。

另外，经本发明的特定多酚的制造方法制造的高聚原花青素，例如 不仅可以作为血糖值控制剂等医药品等的有效成分使用，也可以添加于 饮食品、补品等中使用。另外，这些医药品等也可经口服给予，也可经 管给予，也可经肠给予。