FUWA基因及其应用

摘要

本发明公开了一种FUWA基因及其应用。本发明公开的一种蛋白，为如下（1）或（2）所示：（1）SEQ ID No.1所示的蛋白；（2）将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。与野生型水稻相比，FUWA基因表达抑制水稻的粒宽和粒厚显著增加，粒长减少，粒重增加，穗型由原来的松散穗型改变为紧凑且直立的穗型。细胞学观察表明FUWA基因表达抑制的水稻颖壳和穗基部横向细胞分裂显著增加。本发明对于进一步阐明植物花序和小花发育分子机理并通过基因工程手段培育优质、高产的作物新品种具有重要的理论意义和现实意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种FUWA基因及其应用。

背景技术

水稻是最重要的粮食作物之一，其养活了世界上近四分之一的人口。开展水稻遗 传与育种研究一直成为许多国家近年来的重点。随着近年来世界人口的持续增长和环 境的不断恶化，粮食产量增加却远远不能满足人类的需要。而作物产量形成遗传机制 研究可以促进高产分子育种研究。但截至目前，人们对作物产量的分子调控机制仍然 知之甚少。

水稻产量受到包括单位面积有效穗数、每穗粒数和千粒重三大因素影响，而千粒 重与水稻籽粒的粒形显著正相关。稻谷籽粒形状不仅是影响水稻产量的重要指标之一， 也是影响稻米的外观品质、商品品质和加工品质的重要因素。粒形在形成过程中受到 植物激素代谢及信号途径、植物发育和代谢途径以及表观遗传学途径等多种途径的调 控，通过调控植物组织的最终细胞数目以及碳、氮合成及运输使得种子最终形态得以 形成。在水稻中，粒形是受多基因控制的复杂数量性状，可分解为粒长、粒宽以及粒 厚，并且他们分别受到不同主效核基因的控制。

世界各地的消费者对稻米大小和形状的要求各不相同。美国、法国及欧洲的消费 者喜欢细长粒形稻米；在亚洲，印度喜欢长粒米，东南亚则喜爱中等或偏长粒形的米 粒，而在温带地区却是短粒米较受欢迎。在中国，长江以北喜爱吃短粒形粳米，长江 以南大部分地区喜欢长粒形籼稻米。因此，研究稻米粒形的遗传机理对培育满足不同 市场需求的优质水稻品种具有重要指导意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种FUWA基因及其应用。

本发明提供的一种蛋白，为如下（1）或（2）所示：

（1）SEQ ID No.1所示的蛋白；

（2）将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。

所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种：

1）SEQ ID No.2所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA 分子。

含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于 本发明的保护范围。

一种干扰载体也属于本发明的保护范围，该载体是将SEQ ID No.2中自5’末端 第965至1415位核苷酸所示的DNA片段插入pCUbi1390-△FAD2载体的KpnⅠ酶切位 点，得到中间载体；将SEQ ID No.2中自5’末端第965至1415位核苷酸所示的DNA 片段的反向互补序列插入中间载体的PstⅠ酶切位点，最终得到干扰载体。

一种改变植物籽粒性状的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：使植物 上述蛋白的表达或活性被抑制、或植物中上述任一所述编码基因的表达被抑制，进而 增加植物籽粒的粒宽、粒厚和/或粒重，和/或减少植物籽粒的粒长。

上述方法中，所述使植物上述蛋白的表达或活性被抑制、或植物中上述任一所述 编码基因的表达被抑制的方法包括如下步骤：将所述的干扰载体导入出发植物中，得 到转基因植物。

上述任一所述的方法中，所述植物为水稻。

抑制上述蛋白的表达或活性的物质在提高植物粒宽，粒厚，粒重，穗型紧凑、直 立程度和/或缩短粒长中的应用也属于本发明的保护范围；

和/或，

抑制上述任一所述的编码基因表达的物质在提高植物粒宽，粒厚，粒重，穗型紧 凑、直立程度和/或缩短粒长中的应用也属于本发明的保护范围；

所述植物具体为水稻。

上述干扰载体在提高植物粒宽，粒厚，粒重，穗型紧凑、直立程度和/或缩短粒长 中的应用也属于本发明的保护范围；

所述植物具体为水稻。

本发明的实验证明，与野生型水稻相比，FUWA基因表达抑制水稻的粒宽和粒厚显 著增加，粒长减少，粒重增加，穗型由原来的松散穗型改变为紧凑且直立的穗型。细 胞学观察表明FUWA基因表达抑制水稻的颖壳和穗基部横向细胞分裂显著增加。

