一种鸡肠上皮细胞分离培养方法

摘要

本发明涉及一种鸡肠上皮细胞分离培养方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：用蛋白酶对鸡胚肠组织块进行消化，获得消化产物；步骤2：用细胞筛对所述消化产物进行过滤，收集尺寸为100-500目的细胞团块；步骤3：将所述细胞团块在800-1500r/min下离心5-15min，收集细胞沉淀。本发明还提供了利用本发明所述的方法获得的鸡肠上皮细胞。本发明所提供的方法能够大大缩短试验时间，节约试剂，提高分离的肠上皮细胞的纯度。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鸡肠上皮细胞分离培养方法。

背景技术

肠上皮细胞是肠道内外环境的媒介，同时也是机体免疫屏障的重要组成部分，具有消化、吸收、分泌、免疫等重要的生理功能。肠上皮细胞在一定条件下可进行体外分离与培养。体外分离培养肠上皮细胞对于研究肠道生物学功能、营养物质吸收机制及其调控以及肠上皮细胞增殖、分化和凋亡提供了简单、快速和准确的手段，并为研究营养素及其他外界因素对肠上皮的作用提供了理想的体外模型。但肠上皮细胞的分离培养难度较大，能成功建立单克隆肠上皮细胞系的报道较少。长期以来，在研究肠上皮细胞的生物学功能、细胞增殖和分化的调控因素，物质吸收与代谢等多采用肠道癌细胞系为实验模型。然而肠道癌上皮细胞与正常上皮细胞在细胞基本结构、代谢和功能特性等方面存在一定的差异，以癌细胞系的研究结果来解释正常的行为存在很大的局限性。

目前尚未见有关鸡肠上皮原代细胞体外分离或培养方法的专利文献公开，虽然现有的鸡肠上皮细胞培养方法中采用常规细胞培养技术，能够在一定程度上达到培养的目的，但存在着操作繁琐，细胞不易贴壁，生长缓慢、成纤维细胞等其他杂细胞很难分离等问题，不能满足细胞实验的要求。

本发明的发明人通过长期实验研究发现肠上皮细胞夹杂成纤维细胞生长往往是由于在分离细胞的时候无法把肠上皮细胞和成纤维细胞分离，有文献采用差速贴壁或低速离心的方式来分离成纤维细胞成分，然而该过程较为繁琐且耗时，通常需要5-7个小时且细胞纯度较低。

因此有必要开发一种操作过程简便、细胞贴壁效果好、生长迅速、细胞纯度高的鸡肠上皮细胞体外分离培养方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷，开发一种操作过程简便、细胞贴壁效果好、生长迅速、状态良好、纯度高的鸡肠上皮细胞体外分离培养方法。

本发明的发明人深入研究比较了国内外培养分离肠上皮细胞的方法，通过大量实验摸索，改进了鸡肠上皮细胞的体外培养方法，为肠上皮细胞的后续生物学作用研究提供了实验模型。

本发明提供了一种鸡肠上皮细胞分离培养方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1：用蛋白酶对鸡胚肠组织块进行消化，获得消化产物；

步骤2：用细胞筛对所述消化产物进行过滤，收集尺寸为100-500目的细胞团块；

步骤3：将所述细胞团块在800-1500r/min下离心5-15min，收集细胞沉淀。

可选的，所述蛋白酶为Ⅰ型胶原蛋白酶和/或透明质酸酶。

可选的，当所述蛋白酶为I型胶原蛋白酶和透明质酸酶时，I型胶原蛋白酶和透明质酸酶的用量比为1-2：1。

可选的，在步骤1的消化过程中，消化体系中I型胶原蛋白酶的浓度为0.8-1.6mg/mL；透明质酸酶的浓度为0.4-1.6mg/mL。

可选的，所述方法包括将鸡胚肠组织块浸泡于DMEM/F12培养基后再进行消化。

可选的，所述消化的条件为在37℃震荡消化25-35min。

可选的，所述方法还包括在步骤3后对所述细胞沉淀进行原代培养，所述原代培养的条件包括：在所述细胞沉淀中加入含20％胎牛血清的DMEM/F12培养基重旋吹打制成细胞悬液，将所述细胞悬液接种于鼠尾胶原包被好的培养板中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24-48小时，待贴壁后更换胎牛血清浓度为10％的DMEM/F12培养基继续培养。

可选的，所述鸡胚肠组织块的尺寸为0.5-1mm³。

可选的，所述鸡胚肠组织块取自15日龄鸡胚。

本发明还提供了利用所述的方法获得的鸡肠上皮细胞。

本发明利用肠上皮细胞团块和成纤维细胞在物理大小上的差别，采用一定孔径的细胞细胞筛对消化产物进行过滤，以分离取出大部分成纤维细胞成分，本发明大大的缩短了试验时间，节约了大量的试剂，提高了分离肠上皮细胞的纯度。

