OR4F3与OR4F17在制备HBV相关疾病诊断试剂盒中的应用

摘要

本发明涉及医学生物检测技术领域，本发明提供了OR4F3与OR4F17的新用途，具体是在制备HBV相关疾病诊断试剂盒中的应用，本发明进一步提供了一种利用针对OR4F3和OR4F17的定量PCR检测来进行HBV相关疾病诊断的试剂盒和检测方法。本发明的试剂盒和检测方法简便，可靠，周期短，特异性高，易于临床推广。

说明书

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术领域，尤其涉及OR4F3与OR4F17在制备 HBV相关疾病诊断试剂盒中的应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是一种嗜肝性复合体DNA病毒。已 有的研究表明，HBV只对人和猩猩有易感性。HBV感染后可导致慢性或急 性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)，而慢性肝炎感染是导致肝硬化(liver  cirrhosis，LC)、肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)和肝衰竭(liver failure， LF)的主要病因。其中肝癌是仅次于食道癌、胃癌的第三大常见恶性肿瘤， 严重危害人们的健康。从全世界范围来看，肝癌的发病率位居第六位，死亡 率位居第三位。中国约有9400万的慢性乙肝患者，每年有将近30万人死于 肝癌。

HBV相关疾病，是指HBV感染后引发的相关疾病，包括但不限于乙肝 肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌等。这些肝病中尤其是肝癌的诊断对其治疗 效果及生存质量有极为重大的意义。有研究指出，通过外周血相关指标检测 出来的早期肝癌，其治疗效果较好，生存率有明显提升，对患者生存质量影 响较小。但是对于晚期肝癌患者，其治疗后不仅生存率没有提高，反而对患 者生活质量产生较大的影响。所以，肝癌的治疗成功与否，与早期诊断是否 成功有较大联系。

目前公认的肝癌诊断指标是甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)。甲胎蛋白 在婴幼儿及肝癌患者肝组织内含量较多，而正常人肝组织内含量较少，是成 熟的肝癌诊断指标。但是其受试者工作特征曲线线下面积(area under curve， AUC)也不过在81％左右。

人类嗅觉受体基因家族是人基因组中规模最大的基因家族，OR4F3与 OR4F17为嗅觉受体基因家族的成员。嗅觉受体蛋白属于G蛋白偶联受体 (GPCR)，具有7次跨膜结构域的结构，并且负责识别和介导与气味有关的 信号转导的。有研究证明嗅觉受体相关基因在前列腺癌中发生变异，并且与 前列腺癌的发生发展有关，对前列腺癌有一定的预示作用([1]Bettina Malnic, Paul A.Godfrey,and Linda B.Buck.The human olfactory receptor gene family. PNAS.Vol.101,no.8,2584-2589；[2]Elena Linardopoulou et.al.Transcriptional  activity of multiple copies of a subtelomerically located olfactory receptor gene  that is polymorphic in number and location.Human Molecular Genetics,2001,Vol. 10,No.21.2373-2383；[3]Weng J,Wang J,Hu X,et al.PSGR2,a novel  G-protein coupled receptor,is overexpressed in human prostate cancer. International journal of cancer Journal international du cancer  2006；118(6):1471-80doi:10.1002/ijc.21527)。

目前尚无OR4F3与OR4F17应用于HBV相关疾病，特别是肝癌诊断的 文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供HBV相关疾病的诊断标志物，本发明的目的也 在于提供OR4F3与OR4F17的新用途，即在制备HBV相关疾病诊断试剂盒 中的应用。

本发明的第一方面，提供了OR4F3与OR4F17作为HBV相关疾病诊断 标志物的应用。

本发明的第二方面，提供了OR4F3与OR4F17在制备HBV相关疾病诊 断试剂或诊断试剂盒中的应用。

本发明所述的OR4F3与OR4F17的信息如下所示：

OR4F3：Chromosome 5,NC_000005.10(181367287..181368225)；

OR4F17：Chromosome 19,NC_000019.10(107152..111690)。

本发明所述的OR4F3与OR4F17在制备HBV相关疾病诊断试剂或诊断 试剂盒中的应用，所述的诊断试剂，为检测生物样品中OR4F3的含量、 OR4F17的含量的试剂的组合。

所述的诊断试剂盒，包含了检测生物样品中OR4F3的含量、OR4F17的 含量的试剂。

所述的检测生物样品中检测生物样品中OR4F3的含量、OR4F17的含量 的试剂，选自：对OR4F3、OR4F17具有检测特异性的PCR引物。

所述的对OR4F3与OR4F17具有检测特异性的PCR引物如下：

所述的生物样品选自：获自对象的外周血。

所述的HBV相关疾病，HBV相关疾病，是指HBV感染后引发的相关 疾病，包括但不限于乙肝肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌等。

