胸苷酸合成酶抑制剂在制备构建神经管畸形小鼠模型中的应用

摘要

本发明涉及胸苷酸合成酶抑制剂在制备构建神经管畸形小鼠模型中的应用，具体而言，是采用胸苷酸合成酶抑制剂干预孕鼠，造成胸腺嘧啶脱氧核苷的代谢障碍，引起鼠胚胎发育异常，从而建立神经管畸形小鼠模型；所述应用，可行性强，容易操作，重复性好，效果稳定，致畸率高，通过阻碍胸腺嘧啶脱氧核苷的代谢，模拟出与人神经管畸形发病机制相近的小鼠模型，为进一步研究出生缺陷，尤其是研究神经管畸形相关的所有分子和细胞的机制提供了良好的动物模型。

说明书

技术领域：

本发明属于应用基础医学研究领域，涉及胸苷酸合成酶抑制剂制备构建神经管畸形小鼠 模型的应用。

背景技术：

神经管畸形(Neural Tube Defects,NTDs)是指在胚胎发育早期的神经管闭合不全而产 生的脑部和脊柱部位畸形，是一类发病率高且后果严重的出生缺陷，主要包括无脑畸形、脑 或脑脊膜膨出、脊柱裂等,其发生的机制至今仍不清楚。构建具有人类NTDs疾病模拟性表现 的动物模型，有助于更方便有效地认识人类NTDs的发生发展规律，了解其病因、发病机制和 病理特点，对研究防治措施具有重大的意义。妊娠早期叶酸缺乏是NTDs发生的重要危险因素， 补充0.4-4.0mg/d的叶酸能预防大约50％-70％NTDs的发生。然而仅通过控制饮食诱导叶酸缺 乏的NTDs动物模型尚未建立，且叶酸缺乏引起NTDs的具体机制也不清楚。

叶酸缺乏的本质问题就是叶酸代谢障碍的问题。叶酸作为载体参与体内活性一碳单位代 谢，而活性一碳单位参与了体内的嘌呤和胸腺嘧啶从头合成及甲基化代谢。dTMP(脱氧胸苷 酸)的从头合成是由5，10-亚甲基四氢叶酸提供一碳单位，胸腺嘧啶合成酶催化dUMP(脱氧 尿苷酸)甲基化而成，生成的dTMP则参与了DNA的合成与修复。有研究表明，对叶酸缺乏敏 感的基因突变型NTDs小鼠模型中，检测到一碳单位的代谢障碍及胸腺嘧啶从头合成受损，可 以通过补充叶酸或胸腺嘧啶降低NTDs的发生率，表明增补叶酸可补救胸腺嘧啶从头合成的障 碍，可以预防和改善NTDs的发生。换言之，叶酸缺乏引起胸腺嘧啶从头合成受损，从而影响 DNA合成与修复。胸腺嘧啶从头合成受损会导致dTTP(脱氧胸苷三磷酸)池失衡，dUMP/dTMP 比例失调，从而引起尿嘧啶错掺，DNA合成异常。

胸腺嘧啶的从头合成提供唯一甲基的供体，是由N5，N10-甲烯四氢叶酸提供，在叶酸的 代谢过程中，由丝氨酸与四氢叶酸(THF)在丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)的催化下生成N5， N10-甲烯四氢叶酸，而dUMP在胸苷酸合成酶催化下，由N5，N10-甲烯四氢叶酸作为甲基供 体，甲基化生成dTMP，5，10-甲烯四氢叶酸提供甲基后生成为二氢叶酸，后者在二氢叶酸还 原酶作用下，重新生成四氢叶酸，从而构成胸腺嘧啶循环，为DNA合成提供原料。胸苷酸合 成酶还是体内调节四种核苷酸平衡的关键酶，是DNA合成和修复的限速酶，在快速增值的细 胞中(如胚胎发育阶段的细胞)，胸苷酸合成酶高度表达，该酶受到抑制后会导致胸腺嘧啶缺 失，TTP池受损，dUTP聚集，大量尿嘧啶错掺入DNA，引起DNA单链或双链断裂，造成DNA 不稳定和突变增加。叶酸缺乏的人和动物细胞中已经观察到尿嘧啶错掺，DNA双链断裂。在 肿瘤研究中，抑制胸苷酸合成酶造成胸腺嘧啶缺失(thymidylate deprivation)，可以导致 胸腺嘧啶缺失性死亡(thymidylate death)，从而达到治疗肿瘤的效果。叶酸代谢及其叶酸 相关代谢，具体通过哪条代谢途径发挥作用以及叶酸相关代谢中哪些代谢是引起NTDs的独立 因素尚不完全清楚。因此人们更需要一个可以模拟出dTMP代谢障碍诱导引起NTDs的动物模 型来探索其机制。