附图说明

图1是肠上皮细胞生长的组织形态图，显微镜放大200倍观察培养24小时后直接染色，染色阴性鉴定结果(对照组，未染色)。

图2是肠上皮细胞生长的组织形态图，为显微镜放大200倍观察培养24小时后直接染色，染色阳性鉴定结果。

图3为显微镜放大200倍观察培养24小时后且经胰酶消化成单个细胞后染色阴性鉴定结果(对照组，未染色)。

图4为显微镜放大200倍观察培养24小时后且经胰酶消化成单个细胞后染色鉴定阳性结果。

具体实施方式

下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

本发明提供了一种鸡肠上皮细胞分离培养方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1：用蛋白酶对鸡胚肠组织块进行消化，获得消化产物；

步骤2：用细胞筛对所述消化产物进行过滤，收集尺寸为100-500目的细胞团块；

步骤3：将所述细胞团块在800-1500r/min下离心5-15min，收集细胞沉淀。

其中，所述鸡肠组织块的来源可以为15日龄的鸡胚肠组织，将所述肠组织的肠系膜剔除后清洗干净。清洗的方法可以为用含抗生素的PBS溶液冲洗多次，所述抗生素可以包括浓度为100U/L青霉素和100μg/L链霉素。

本发明所提供的方法包括将鸡胚肠组织块浸泡于DMEM/F12培养基后再进行消化，其中，在消化过程中，消化体系中I型胶原蛋白酶的浓度为0.8-1.6mg/mL；透明质酸酶的浓度为0.4-1.6mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，可以将去除肠系膜和清洗后的肠组织浸泡于DMEM/F12培养基中进行剪切获得鸡胚肠组织块，所述鸡胚肠组织块的尺寸为0.5-1mm³。

在本发明所提供的方法中，所述蛋白酶为Ⅰ型胶原蛋白酶和/或透明质酸酶。优选的情况下，所述蛋白酶为Ⅰ型胶原蛋白酶和透明质酸酶。

当所述蛋白酶为I型胶原蛋白酶和透明质酸酶时，I型胶原蛋白酶和透明质酸酶的用量比为1-2：1。

在本发明中，可以先将I型胶原蛋白酶溶解为浓度为1-2mg/mL的酶溶液后再与待消化的组织块进行接触；将透明质酸酶溶解为浓度为0.5-2mg/mL的酶溶液后再与待消化的组织块进行接触；或者，将I型胶原蛋白酶与透明质酸酶配制成混合酶液后再与待消化的组织块进行接触，其中，混合酶液中，I型胶原蛋白酶的浓度为1-2mg/mL，透明质酸酶的浓度为0.5-2mg/mL。

可选的，所述消化的条件为在37℃震荡消化25-35min，优选消化30min。

可选的，所述方法还包括在步骤3后对所述细胞沉淀进行原代培养，所述原代培养的条件包括：在所述细胞沉淀中加入含20％胎牛血清的DMEM/F12培养基重旋吹打制成细胞悬液，将所述细胞悬液接种于鼠尾胶原包被好的培养板中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24-48小时，待贴壁后更换胎牛血清浓度为10％的DMEM/F12培养基继续培养。

其中，进行原代培养和继续培养的培养基中还可以含有浓度为100U/L的青霉素和100μg/L的链霉素。

在本发明的一种实施方式中，本发明所提供的方法包括以下步骤：

首先将消化产物通过100目的细胞筛，分别收集能通过100目细胞筛的混合物1和不能通过100目细胞筛的组分1。

其中，将能通过100目细胞筛的混合物1在1000r/min离心10分钟后收集上清液1和沉淀物1。其中，上清液1中的主要成分为单个细胞、Ⅰ型胶原酶和/或透明质酸酶液。该上清液1可以用于后续消化步骤。

其中，沉淀物1的主要成分为肠上皮隐窝单位以及部分单个细胞，可以在收集的沉淀物1中加入DMEM/F12培养基重悬以防止细胞脱水死亡，获得重悬液1。

其中，将不能通过100目细胞筛的组分1回收并加入DMEM/F12培养基重悬，将该重悬后的混合物与之前收集的上清液1混合后进行二次消化后再次过100目细胞筛，收集能通过100目细胞筛的混合物2，将所述能通过100目细胞筛的混合物2在1000r/min离心10分钟后收集沉淀物2，用DMEM/F12培养基重悬所述沉淀物2后获得重悬液2.

将所述重悬液1和重悬液2混合后获得混合悬液，将所述混合悬液过500目细胞筛去除单个细胞，收集不能通过500目细胞筛的组分，将该组分在1000r/min低速离心后弃上清收集沉淀物3，对所述沉淀物3进行原代培养。

本发明还提供了利用本发明所述的方法获得的鸡肠上皮细胞。

下面通过实施例对本发明进行详细的说明：

在以下实施例中：试验对象：15日龄鸡胚。

PBS(Hyclone公司)，DMEM/F12(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibico公司)，Ⅰ型胶原酶(Sigma公司)、透明质酸酶(Sigma公司)；BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂(碧云天公司)，鼠尾胶原(Sigma公司)，细胞筛(索莱宝公司)CO₂培养箱(Thermo Scientific公司)，倒置显微镜(Olympus公司)。