本发明对于进一步阐明植物花序和小花发育分子机理并通过基因工程手段培育优 质、高产的作物新品种具有重要的理论意义和现实意义。

附图说明

图1为pCUbi1390-△FAD2载体图谱。

图2为野生型水稻Nipponbare与FUWA基因抑制表达水稻的表型。

图3为野生型水稻Nipponbare与FUWA基因抑制表达水稻的粒长、粒宽、粒厚以 及千粒重统计数据。

图4为转空载体水稻和FUWA基因抑制表达水稻的表型以及FUWA基因抑制表达检 测。

图5为野生型水稻Nipponbare和FUWA基因抑制表达水稻的颖壳和穗基部横向细 胞增殖情况。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

N6培养基购自美国PhytoTechnology Laboratories，货号为C167。

水稻品种Nipponbare（Oryza sativa）在文献“Zhou,S.,Wang,Y.,Li,W.,Zhao, Z.,Ren,Y.,Wang,Y.,Gu,S.,Lin,Q.,Wang,D.,Jiang,L.,Su,N.,Zhang, X.,Liu,L.,Cheng,Z.,Lei,C.,Wang,J.,Guo,X.,Wu,F.,Ikehashi,H.,Wang, H.,&Wan,J.2011.Pollen semi-sterility1encodes a kinesin-1-like protein  important for male meiosis,anther dehiscence,and fertility in rice.Plant  Cell,23(1):111-129”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

根癌农杆菌EHA105（Agrobacterium tumefaciens EHA105）在文献“Hood, Elizabeth E;Gelvin,Stanton B;Melchers,Leo S;Hoekema,Andre.1993.New  Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants.Transgenic Research, 2(4):p.208-218-218”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

pCUbi1390-△FAD2载体在文献“Mao B.,et al.2012.Wax crystal-sparse leaf2, a rice homologue of WAX2/GL1,is involved in synthesis of leaf cuticular wax. Planta，235:39–52”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

实施例1、FUWA基因RNA干扰载体pCUbi1390-△FAD2-FUWA的构建

一、FUWA基因的获得

提取野生型Nipponbare的总RNA并反转录为cDNA，以其cDNA为模板，以 FUWA-cds-F和FUWA-cds-R为引物进行PCR扩增，得到FUWA基因。FUWA蛋白的氨基酸 序列如SEQ ID No.1所示，FUWA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

引物如下：

FUWA-cds-F:5’-ATGGCCTCCCTCCTCCTCC-3’

FUWA-cds-R:5’-TCAGTACCTGTAGCCGCTGTCAG-3’

二、FUWA基因干扰片段的获得

（一）提取野生型水稻Nipponbare的14天幼苗的总RNA，反转录得到cDNA。

（二）以步骤（一）得到的cDNA为模板，用FUWA-sense-F和FUWA-sense-R组成 的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物。

引物如下：

FUWA-sense-F:5’-TTACTTCTGCACTAGGTACCAACTTGTTATTGAAGGGGTGGG-3’；

FUWA-sense-R:5’-TAGAGCTCAGGCCTGGTACCTCACTGTAGTCTGCGGGCTTC-3’。

（下划线所示序列为KpnⅠ酶切识别位点）

（三）以步骤（一）得到的cDNA为模板，用FUWA-antisense-F和FUWA-antisense-R 组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物。

引物如下：

FUWA-antisense-F:5’-TTGCTTTTGGTTTTCTGCAGTCACTGTAGTCTGCGGGCTTC-3’；

FUWA-antisense-R:5’-CTGCACCCATGTTTCTGCAGAACTTGTTATTGAAGGGGTGGG-3’。

（下划线所示序列为PstⅠ酶切识别位点）

三、干扰载体的构建

（一）用限制性内切酶KpnⅠ酶切pCUbi1390-△FAD2载体，回收约12060bp的线 性质粒，得到载体大片段，pCUbi1390-△FAD2环状载体图谱如图1所示。

（二）KpnⅠ酶切步骤二的（二）得到的PCR产物，得到基因片段；将基因片段与 步骤（一）得到的载体大片段连接，得到重组质粒，记作pCUbi1390-△FAD2 -sense-FUWA。

