成年大鼠海马神经元体外分离培养方法

摘要

一种成年大鼠海马神经元体外分离培养方法，包括以下步骤：包被培养板；分离大鼠脑；分离海马；制备细胞悬液；神经元进一步纯化；细胞接种；体外原代培养。本发明的目的在于提供一种高纯度、高活性海马神经元的获取(分离、纯化)以及适用于成年大鼠海马神经元体外长期培养的流动式培养体系的构建。

说明书

技术领域

本发明本发明属于生命科学/神经生物学技术领域，具体涉及一种在体外分离培养成年大鼠海马神经元的方案。

背景技术

神经元是构成神经系统结构与功能的基本单位。大鼠脑神经元体外原代培养已被广泛用作中枢神经系统生理、病理研究模型。然而在目前的研究中，绝大多数报道集中在胎鼠或新生鼠神经元的培养。取自成年鼠的神经元因在体外培养难度较大，报道不多。

已有研究表明，胚胎/新生神经元与成体神经元在药理、电生理、发育、再生以及病理特征等诸多方面的表现并不相同。某些与年龄密切相关的疾病例如阿兹海默症、帕金森症等限制了原代胚胎/新生神经元模型在成体神经退行性疾病研究领域的应用。

海马是大脑内侧颞叶的一个脑区，在陈述性学习和记忆中起关键作用，很多认知功能异常均与海马脑区相关，例如阿兹海默症、癫痫等。目前普遍使用的大鼠海马脑区神经元分离培养方法如下：首先将大鼠麻醉处死，迅速将脑剥离出来置于冰上预冷的缓冲液内，然后将海马剥离出来并结合酶消化及机械吹打将海马组织分散为单个细胞，经过滤、离心后去除细胞碎片等杂质，然后将细胞沉淀重悬于Neurobasal A/B27培养基，并按照适宜的接种密度接种于事先包被好多聚赖氨酸的细胞培养板内，置于37℃、5％CO₂培养箱静置培养。4-6小时后首次换液，之后每隔2-3天换液。

然而，上述方法分离培养的成年大鼠海马神经元存在细胞纯度低、活力差、难以进行长时间培养等诸多问题。究其原因主要是在成体神经元的分离过程中，很容易破坏神经元的轴突及树突等突起，破坏神经元胞体间的紧密连接以及不同神经元相互交联形成成千上万个突触结构，使得它们在体外人工培养条件下难以再生。

体外培养的终极目标是为细胞提供一个尽可能模拟体内生理条件的生长环境。在正常生理条件下，组织和器官内的循环系统是动态的，细胞始终处于血液循环和淋巴循环的持续灌流之下，两者协同作用确保细胞营养物质的持续更新以及代谢废弃物的及时清除。而在传统的体外培养体系内，神经元被置于37℃、5％CO₂培养箱内静置培养，培养基并不会围绕神经元循环流动或持续灌流，导致体外培养的神经元成为一个主要依赖分子扩散运动的静置模型，神经元营养物质的更新及代谢废物的清除主要是依靠频繁的人工换液来实现，而培养液的更换导致细胞所处外界环境不稳定，极有可能引发细胞代谢休克。

此外，研究还表明成体神经元的健康存活还依赖于其自身代谢分泌至周围环境中的营养因子。而传统的神经元培养方法，通常是每隔2-3天更换一次新鲜培养液以保证神经元的营养供给。频繁换液导致神经元代谢分泌到培养液中的神经营养因子大量流失，影响神经元体外长期培养。

现有的神经元体外原代培养模型普遍存在以下四个问题：(1)纯度低。所培养的神经元往往混杂有神经胶质细胞等其他细胞类型；(2)活性差。由于成体神经元在分离的过程中，轴突、树突、神经元胞体间紧密连接以及不同神经元相互交联形成的突触结构均遭到严重破坏，体外再生困难；(3)无法长期培养。目前已有的人工设定的体外培养环境无法满足神经元长期培养的需要；(4)静态模型。无法真实模拟体内生理条件，营养物质更新及代谢废物排除主要依靠分子的扩散运动及频繁换液来实现。