实施例1

1、原代培养：无菌条件下取2枚15日龄鸡胚肠组织，仔细剔除肠系膜，用含抗生素的PBS反复冲洗3-4次。收集剔除杂质的肠组织于20mL小烧杯中，加入5mL的DMEM/F12，用眼科剪剪成小于1mm³的组织块，转移至50mL离心管，并加入20mL浓度为2mg/mL的Ⅰ型胶原酶和20mL浓度为1mg/mL的透明质酸酶联合消化，37水浴箱中，80r/min搅拌30min，然后采用100目细胞筛对消化产物混合物进行过滤，能通过细胞筛的混合物1000r/min离心10分钟后，将上清液(主要成分是Ⅰ型胶原酶和透明质酸酶液和单个细胞)转移至新的离心管待用，向沉淀物(主要成分是肠上皮隐窝单位，以及部分单个细胞)加入5mL的DMEM/F12培养基重悬以防止细胞脱水死亡，待用。不能通过100目细胞筛的组织块，回收后用上一步回收的混合酶消化液继续重复上一消化步骤，并参照上述方式收集隐窝单位，收集的隐窝单位与之前的隐窝单位混合，并加入DMEM/F12重旋、配平至50mL。接下来，采用500目细胞筛过滤隐窝混合液，以去除单个细胞，用DMEM/F12回收不能通过500目细胞筛的肠隐窝单位，1000r/min低速离心后弃上清，沉淀物用20mL含20％FBS、100U/L青霉素和100μg/L链霉素的DMEM/F12培养基重悬，并种植于鼠尾胶原包被的6孔细胞板中，每孔3mL。最后置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时，贴壁后改用含10％FBS、100U/L青霉素和100μg/L链霉素的DMEM/F12培养基继续培养，以后每隔48小时换液。并每天在倒置显微镜下观察细胞贴壁生长情况。

2、肠上皮细胞的鉴定：肠粘膜上皮细胞可分泌黏液，碱性磷酸酶是肠上皮细胞微绒毛上的标志性酶。待细胞铺满培养板后，用胰酶消化至单个细胞，制成细胞悬液并用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒对细胞进行染色鉴定，显微镜下观察染色情况，以出现结果显示阳性上皮细胞呈黑色，阴性对照不显色，并在显微镜下计数并拍照。

3、结果：原代培养结果：鸡肠上皮细胞隐窝一般在24小时贴壁，呈“岛屿”状。换培养基液后继续培养24小时，可见从岛屿向周围辐射生长，48-60小时候逐渐汇合成片，呈“铺路石”状。

肠上皮细胞的鉴定：待细胞铺满培养板后，应用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒对细胞进行染色鉴定，阳性细胞染成蓝黑色，阳性率到80％以上，证实绝大多数细胞为肠上皮细胞。

参见图1至图4：图1是肠上皮细胞生长的组织形态图，显微镜放大200倍观察培养24小时后直接染色，染色阴性鉴定结果(对照组，未染色)。图2是肠上皮细胞生长的组织形态图，为显微镜放大200倍观察培养24小时后直接染色，染色阳性鉴定结果。

图3为显微镜放大200倍观察培养24小时后且经胰酶消化成单个细胞后染色阴性鉴定结果(对照组，未染色)。图4为显微镜放大200倍观察培养24小时后且经胰酶消化成单个细胞后染色鉴定阳性结果。

对比例1

按照文献(鸡肠上皮原代细胞体外分离培养与鉴定，师润，杨霞，陈陆，等，江苏农业科学，2013,41(1)：34-37.)中所提供的方法进行鸡肠上皮肌细胞的分离培养：

无菌取出15日龄鸡胚肠组织，PBS反复洗涤，剔除肠系膜，剪成小于1mm³的组织块，Ⅰ型中性蛋白酶和Ⅺ型胶原酶联合消化肠组织，在37℃水浴箱慢速搅拌，80r/min 30min。消化完成后以1000r/min离心10min，向细胞沉淀中加入少量DMEM/F12培养基悬浮细胞，离心洗涤三次后，收集的细胞用含10％FBS的细胞培养液(DMEM/F12(pH7.0)12g/L+20μg/L表皮生长因子+100mg/L肝素钠+110mg/L丙酮酸钠+2.5mg/L胰岛素+200mmol/L谷氨酸氨+100U/L青霉素+100μg/L链霉素)悬浮，种植到玻璃细胞瓶中。2.5小时后，把培养液和未贴壁的细胞分别转移到离心管中，以1000r/min离心10min,向细胞沉淀中加入含2.5％FBS的细胞培养液(DMEM/F12(pH7.0)12g/L+20μg/L表皮生长因子+100mg/L肝素钠+110mg/L丙酮酸钠+2.5mg/L胰岛素+200mmol/L(2mmol/L)谷氨酸氨+100U/L青霉素+100μg/L链霉素)后接种到20％FBS包被的过一次性T25细胞瓶中，24h后观察并换液。将利对比例1与实施例1的分离培养方法进行比较，结果列于表1。

表1

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。