本发明的第三方面，提供了一种HBV相关疾病的诊断试剂盒，该试剂 盒包含了检测生物样品中OR4F3的含量、OR4F17的含量的试剂。

本发明所述的HBV相关疾病的诊断试剂盒，是由反转录系统、引物系 统和扩增系统组成，所述的引物系统包括：

对OR4F3与OR4F17具有检测特异性的PCR引物：

所述的生物样品选自：获自对象外周血。

所述的HBV相关疾病，HBV相关疾病，是指HBV感染后引发的相关 疾病，包括但不限于乙肝肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌等。

本发明提供了一种HBV相关疾病的诊断试剂盒。

本发明的诊断试剂盒，是基于基因组DNA定量PCR检测的HBV相关 疾病诊断试剂盒，可以通过定量PCR技术准确计算血液基因组中OR4F3与 OR4F17的拷贝数。

本发明的第四方面，提供了一种利用上述诊断试剂盒进行HBV相关疾病 的检测方法，所述的检测方法如图1所示，具体包括以下步骤：

1.抽提血液基因组总DNA；

2.利用引物对OR4F3与OR4F17的拷贝数进行定量检测的试剂，所述的引 物为SEQ ID NO:1～4所示；

3.计算出OR4F3与OR4F17的拷贝数；较优的可以利用仪器自带软件产生 的标准曲线换算出血液基因组OR4F3与OR4F17拷贝数的配套计算软件。

用本发明的试剂盒、检测方法，抽提样品外周血基因组中总DNA，利用 试剂盒首先检测OR4F3的拷贝数。其中当血液基因组中OR4F3的拷贝数 <15.66/ml时，样本有99.94％的可能性为正常；当血液基因组中OR4F3的拷 贝数的拷贝数>56.08/ml时，样本有93.21％的可能性为肝炎；当血液基因组 中OR4F3的拷贝数的拷贝数>56.08/ml<15.66/ml时，样本有49.43％的可能性 为肝炎，50.67％的可能性为肝癌。而对于OR4F3的拷贝数在15.66/ml与 56.08/ml之间的样本，测定其OR4F17的拷贝数，当OR4F17的拷贝数 <14.28/ml时，样本有77.92％的可能性为肝癌，22.08％的可能性为肝炎；当 OR4F17的拷贝数>14.28/ml时，样本有98.18％的可能性为肝炎(见图2)。

本发明的有益保障及效果如下：

申请人从合作的东方肝胆医院外科医院取得了大量的HBV相关病人的 外周血标本，为本发明的研究提供了有力的保障。

就技术而言，OR4F3与OR4F17的检测本质上是一种血液基因组的定量 PCR检测，具有操作简便、检测灵敏、特异性好、重复性高等特点，现今已 越来越多地被应用于临床检验技术中。

我们所采用基本检测方法是定量PCR，这一技术在现代实验诊断学中已 被证实是高灵敏度、高准确度的检测方法，试验技术已经十分成熟。并且我 们采用的是这一技术中的标准曲线定量法，可以准确地对各种样品中特点核 酸分子做精确定量。

而且本发明所涉及的两种指标OR4F3与OR4F17，其AUC值分别为 81.1458％和90.7262％，相比于甲胎蛋白，其临床参考价值和可信度较高。所 以，此种检测试剂盒，可以提高家族性肝癌的检出率和准确率，对于家族性 肝癌的临床治疗有着重大的意义。

本发明提供了一种以定量PCR为基础的家族性肝癌检测试剂盒，可以通 过检测病人外周血基因组DNA中嗅觉基因OR4F3与OR4F17的拷贝数来对 HBV相关疾病做出诊断。其检测方法特别简便、周期短、灵敏度高，是现行 检测试剂的有效补充。

附图说明

图1：通过检测血液基因组中嗅觉基因OR4F3与OR4F17的拷贝数来诊断HBV 相关疾病的示意图；其中A：获取待检测病人的外周血；B：利用离心法获取 血细胞；C：获取外周白细胞；D：抽提总DNA；E：利用特异引物对DNA进 行扩增；F：利用标准曲线对扩增结果进行分析；G：相关扩增曲线。

图2：用本发明试剂盒的检测结果；A:OR4F3作为诊断指标的阈值；B: OR4F17作为诊断指标的阈值。

图3：在乙肝肝炎(CHB)患者外周血标本、肝硬化(LC)患者外周血标本 和乙肝肝癌(HBV-HCC)患者外周血标本中测得的OR4F3与OR4F17两个基因 的拷贝数。