（三）用限制性内切酶PstⅠ酶切重组质粒pCUbi1390-△FAD2-sense-FUWA，回 收约12689bp的线性质粒，得到载体大片段。

（四）PstⅠ酶切步骤二的（三）得到的PCR产物，得到基因片段；将基因片段与 步骤（三）得到的载体大片段连接，得到重组质粒，记作pCUbi1390-△FAD2-FUWA。

根据测序结果，对重组质粒pCUbi1390-△FAD2-FUWA进行结构描述如下：骨架载 体为pCUbi1390-△FAD2载体，在其KpnⅠ酶切位点插入了SEQ ID No.2中自5’末端 起第965至1415位核苷酸所示的DNA片段，在其PstⅠ酶切位点插入了SEQ ID No.2 中自5’末端起第965至1415位核苷酸所示的DNA片段的反向互补序列。

实施例2、转基因水稻的获得

一、将重组质粒pCUbi1390-△FAD2-FUWA导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆 菌EHA105/pCUbi1390-△FAD2-FUWA。

二、FUWA基因抑制表达水稻的获得

将EHA105/pCUbi1390-△FAD2-FUWA转入水稻Nipponbare（Oryza sativa）（以 下简称野生型水稻）胚的愈伤组织中，具体步骤如下：

（一）用含50μmol/L卡那霉素的液体LB培养基悬浮重组农杆菌 EHA105/pCUbi1390-△FAD2-FUWA，得到OD_600nm≈0.5的菌悬液。

（二）取野生型水稻的成熟胚愈伤组织与步骤（一）得到的菌悬液混合，侵染30min， 用滤纸吸干菌液后将愈伤组织放置于共培养培养基（含0.03924mg/L乙酰丁香酮的固体 N6培养基）上，24℃培养3天。

（三）将步骤（二）得到的愈伤接种至含150mg/L G418的固体N6培养基上，24℃ 培养16天。

（四）取步骤（三）得到的健康愈伤组织，接种至含200mg/L G418的固体N6培养 基上，24℃培养，每15天继代一次。

（五）取步骤（四）得到的健康愈伤组织，接种至分化培养基（含150mg/L G418、 2mg/L激动素、0.05mg/L萘乙酸的固体N6培养基）上，24℃培养45天（此时植株地上 部分高度约为15cm），打开瓶口炼苗3天，然后移栽至温室栽培，即为T₀代植株。

（六）将T₀代植株自交，收获种子并培育为植株，即为T₁代植株。

（七）提取T₀代植株和T₁代植株的基因组DNA。

（八）分别以步骤（七）得到的T₀代植株和T₁代植株的基因组DNA为模板，以 1390-F和FAD2-R为引物进行PCR扩增。

引物如下：

1390-F：5'-TGCCTTCATACGCTATTTATTTGC-3'；

FAD2-R：5'-GAAGCGACGGACCTGGAGAT-3'。

1390-F对应于图1的10707-10730bp,FAD2-R引物对应于图1中的第 10827-10846bp,如果PCR扩增出大小约为728bp的条带，则说明为植株为阳性转基因 植株。

对于某一T₀代植株，如果该植株及其T₁代植株PCR鉴定均为阳性，该植株为纯合 的FUWA基因抑制表达植株，该植株及其自交后代为一个FUWA基因抑制表达株系，共 得到10个FUWA基因抑制表达株系。

三、转空载体水稻的获得

用pCUbi1390-△FAD2载体代替重组质粒pCUbi1390-△FAD2-FUWA进行步骤一和步 骤二，得到转空载体（pCUbi1390-△FAD2）的水稻。

四、植株的mRNA表达量的检测

为了验证转基因后代的FUWA基因被抑制程度，利用实时定量PCR来检测野生型水 稻、转空载体（pCUbi1390-△FAD2）的水稻以及FUWA基因抑制表达株系体内FUWA基 因的表达情况。实时定量PCR在定量PCR仪（7900real-time，Applied Biosystems） 上按照Applied Biosystems提供的操作步骤进行，以水稻Ubiqutin基因作为反 应中的内参。引物在60℃退火，反应40个循环，每个样品设置三个重复。反应体 系为25μl，其中包括2μl各植株的mRNA的反转录产物、0.25μM的正反向引物 和12.5μl SYBRGreen混合物（购自Takara）。

