一种恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原电致化学发光传感器的制备方法及应用

摘要

本发明涉及一种恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原电致化学发光传感器的制备方法及应用。具体涉及一种氮掺杂碳量子点作为发光材料，氨基化石墨烯GS-NH2与检测抗体Ab2的孵化物作为检测抗体标记物的电致化学发光免疫传感器的制备与应用，提供一种简单、快速、无污染的氮掺杂碳量子点电致化学发光免疫传感器的制备方法及应用，其线性范围为0.01ng/mL~100ng/mL，检测限为3.3pg/mL，从而实现对恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原的快速灵敏检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原电致化学发光传感器的制备方法及应用。具体涉及一种氮掺杂碳量子点作为发光材料，氨基化石墨烯GS-NH₂与检测抗体Ab₂的孵化物作为检测抗体标记物的电致化学发光免疫传感器的制备与应用，属于电化学发光检测技术领域。

背景技术

TSGF作为新型的肿瘤标志物对肺癌的诊断具有广谱性、敏感性、特异性较高，它在肺癌的辅助诊断中有一定价值。恶性肿瘤特异性生长因子（TSGF）是恶性肿瘤形成和生长时促使肿瘤及周边毛细血管大量增殖并释放到外周血液中的因子，它不仅带有恶性肿瘤的特异性，而且在癌肿形成的最初时期就释放到血液中并达到一定程度。已有文献报道它具有广谱、敏感性及特异性高等特点。

据文献报道，癌胚抗原CEA对肺癌的灵敏度只有61.5%，β-M灵敏度也只有72.1%。本检测结果肺癌血清TSGF的灵敏度为81.2%，明显高于上述肿瘤标记物。可见TSGF的检测具有广谱性、敏感性、特异性的优点，对肺癌的早期诊断有着极为重要的意义。

 肺癌的早期发现，早期诊断，早期治疗是提高其治愈率的重要手段之一。目前最主要的诊断方法有物理学方法、组织细胞学方法和化学方法三大类。前两类方法适用于中晚期患者，且操作复杂、费用昂贵；化学方法由于具有简便易行的优点而得以广泛应用，特别是近年来肿瘤标记物检测的迅猛发展，该法已成为恶性肿瘤早期诊断的主要手段之一。

本发明设计了一种特异性强，灵敏度高，无放射性污染，操作快速简便的电致化学发光免疫分析方法。在本发明中使用氮掺杂碳量子点N-CQDs作为基底材料，氨基化石墨烯与检测抗体形成孵化物构建夹心型免疫传感器。恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原的浓度不同，化学发光检测仪检测的电致发光强度不同，从而实现对恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原的定量检测。在本发明中构建的致电化学发光免疫传感器具有操作简单，成本低，无放射性污染，灵敏度高，特异性强等优点，克服了放射免疫分析法和酶联免疫分析法的一些不足。

发明内容

本发明的目的是针对现有的恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原的检测方法的问题，提供一种简单、快速、无污染的氮掺杂碳量子点电致化学发光免疫传感器的制备方法及应用，实现对恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原的快速灵敏检测

本发明的技术方案，包括以下步骤

1. 一种恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原电致化学发光传感器的制备方法

（1）将直径为4mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

（2）将6 μL、8~12 μg/mL的氮掺杂碳量子点N-CQDs溶液滴到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；

（3）待电极近干时，滴加3μL、浓度为0.3 ~ 0.5 mol/L 的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC和0.05 ~ 0.2 mol/L N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液至电极表面，4℃冰箱中孵化30min，室温下晾干；

（4）滴加6 μL、质量分数为0.5 ~ 2.0%的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；滴加6 μL、10ng/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原标准溶液于电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；

（5）滴涂6 μL、1 ~ 3 mg/mL的检测抗体孵化物GS-NH₂@Ab₂溶液于电极表面，置于4℃冰箱中晾干，制得一种恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原电致化学发光传感器。