图4：血液样本的采集、处理照片；其中圆圈处代表淋巴细胞。

图5：正常人与HBV相关患者血液基因组中OR4F3(A)与OR4F17(B) 基因拷贝数的差异检测结果。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于 此。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中 未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克 隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中 所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说 明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：

前期我们利用高通量的比较基因组杂交芯片(comparative genome  hybridization，CGH)筛选得到了在乙肝肝癌患者外周血基因组上拷贝数高度 变异的基因，即OR4F3与OR4F17。

然后我们收集了5例正常人外周血标本作为对照，10例乙肝肝炎(CHB) 患者外周血标本，10例肝硬化(LC)患者外周血标本和10例乙肝肝癌 (HBV-HCC)患者外周血标本,提取基因组DNA，设计引物进行了PCR验证， 结果发现与对照相比较，OR4F3与OR4F17两个基因的拷贝数在已测样本中 均有不同程度的明显升高(见图3)。

结果提示OR4F3与OR4F17可能参与了乙肝肝癌的发生发展，并对HBV 相关疾病有一定的预示作用。

实施例2：

一、血液样本的采集、处理及提取其中的全基因组DNA。

(1)血液样本收集：收集约5ml HBV相关病人的外周血放入含EDTA的抗 凝管中，静置约1小时。

(2)血液样本处理：采集的外周血样品用预冷的PBS稀释一倍，缓慢加到 2倍样本体积的淋巴细胞分离液之上，2000rpm离心30min，取中间乳白色 分层分装于EP管中(如图4所示，圆圈处代表淋巴细胞)，进行下一步处理。

(3)提取全基因组DNA：取步骤(2)中处理得到的淋巴细胞，按照从Qiagen 公司购买的D70K PureGene DNA isolation kits提取全基因组DNA。

二、引物设计与筛选

(1)引物设计：利用NCBI查得OR4F3(NC_000005.10)与OR4F17 (NC_000019.10)的全长序列，针对全长序列利用Primer Premier 5软件设 计PCR的上下游引物2对(如表1所示)，由生工公司负责引物合成。

表1：用于检测血液基因组中OR4F3与OR4F17设计的2对引物

名称 序列 R-H-OR4F3-DNA-F CCAGCTCCTCCTCCTAGTGT R-H-OR4F3-DNA-R CATCTCCACACCACCAACGA R-H-OR4F17-DNA-F TGGTGTGCTCACTGTGTGTT R-H-OR4F17-DNA-R TGGACAGAGCTTTGGACGAC

表2：定量PCR配方为

成分 体积 SYBRgreen PCR Master Mix 10ul DNA模板 0.5ul 引物(各20mM) 0.5ul 水 9ul

表3:定量PCR反应条件为

三、正常人与HBV相关患者血液基因组中OR4F3与OR4F17基因拷贝数的 差异检测。

按照上述方法，用筛选出的引物对20例正常人血液基因组标本与100例 CHB、100例LC和100例HBV-HCC患者血液基因组标本OR4F3与OR4F17 基因的拷贝数进行检测，结果发现与20例正常人标本相比，100例CHB患者 标本中OR4F3与OR4F17基因的拷贝数有明显的升高，100例LC与100例 HBV-HCC患者标本OR4F3与OR4F17基因的拷贝数也有升高，但低于CHB 患者标本(见图5)。

这一结果提示：OR4F3与OR4F17可作为HBV相关疾病的诊断标志物使 用；OR4F3与OR4F17可能成为AFP在肝癌诊断方面必要和有益的补充。

四、用本发明试剂盒的检测结果与HBV相关疾病的相关性如下：

抽提样品外周血基因组中总DNA，利用试剂盒首先检测OR4F3的拷贝 数。其中当血液基因组中OR4F3的拷贝数<15.66/ml时，样本有99.94％的可 能性为正常；当血液基因组中OR4F3的拷贝数的拷贝数>56.08/ml时，样本 有93.21％的可能性为肝炎；当血液基因组中OR4F3的拷贝数的拷贝 数>56.08/ml<15.66/ml时，样本有49.43％的可能性为肝炎，50.67％的可能性 为肝癌。而对于OR4F3的拷贝数在15.66/ml与56.08/ml之间的样本，测定 其OR4F17的拷贝数，当OR4F17的拷贝数<14.28/ml时，样本有77.92％的 可能性为肝癌，22.08％的可能性为肝炎；当OR4F17的拷贝数>14.28/ml时， 样本有98.18％的可能性为肝炎(见图2)。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不 限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下 还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请 权利要求所限定的范围内。