在制备构建饮食缺乏叶酸直接导致NTDs的动物模型中存在几个问题，机体存在着强大的 代偿作用，在叶酸缺乏的情况下机体可以通过提高叶酸利用率满足体内代谢的需要，特别是 对于母体，在缺乏叶酸的环境下，会通过消融自身组织供给胎儿的需要，另一方面，很难控 制饮食来源的叶酸和动物自身的营养状况，短时间叶酸不足却可以通过机体代偿供给。现有 NTDs动物模型主要有以下几种构建方法：1)通过物理因素诱导，构建妊娠期高温、高糖的 环境诱发出NTDs的动物模型；2)利用化学因素诱导，通过维甲酸、顺铂、环磷酰胺、丙戊酸 等注射孕鼠，诱导出NTDs动物模型；3)通过基因敲除手段，敲除对胚胎发育具有关键作用的 基因(Mthfr、Pax3、Ptch1、Wnt)诱发NTDs动物模型。然而，以上构建模型的方式均未能 真正模拟出叶酸缺乏引起dTMP代谢障碍诱导NTDs的模型，未能影响dTMP代谢及其相关代谢。 基因敲出的方式从遗传学上改变了基因组的结构和稳定性。所以，迫切需要新的角度和思路 构建NTDs动物模型。

本发明应用胸苷酸合成酶抑制剂干扰dTMP的从头合成过程，模拟体内叶酸缺乏引起胸腺 嘧啶从头合成受损，导致dTTP池失衡，dUMP/dTMP比例失调，从而引起尿嘧啶错掺，DNA合 成异常。本发明所述模型，为研究NTDs提供了研究的实验平台和理论依据。

根据化学结构的不同，胸苷酸合成酶抑制剂主要有非叶酸结构类似物和叶酸结构类似物 两大种类的抑制剂。

非叶酸结构类似物主要为5-氟尿嘧啶(5-FU)及其衍生物。5-FU是尿嘧啶的嘧啶环上， 5-位上的氢原子被氟原子所取代，因为氟原子的半径和氢原子半径接近，从而使其在代谢过 程中不易被分解，取代了正常的代谢物。5-FU在体内可以通过尿苷磷酸化酶转化为FUrd后， 由尿苷激酶转化为FUMP，参与了RNA的错配合成；还会由胸苷磷酸化酶转化为FdUrd，再经 过胸苷激酶转化为FdUMP，其与dUMP竞争结合TS酶的催化位点，在正常由dUMP甲基化成为 dTMP中，N5，N10-甲烯四氢叶酸上的甲基基团被转移到dUMP，是需要伴随嘧啶第5个碳原子 上的氢原子丢失过程中完成的。而FdUMP上是氟原子，导致TS被竞争性抑制，形成了一个“复 合体”(TS、N5，N10-甲烯四氢叶酸、FdUMP)，使胸苷酸合成酶失活，从而抑制DNA合成。 最早开发药物是5-FU，随后又在5-FU基础上对其进行了修饰，研制出一些衍生药，卡培他 滨、替氟加，双呋氟尿嘧啶，卡莫氟，氟铁龙。卡培他滨在羧酸酯酶、胞嘧啶脱氨酶、胸苷 磷酸化酶作用下转化为5-FU发挥作用。替加氟是5-FU的前药，通过2条代谢途径缓慢代谢 为5-FU，一条是通过细胞色素P450调节，形成(5'-羟呋喃尿嘧啶)，再发生自燃断裂产生 5-FU，另一途径是通过脱氧胸苷磷酸化酶调节。

叶酸结构类似物抑制剂能与胸苷酸合成酶很好的结合，干扰其活性和正常功能，从而抑 制DNA合成。叶酸结构类似物大致分为了两大类，一类是雷替曲塞，培美曲CB3717,1843U89， 这类化合物的特点是含有谷氨酸残基结构，是一种经典的胸苷酸合成酶抑制剂，进入细胞的 方式要通过位于细胞膜上还原叶酸载体的载运，然后被叶酸聚谷氨酸合成酶催化形成聚谷氨 酸化，这个过程使药物的浓度在细胞内增加，延长了其在细胞内的滞留作用时间，并且增强 了和胸苷酸合成酶的结合性，增加了抑制作用。雷替曲塞(RTX)是四氢叶酸类似物，与5-Fu 不同，它不会掺入DNA分子中，发挥作用也不需要辅助因子，它的抑制作用不受尿嘧啶聚集 的影响。雷替曲塞进入体内后，通过还原型叶酸载体(RFC)进入细胞，然后被多聚谷氨酸合 成酶催化成多聚谷氨酸形式。它与多聚谷氨酸合成酶亲和力较强，可被快速多聚谷氨酸化。 雷替曲塞不仅对二氢还原酶有抑制作用，还和胸苷酸合成酶在叶酸结合位点特异结合。雷替 曲塞只在细胞内被聚谷氨酸化后进行代谢发挥作用，其他方式会以原形经尿排出。