2. 氮掺杂碳量子点N-CQDs制备

将0.2 ~ 0.4 g的二乙基三胺五乙酸DTPA溶解于10 ~ 30mL的超纯水中，超声分散，继续加热至230℃下溶解，继续加热溶剂蒸发，出现白色固体，当白色固体变为棕黄色时表明氮掺杂碳量子点N-CQDs的生成；将所得的粗产品溶解在20mL超纯水中，8000 rpmin离心，所得上层清液冷冻干燥得纯净的氮掺杂碳量子点N-CQDs固体，将其研磨成粉末，制得氮掺杂碳量子点N-CQDs。

3. 检测抗体孵化物GS-NH₂@Ab₂溶液制备

将1mL、1 ~ 3 mg/mL的氨基化石墨烯GS-NH₂溶液，1mL、5 ~ 10μg/mL的检测抗体Ab₂溶液加入到5 mL的离心管中，震荡12h，使氨基化石墨烯GS-NH₂与检测抗体Ab₂键合，离心分离，将其分散到1mL、pH为6.5 ~ 8.5的磷酸缓冲溶液中，制得检测抗体孵化物GS-NH₂@Ab₂溶液。

恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原的检测方法

（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电致化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为650 V，扫描电压设置为-2 ~ 0 V，扫描速率0.1 V/s；

（2）在10 mL、pH 7.5的含80 mmol/L过硫酸钾的PBS缓冲溶液中，通过电致化学发光系统检测对0.01 ng/mL ~ 100 ng/mL一系列不同浓度的恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原标准溶液，产生的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线；

（3）将待测样品溶液代替恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原标准溶液进行检测。

本发明的有益成果

（1）电致化学发光免疫传感器制备方法,以氮掺杂碳量子点为发光材料，利用其良好的光学性能，构建的传感器具有更高的灵敏度；

（2）利用检测抗体孵化物GS-NH₂@Ab₂对氮掺杂碳量子点发光的猝灭效应，构建免疫传感器；

（3）本发明制备的电致化学发光免疫传感器用于恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原的检测，操作简单，无放射性污染，信号响应范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏检测。测得线性范围为0.01 ng/mL~100 ng/mL，检测限为3.3 pg/mL。

具体实施方案

实施例1 一种恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原电致化学发光传感器的制备方法：

1. 一种恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原电致化学发光传感器的制备方法

（1）将直径为4mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

（2）将6 μL、8 μg/mL的氮掺杂碳量子点N-CQDs溶液滴到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；

（3）待电极近干时，滴加3μL、浓度为0.3 mol/L 的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC和0.05 mol/L N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液至电极表面，4℃冰箱中孵化30min，室温下晾干；

（4）滴加6 μL、质量分数为0.5%的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；滴加6 μL、10ng/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原标准溶液于电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；

（5）滴涂6 μL、1 mg/mL的检测抗体孵化物GS-NH₂@Ab₂溶液于电极表面，置于4℃冰箱中晾干，制得一种恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原电致化学发光传感器。

实施例2一种恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原电致化学发光传感器的制备方法

1. 一种恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原电致化学发光传感器的制备方法

（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

（2）将6 μL、10 μg/mL的氮掺杂碳量子点N-CQDs溶液滴到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；

（3）待电极近干时，滴加3μL、浓度为0.4 mol/L 的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC和0.1 mol/L N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液至电极表面，4℃冰箱中孵化30min，室温下晾干；

（4）滴加6 μL、质量分数为1.0 %的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；滴加6 μL、10ng/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原标准溶液于电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；

（5）滴涂6 μL、2 mg/mL的检测抗体孵化物GS-NH₂@Ab₂溶液于电极表面，置于4℃冰箱中晾干，制得一种恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原电致化学发光传感器。

实施例3一种恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原电致化学发光传感器的制备方法：

1. 一种恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原电致化学发光传感器的制备方法

（1）将直径为4mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

（2）将6 μL、12 μg/mL的氮掺杂碳量子点N-CQDs溶液滴到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；

（3）待电极近干时，滴加3μL、浓度为0.5 mol/L 的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC和0.2 mol/L N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液至电极表面，4℃冰箱中孵化30min，室温下晾干；

（4）滴加6 μL、质量分数为2.0%的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；滴加6 μL、10ng/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原标准溶液于电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；

（5）滴涂6 μL、3 mg/mL的检测抗体孵化物GS-NH₂@Ab₂溶液于电极表面，置于4℃冰箱中晾干，制得一种恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原电致化学发光传感器。