发明内容

基于以上的问题，本发明的目的在于提供一种高纯度、高活性海马神经元的获取(分离、纯化)以及适用于成年大鼠海马神经元体外长期培养的流动式培养体系的构建。

一种成年大鼠海马神经元体外分离培养方法，包括以下步骤：

(1)包被培养板 

配制浓度为100ug/ml多聚-D-赖氨酸溶液包被细胞培养板过夜，1ml/孔；吸去多余的多聚赖氨酸，加入无菌水漂洗一次；吸弃95％无菌水，然后将培养板置于超净工作台内自然风干备用。

(2)分离大鼠脑 

戊巴比妥钠(40mg/kg，腹腔注射)深度麻醉、断头，然后用70％乙醇对大鼠头部进行表面消毒；迅速用冰上预冷的剪刀将大鼠头部皮毛剪开，暴露颅骨；换一把干净的冰上预冷的剪刀从头颈部开始沿颅骨中缝一直剪到嗅球前端，将颅骨及脑膜剪开，然后小心将左右两半颅骨向左向右掀起掰断，暴露出脑；使用头部扁平的解剖铲小心地沿颅腔底将大鼠脑迅速掀起取出，置于冰上预冷的盛有培养基I的35mm培养皿内；整个分离脑的过程不超过3分钟。

(3)分离海马

取一个干净的冰上预冷的60mm培养皿，内置一张浸润有培养基I的无菌滤纸，将步骤2分离出的大鼠脑转移到滤纸上；根据Bregma点确定好海马的具体位置，用尖端很细的镊子小心地将覆盖在海马上方的大脑皮层挑破掀起，暴露海马；小心将海马剥离出来，放置于新的冰上预冷的盛有2ml培养基I的35mm培养皿内；整个分离过程不超过1分钟。

(4)制备细胞悬液 

取一个50ml离心管，配制蛋白酶，备用；取海马组织薄片，备用；将海马组织薄片迅速转移至盛有蛋白酶溶液的50ml离心管内，摇匀，然后置于37℃ CO₂培养箱内孵育30min，每隔三分钟摇动一次；孵育完毕后，将离心管取出，加入2ml培养基I终止消化；进行吹打，重复两次并将上清一并转移至15ml离心管内。

(5)神经元进一步纯化

配置分离液，分别取6ml步骤3的细胞悬液，小心地转移到分离液最上方，在22℃，800g条件下离心15min；离心完毕后，出现分层，共五层，用移液枪将第四层收集起来转移至一个冰上预冷的15ml离心管内；往上述15ml离心管内加入培养基I，22℃，200g离心2min；弃上清液，用手指轻弹管底沉淀，然后用8ml培养基2重悬，摇匀；并进行细胞活力检测。

(6)细胞接种

按照4.61×10⁴cells/圆玻片的接种密度接种于步骤1培养板内预先包被好的12mm盖玻片上，然后置于37℃，5％CO₂培养箱内孵育4小时后首次更换培养基。

(7)体外原代培养 

搭建流动式体外培养体系，整个体系必须在37℃，5％CO₂培养箱内运行；之后每隔10天换液一次。 

优选地，所述培养基I为培养基。

优选地，步骤五所述培养基П为0.5mM L-Gln，10ng/ml FGF2和双抗的Neurobasal A/B27的混合物。

优选地，所述双抗为100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素。

优选地，步骤四所述蛋白酶为2mg/ml的木瓜蛋白酶和DNA酶混合物。 

优选地，步骤五所述分离液为OptiPrep^TM密度梯度分离液。

本发明的有益效果：使用预冷的培养基(Life Technologies)替代Hanks液来分离解剖大脑及海马组织。即使在冰浴条件下，神经元代谢活动依然在进行，Hanks液的无糖环境不利于大脑代谢，而培养基含有葡萄糖、无机盐、丙酮酸、氨基酸以及维生素等多种营养成分，适用于在外界CO2浓度下保存神经细胞及组织，最大程度地维持神经元活性；

其次，我们选用2mg/ml的木瓜蛋白酶与适量DNA酶配合替代普遍使用的胰蛋白酶对分离出来的海马组织进行消化。木瓜蛋白酶性质较为温和，不会消化过头，能够确保消化稳定性并提高神经元存活率。而DNA酶的作用是消除消化过程中裂解细胞释放的DNA，避免释放的 DNA与蛋白缠绕在组织块表面阻碍消化。另外，推荐使用培养基代替Hanks缓冲液配制木瓜蛋白酶，现配现用；