非经典的胸苷酸合成酶抑制剂，有ZD9331，AG331，AG337等药物不含有谷氨酸残基，与 经典胸苷酸合成酶抑制剂的主要区别是，进入细胞的方式不需要谷氨酸化，其中ZD9331药物 需要还原型叶酸载体(RFC)转运入细胞，而AG331，AG337不需要谷氨酸化，也不需要还原 型叶酸载体(RFC)，可以更好的发挥药效。

本项研究的目的是，通过抑制母体胸苷酸合成酶阻碍胸腺嘧啶脱氧核苷(dTMP)的生成， 诱导构建胸腺嘧啶脱氧核苷(dTMP)代谢障碍的NTDs小鼠模型，影响DNA的合成，诱导神经 上皮细胞发生过度凋亡。

胸腺嘧啶脱氧核苷(dTMP)代谢障碍涉及尿嘧啶脱氧核苷(dUMP)、胸腺嘧啶脱氧核苷 (dTMP)、脱氧腺苷酸(dAMP)、脱氧鸟苷酸(dGMP)、脱氧胞苷酸(dCMP)、腺嘌呤核苷酸(AMP)、 鸟嘌呤核苷酸(GMP)、胞嘧啶核苷酸(CMP)、尿嘧啶核苷酸(UMP)、胸腺嘧啶核苷酸(TMP) 及次黄嘌呤核苷酸(IMP)、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、蛋氨酸、同型半 胱氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、组氨酸、S-腺苷蛋氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、胱硫醚还原性 谷胱甘肽或腺苷。

胸腺嘧啶脱氧核苷(dTMP)代谢障碍的神经管畸形小鼠胚胎基因组稳定性受到影响，表 现为彗星电泳实验中细胞发生严重拖尾现象(DNA受损)；神经上皮细胞凋亡异常。如上所述， 目前主要采用的是物理、化学因素诱发，或利用基因敲除技术制备构建NTDs的动物模型。本 发明所述应用胸苷酸合成酶抑制剂干预孕鼠体内胸腺嘧啶脱氧核苷(dTMP)的代谢，诱导构 建NTDs小鼠模型，迄今为止，尚未见有国内外的相关报道。本发明的目的是，通过抑制母体 胸苷酸合成酶阻碍胸腺嘧啶脱氧核苷(dTMP)的生成，诱导构建胸腺嘧啶脱氧核苷(dTMP) 代谢障碍的NTDs小鼠模型，为研究NTDs的机制提供动物模型实验平台和相关的理论依据。

发明内容：

本发明所述胸苷酸合成酶抑制剂在制备构建神经管畸形小鼠模型中的应用，是采用胸苷 酸合成酶抑制剂干预孕鼠，抑制尿嘧啶脱氧核苷(dUMP)转化为胸腺嘧啶脱氧核苷(dTMP)， 造成胸腺嘧啶脱氧核苷(dTMP)代谢障碍，引起胚鼠发育异常，从而诱导构建稳定高效的神 经管畸形小鼠模型。其技术方案是：所用年龄、体重适合的小鼠来源于近交系小鼠(C57BL/6 Mice,BALB/c Mice,C3H Mice,DBA/1 Mice,DBA/2 Mice,FVB Mice,SJL Mice,129 Mice),、 杂交系小鼠(B6C3F1 Mice,B6D2F1 Mice,CB6F1 Mice,CD2F1 Mice,B6SJLF1 Mice)和封 闭群小鼠(ICR Mice,NIH(S)Mice,KM Mice小鼠)，雌雄合笼后，将得到的孕鼠随机分为 实验组和对照组。实验组采用胸苷酸合成酶抑制剂进行给药干预，对照组孕鼠采用等体积生 理盐水干预，至规定孕周后，研究胎鼠的发育情况，包括大体形态学观察，是否出现发育异 常，是否发生神经管闭合障碍，是否存在无脑儿、脑膨出、露脑、脑脊髓膜膨出、脊柱裂/ 隐性脊柱裂、颅脊柱裂、唇裂及腭裂等表型，是否还出现其他的发育畸形，发育迟缓、颜面 部畸形、小眼畸形、无眼畸形、吸收胎。与此同时，对胚胎进行相关生化代谢指标、DNA损 伤情况，细胞凋亡情况的检测。所述干预方式采用灌胃、口服、皮下注射、皮内注射、肌肉 注射、腹腔注射、尾静脉注射、皮下静脉注射、颅内给药、脊髓腔内给药、耳缘静脉注射、 局部涂抹等。胸苷酸合成酶抑制剂的剂量范围在0.1mg/kg-60mg/kg，最佳干预剂量选择 12mg/kg。胸苷酸合成酶抑制剂的干预时间点含盖影响神经管发育的整个阶段，从孕0.5天到 孕15.5天，最佳干预时间点选择孕7天。dTMP代谢障碍的神经管畸形小鼠胚胎发育异常， 表现为dUMP转化dTMP发生障碍，引起胎鼠的dUMP和dTMP异常改变，使得神经上皮细胞DNA 损伤增加，诱导神经上皮细胞发生过度凋亡，导致神经管畸形所有相关分子和细胞水平的改 变。