实时定量PCR鉴定所使用的引物如下：

Qrt-F：5'-AGCAACATTGTGCGAATAACTCC-3'；

Qrt-R：5'-TTCCTGTATCATCCACGGCAA-3'。

结果表明，与野生型水稻、转空载体的水稻相比，FUWA基因抑制表达株系中的FUWA 基因被显著抑制。

实施例3、水稻的表型以及农艺性状的统计

一、将FUWA基因抑制表达T2代株系的水稻和转空载体的水稻在抽穗灌浆后，对水 稻的形状、粒形和穗型进行性状考察和拍照。

结果如图2所示。

图2中，WT代表野生型水稻；fuwa代表FUWA基因抑制表达T2代株系。

图2A为水稻的形状，图2B为水稻的粒形，图2C为水稻的穗型。

图2表明，与野生型水稻相比，FUWA基因抑制表达水稻的穗型紧凑且直立，稻粒 的粒宽显著增加，粒长减少。

二、当各水稻籽粒成熟后，收获烘干后在室温下保存3个月，集成糙米，用于稻米 粒长测定。

参照《中华人民共和国国家标准》GB/T17981-1999，进行水稻糙米和稻谷的粒型测 定，重复3次，取平均值作为性状表型值。

随机挑选各水稻1000粒饱满水稻稻粒，用千分之一电子天平称重，重复三次，取 平均值作为千粒重表型值。

结果如图3所示。

图3中，WT代表野生型水稻；fuwa代表FUWA基因抑制表达T2代株系。

图3J为稻粒的粒长，图3K为稻粒的粒宽，图3L为稻粒的粒厚，图3M为1000粒 饱满水稻稻粒的千粒重。

图3表明，与野生型水稻相比，FUWA基因抑制表达水稻的粒长显著减少、稻粒的 粒宽、粒厚以及粒重显著增加。

三、对实施例2得到的转空载体pCUbi1390-△FAD2的水稻以及三株编号为GR-5、 GR-7和GR-10的FUWA基因抑制表达T₂代株系进行上述实验，部分结果如表1与图4所 示。

表1转基因植株后代粒型相关性状的统计

图4中，Vector代表转空载体pCUbi1390-△FAD2的水稻。

图4A为稻粒的表型，图4C为水稻的穗型。

结果表明，与转空载体pCUbi1390-△FAD2的水稻相比，FUWA基因抑制表达水稻的 粒宽显著增加，粒长显著减少并且穗型紧凑且直立。

按照实施例2中步骤四的方法对各组水稻的FUWA基因的表达水平进行检测，结果 如图4B所示。

图4B表明，FUWA基因抑制表达水稻中的FUWA基因被有效抑制。

以上实验表明，与野生型水稻和转空载体的水稻相比，FUWA基因表达抑制水稻的 粒宽和粒厚显著增加，粒长减少，粒重增加，且穗型由松散穗型改变为紧凑且直立的 穗型。

四、利用石蜡切片在细胞学水平观察野生型水稻Nipponbare和FUWA基因抑制表达 水稻的颖壳和穗基部横向细胞增殖情况

将野生型水稻Nipponbare和FUWA基因抑制表达T2代株系的抽穗前15天的颖壳和第 一茎节组织浸入FAA固定液中，真空抽气后固定24h以上。梯度酒精脱水，二甲苯透明， 随后用石蜡（Paraplast Plus,购自Sigma）将二甲苯完全置换，利用包埋机（Leica  EG1150）将样品包埋于蜡块中。根据材料幼嫩的程度，用切片机（Leica RM2265）将 组织切成8-10μm的薄片，切片用0.025%的甲苯胺蓝溶液染色30min左右，灭菌水漂洗 两次后镜检，拍照。利用ImagJ软件对颖壳和茎节最外层细胞数以及周长进行统计。

结果如图5所示。

图5中，WT代表野生型水稻；fuwa代表FUWA基因抑制表达T2代株系。

图5A和5B分别为野生型水稻的颖壳横切面及其对应的局部放大图。

图5C和5D分别为FUWA基因抑制表达T2代株系的颖壳横切面及其对应的局部放大 图。

图5E和5F分别为野生型水稻的第一茎节间横切面及其对应的局部放大图。

图5G和5H分别为FUWA基因抑制表达T2代株系的第一茎节间横切面及其对应的局 部放大图。

图5表明，与野生型水稻相比，FUWA基因抑制表达水稻的颖壳与茎节的细胞数目明 显增加。