第三，我们使用OptiPrep^TM密度梯度离心法(SIGMA-ALDRICH)对神经元进行进一步纯化。与单纯离心法、细胞筛过滤与离心配合等方法相比，OptiPrep^TM密度梯度离心能够有效去除细胞碎片、少突胶质细胞、小胶质细胞等杂质。

第四，我们利用特殊的灌注细胞培养板(Reinnervate)、蠕动泵(World Precision Instruments)、Neurobasal培养基贮存瓶、三通阀、塑料软管、针头式过滤器(Millipore)等组建成一个流动式体外培养体系，用于培养成年大鼠海马神经元。不同于传统的静置培养模式，培养基在我们建立的体系内持续循环流动，持续灌流所培养的神经元。

最后，使用添加有10ng/ml FGF2的Neurobasal A/B27培养基培养分离的成年大鼠海马神经元，FGF2对于体外培养神经元活力维持以及神经元突起再生具有重要意义。

附图说明

图1为本发明一种成年大鼠海马神经元体外分离培养方法的OptiPrep^TM密度梯度离心分离示意图；

图2为本发明一种成年大鼠海马神经元体外分离培养方法的循环流动式体外培养体系结构示意图；

图3为本发明一种成年大鼠海马神经元体外分离培养方法与传统方法培养8天的成年大鼠海马神经元纯度对比示意图；

图4为本发明一种成年大鼠海马神经元体外分离培养方法的成年大鼠海马神经元在不同培养时期细胞活性对比示意图。

图中标号说明如下：1-细胞碎片，2-少突胶质细胞，3-神经元、细胞碎片及其他类型细胞等，4-神经元，5-沉淀，6-灌注培养板，7-三通阀，8-软管，9-针头式过滤器，10-瓶装培养基，11-蠕动泵。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

本发明旨在提供一套相对成熟的成年大鼠海马神经元分离及体外长期培养解决方案，关键点在于高纯度、高活性海马神经元的获取(分离、纯化)以及适用于成年大鼠海马神经元体外长期培养的流动式培养体系的构建。具体包括以下步骤：

一、包被培养板

1)首先将灌注培养板的进口管以及出口管分别装上无菌微型三通活塞，然后在培养板每个孔内铺上细胞培养专用的无菌圆形盖玻片，4片/孔；

2)取1mg多聚-D-赖氨酸溶于10ml无菌水配制成100ug/ml多聚-D-赖氨酸溶液(无菌水溶解)，用移液枪吸取1ml/孔加入到培养板内，轻轻转动培养板，让液体均匀覆盖板底的盖玻片，包被过夜；

3)吸去多余的多聚赖氨酸，加入无菌水漂洗一次；

4)吸弃95％无菌水，然后将培养板置于超净工作台内自然风干备用。

二、分离大鼠脑

1)称量大鼠体重，按照40mg/kg的戊巴比妥钠剂量(腹腔注射)深度麻醉大鼠、断头，然后用70％乙醇对大鼠头部进行表面消毒；

2)迅速用冰上预冷的剪刀将大鼠头部皮毛剪开，暴露颅骨；

3)换一把干净的冰上预冷的剪刀从头颈部开始沿颅骨中缝一直剪到嗅球前端，将颅骨及脑膜剪开，然后小心将左右两半颅骨向左向右掀起掰断，暴露出脑；

4)使用头部扁平的解剖铲小心地沿颅腔底将大鼠脑迅速掀起取出，置于冰上预冷的盛有培养基的35mm培养皿内；

整个分离脑的过程要迅速，不超过3分钟。

三、分离海马 

1)取一个干净的冰上预冷的60mm培养皿，内置一张浸润有培养基的无菌滤纸，将步骤2分离出的大鼠脑转移到滤纸上；

2)根据Bregma点确定好海马的具体位置，用尖端很细的镊子小心地将覆盖在海马上方的大脑皮层挑破掀起，暴露海马；

3)小心将海马剥离出来，放置于新的冰上预冷的盛有2ml培养基的35mm培养皿内；

整个分离过程要迅速，最好不超过1分钟。

四、制备细胞悬液

1)取一个50ml离心管，配制2mg/ml木瓜蛋白酶(取12mg木瓜蛋白酶溶解于6ml 培养基内)，并添加适量(500Units/ml)DNA酶，现配现用；

2)取一个新的冰上预冷的60mm培养皿，内置一张浸润有培养基的无菌滤纸，将海马重新转移到无菌滤纸上，用冰上预冷的锋利刀片将海马切成厚度约为 0.5mm左右的组织薄片；