实施例4 氮掺杂碳量子点N-CQDs的制备

将0.2 g的二乙基三胺五乙酸DTPA溶解于10 mL的超纯水中，超声分散，继续加热至230℃下溶解，继续加热溶剂蒸发，出现白色固体，当白色固体变为棕黄色时表明氮掺杂碳量子点的生成；将所得的粗产品溶解在20mL超纯水中，8000 rpmin离心，所得上层清液冷冻干燥得纯净的氮掺杂碳量子点固体，将其研磨成粉末，制得氮掺杂碳量子点。

实施例5  氮掺杂碳量子点N-CQDs的制备

将0.3 g的二乙基三胺五乙酸DTPA溶解于20mL的超纯水中，超声分散，继续加热至230℃下溶解，继续加热溶剂蒸发，出现白色固体，当白色固体变为棕黄色时表明氮掺杂碳量子点的生成；将所得的粗产品溶解在20mL超纯水中，8000 rpmin离心，所得上层清液冷冻干燥得纯净的氮掺杂碳量子点固体，将其研磨成粉末，制得氮掺杂碳量子点。

实施案例6氮掺杂碳量子点N-CQDs的制备

将0.4 g的二乙基三胺五乙酸DTPA溶解于30mL的超纯水中，超声分散，继续加热至230℃下溶解，继续加热溶剂蒸发，出现白色固体，当白色固体变为棕黄色时表明氮掺杂碳量子点的生成；将所得的粗产品溶解在20mL超纯水中，8000 rpmin离心，所得上层清液冷冻干燥得纯净的氮掺杂碳量子点固体，将其研磨成粉末，制得氮掺杂碳量子点。

实施例7  一种恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原电致化学发光传感器的制备方法，所述GS-NH₂@Ab₂检测抗体孵化物溶液，其特征在于，制备步骤如下：

将1mL、1 mg/mL的氨基化石墨烯GS-NH₂溶液，1mL、5μg/mL的检测抗体Ab₂溶液加入到5 mL的离心管中，震荡12h，使氨基化石墨烯GS-NH₂与检测抗体Ab₂键合，离心分离，将其分散到1mL、pH为6.5的磷酸缓冲溶液中，制得GS-NH₂@Ab₂检测抗体孵化物溶液。

实施例8 一种恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原电致化学发光传感器的制备方法，所述GS-NH₂@Ab₂检测抗体孵化物溶液，其特征在于，制备步骤如下：

将1mL、2 mg/mL的氨基化石墨烯GS-NH₂溶液，1mL、10μg/mL的检测抗体Ab₂溶液加入到5 mL的离心管中，震荡12h，使氨基化石墨烯GS-NH₂与检测抗体Ab₂键合，离心分离，将其分散到1mL、pH为7.5的磷酸缓冲溶液中，制得GS-NH₂@Ab₂检测抗体孵化物溶液。

实施例9 一种恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原电致化学发光传感器的制备方法，所述GS-NH₂@Ab₂检测抗体孵化物溶液，其特征在于，制备步骤如下：

将1mL、3 mg/mL的氨基化石墨烯GS-NH₂溶液，1mL、15μg/mL的检测抗体Ab₂溶液加入到5 mL的离心管中，震荡12h，使氨基化石墨烯GS-NH₂与检测抗体Ab₂键合，离心分离，将其分散到1mL、pH为8.5的磷酸缓冲溶液中，制得GS-NH₂@Ab₂检测抗体孵化物溶液。

实施例10  一种氮掺杂碳量子点的电致化学发光传感器，用于恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原的检测，检测步骤如下：。

（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为650 V，扫描电压设置为-2~0 V，扫描速率0.1 V/s；

（2）在10 mL、pH 7.5的含80 mmol/L过硫酸钾的PBS缓冲溶液中，通过电致化学发光系统检测对0.01 ng/mL~100 ng/mL一系列不同浓度的恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原标准溶液，产生的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线；

（3）将待测样品溶液代替恶性肿瘤特异性生长因子TSGF抗原标准溶液进行检测，测得线性范围为0.01 ng/mL~100 ng/mL，检测限为3.3 pg/mL。