3)将海马组织薄片迅速转移至盛有2mg/ml木瓜蛋白酶溶液的50ml离心管内，摇匀，然后置于37℃CO₂培养箱内孵育30min，每隔三分钟摇动一次。

4)孵育完毕后，将离心管取出，加入2ml培养基终止消化；

5)正确的吹打方法对于后续神经元培养是非常关键的，吹打力度太小的话很难将组织打碎，如果吹打太剧烈，将会使细胞裂解。用尖端剪掉一截的1ml移液枪头缓慢吸起组织块悬液，然后迅速打出，注意整个过程不要产生气泡。如此反复吹打10次，耗时约45s。

6)将吹打后的组织悬液静置1min，用移液枪将上清转移至一个新的15ml离心管内。往含有沉淀的离心管内重新加入2ml重复步骤5)和6)两次并将上清一并转移至15ml离心管内。

五、神经元进一步纯化

1)取4个5ml离心管，按照下表分别配制不同浓度的OptiPrep^TM分离液；

      

2)制备OptiPrep^TM密度梯度：取2个15ml离心管，分别加入1ml 1号OptiPrep^TM分离液，静置30秒。接着分别取1ml 2号OptiPrep^TM分离液小心加到1号分离液的上层，注意尽量不要打破1号分离液的界面，静置30秒。然后分别将1ml 3号OptiPrep^TM分离液小心加到2号分离液的上方，注意尽量不要打破2号分离液的界面，静置30秒。最后分别把1ml4号OptiPrep^TM分离液小心加到3号分离液的上方。最终形成一个从上到下浓度逐渐升高的OptiPrep^TM密度梯度；

3)分别取6ml步骤3收获的细胞悬液，小心地转移到上述制备好的两个OptiPrep^TM密度梯度的最上方。在22℃，800g条件下离心15min；

4)离心完毕后，即出现附图1所示的分层现象。从上到下依次为：最上层----细胞碎片1；第二层----少突胶质细胞2；第三层----神经元、细胞片段及其他细胞类型3；第四层----神经元4；第五层----沉淀(小胶质细胞)5。为保证所获得的神经元纯度，用移液枪将第四层收集起来转移至一个冰上预冷的15ml离心管内；

5)往上述15ml离心管内加入10ml培养基，22℃，200g离心2min；

6)弃上清，用手指轻弹管底沉淀，然后用8ml添加有0.5mM L-Gln，10ng/ml FGF2和 双抗(青霉素100U/ml，链霉素0.1mg/ml)的Neurobasal A/B27培养基重悬，摇匀；

7)细胞活力检测：取90ul细胞悬液与10ul 0.4％台盼蓝溶液混匀，然后取一块洁净的细胞计数板，在计数区上方盖一片盖玻片，取10ul将上述与台盼蓝混匀的细胞悬液，滴于盖玻片的一侧边缘，让液体充满整个计数区，然后置于显微镜下观察、计数，并计算细胞浓度(cells/ml)；

六、细胞接种 

按照4.61×10⁴cells/圆玻片的接种密度接种于步骤1培养板内预先包被好的12mm盖玻片上，然后置于37℃，5％CO₂培养箱内孵育4小时后首次更换培养基。

七、体外原代培养

1)根据所用塑料软管的外径，在空的培养基包装瓶的盖子上打三个孔：出液孔、进液孔、气体交换孔。分别将出液管、进液管穿过出液孔和进液孔，另准备一段塑料软管，穿过培养基瓶盖子上的气体交换孔，并在软管末端连接一个针头式过滤器以满足瓶内培养基与外界之间的气体交换；

2)按照附图2所示搭建流动式体外培养体系：将灌注培养板6与蠕动泵11、塑料软管8、三通活塞7、空培养基包装瓶10、针头式过滤器(Millipore)9组连接起来。注意上述整个体系必须在37℃，5％CO₂培养箱内运行；

3)之后每隔10天换液一次(吸弃50％旧培养基，加入50％新鲜培养基)。

试剂购买： 

多聚-D-赖氨酸(1mg/ml)购买自SIGMA-ALDRICH，灌注细胞培养板购买自Reinnervate，细胞培养专用的圆形盖玻片(直径12mm)购买自Corning；实验动物选择出生120天的雄性成年SD大鼠；戊巴比妥钠购买自Sigma，培养基购买自Life Technologies；木瓜蛋白酶购买自Worthington，DNA酶(DNase I)购买自Life Technologies；OptiPrep^TM密度梯度分离液购买自SIGMA-ALDRICH；0.4％台盼蓝溶液、Neurobasal A/B27培养基、L-Gln购买自Life Technologies；FGF2购买自HumanZyme；双抗(青霉素-链霉素溶液，100X)购买自碧云天；蠕动泵购买自World Precision Instruments，塑料软管及三通活塞均购买自Thermo Fisher，针头式过滤器购买自Millipore。

本发明的有益效果：使用预冷的培养基(Life Technologies)替代Hanks液来分离解剖大脑及海马组织。即使在冰浴条件下，神经元代谢活动依然在进行，Hanks液的无糖环境不利于大脑代谢，而培养基含有葡萄糖、无机盐、丙酮酸、氨基酸以及维生素等多种营养成分，适用于在外界CO₂浓度下保存神经细胞及组织，最大程度 地维持神经元活性；

其次，我们选用2mg/ml的木瓜蛋白酶与适量DNA酶配合替代普遍使用的胰蛋白酶对分离出来的海马组织进行消化。木瓜蛋白酶性质较为温和，不会消化过头，能够确保消化稳定性并提高神经元存活率。而DNA酶的作用是消除消化过程中裂解细胞释放的DNA，避免释放的DNA与蛋白缠绕在组织块表面阻碍消化。另外，推荐使用培养基代替Hanks缓冲液配制木瓜蛋白酶，现配现用；

第三，我们使用OptiPrep^TM密度梯度离心法(SIGMA-ALDRICH)对神经元进行进一步纯化。与单纯离心法、细胞筛过滤与离心配合等方法相比，OptiPrep^TM密度梯度离心能够有效去除细胞碎片、少突胶质细胞、小胶质细胞等杂质。

第四，我们利用特殊的灌注细胞培养板(Reinnervate)、蠕动泵(World Precision Instruments)、Neurobasal培养基贮存瓶、三通阀、塑料软管、针头式过滤器(Millipore)等组建成一个流动式体外培养体系，用于培养成年大鼠海马神经元。不同于传统的静置培养模式，培养基在我们建立的体系内持续循环流动，持续灌流所培养的神经元。

最后，使用添加有10ng/ml FGF2的Neurobasal A/B27培养基培养分离的成年大鼠海马神经元，FGF2对于体外培养神经元活力维持以及神经元突起再生具有重要意义。

本发明旨在建立一个稳定可靠的、高度模拟体内正常生理条件的成年大鼠海马神经元体外长期培养模型，对于某些神经退行性疾病例如阿兹海默症、帕金森症等的研究具有重要意义。统计结果显示，与传统方法相比，本发明可以获得更高的细胞纯度，减少了其他类型杂细胞的干扰。此外，使用本申请方案培养的成年大鼠海马神经元可以在体外培养长达40天仍然保持较高的细胞活性，这为一部分科研工作者的研究带来便利和可能，例如研究人员希望监测一段相对比较长的时间内神经元分泌某些因子的情况，或者是研究某一药物在一段较长的时程内对细胞功能特性的影响等。

图3为不同方案下培养8天的成年大鼠海马神经元纯度对比。利用免疫荧光技术对神经元微管相关蛋白(MAP2，是神经元骨架结构蛋白，主要分布于神经元胞体和突起，是一种神经元标志物)进行标记，同时应用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚，一种能够与DNA强力结合的荧光染料，标记细胞核)对所有细胞的细胞核进行标记，并于荧光显微镜下分别对Map2阳性神经元和DAPI标记细胞进行计数。神经元纯度＝Map2阳性神经元/DAPI阳性细胞。

图4为使用本发明方案培养的成年大鼠海马神经元在不同培养时期细胞活性对比。分别取培养10天、20天、30天和40天的大鼠海马神经元进行Live/Dead染色(ScienCell)， 并置于荧光显微镜下技术，其中绿色荧光标记的是活细胞，而死细胞则呈现红色荧光。细胞活性(％)＝绿色荧光标记细胞/(绿色荧光标记细胞+红色荧光标记细胞)。

上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。