发明的优点和有益效果：

本发明采用胸苷酸合成酶抑制剂5-氟尿嘧啶(5-FU)造成体内dTMP生成障碍，从而干 预胎鼠神经管的正常发育，构建立稳定高效的神经管畸形小鼠模型。叶酸在体内作为载体， 通过活性一碳单位参与体内嘌呤和胸腺嘧啶从头合成及甲基化代谢影响DNA合成与损伤修 复，但具体通过哪些代谢途径，可以独立引起NTDs尚不清楚。本发明应用胸苷酸合成酶抑制 剂干扰dTMP的从头合成过程，模拟体内叶酸缺乏引起胸腺嘧啶从头合成受损，从而导致dTTP 池失衡，dUMP/dTMP比例失调，引起尿嘧啶错掺，DNA合成异常，发生DNA损伤和过度的细胞 凋亡。本发明所述模型，属国内外首次采用5-氟尿嘧啶抑制胸苷酸合成酶诱导构建神经管畸 形小鼠模型，为研究叶酸缺乏引起NTDs机制建立了良好的小鼠模型，提供了广阔的应用前景。

本发明所采用的方法操作简单，效果稳定，重复性好，神经管畸形率高，吸收胎致死率 低。制备构建小鼠NTDs模型中的畸形率与给药剂量，给药时间，给药方式等因素相关。通过 在特定时间点(神经管开始发育，孕7天，小鼠胚胎神经发育过程是从妊娠E6.0d开始，E7.0～ 8.0期间外胚层会增厚成为神经板，然后开始凹陷折叠，逐渐形成神经沟和神经褶，E8.0～ 8.75d神经褶开始融合形成神经管，大约在E10.0d后神经孔最后闭合，通过选取不同胸苷酸 合成酶抑制剂的剂量和给药干预的方式，以达到影响胚胎神经管的发育程度，在短时期内出 现较高致畸率的神经管畸形的小鼠模型。干扰胸腺嘧啶脱氧核苷(dTMP)的生成，从而成功 诱导出包括神经管畸形在内的多种先天畸形，最大程度地还原了胸腺嘧啶脱氧核苷(dTMP) 的生成障碍对胚胎发育的影响，模拟出了与人NTDs发病机制相近的小鼠模型，为进一步研究 出生缺陷，特别是为研究NTDs提供了胸腺嘧啶脱氧核苷(dTMP)代谢障碍的小鼠模型。

本发明所述的动物模型可用于研究NTDs发病机制。叶酸缺乏引起NTDs的机制尚未阐明 不清楚，在正常条件下很难控制食物中的叶酸及小鼠的营养状况，机体存在代偿作用，短时 间的叶酸缺乏不会引起叶酸代谢障碍，通过饮食建立叶酸直接缺乏的动物模型至今尚未见有 成功报道。因此，叶酸是通过何种代谢通路又是以及如何发挥作用引起NTDs的直接关系及其 机制尚未阐明不清楚。本发明可以用于研究叶酸缺乏引起胸腺嘧啶从头合成受损导致NTDs， 本发明可以动态研究NTDs的发生发展，可研究NTDs发生的时空特异性，并可针对时间动力 学多项指标进行跟踪取材、标记示踪，以及其他相关因素如何协同发挥作用，观察影响胚胎 发育的整个过程，尤其是神经系统的发育全过程。

本发明构建的动物模型，可用于研究胸腺嘧啶脱氧核苷代谢障碍诱导的NTDs的所有相关 分子和细胞水平的机制；还可用于筛选相关化合物及其他干预方法进行NTDs的防治，如，进 行回补实验，补充叶酸、肌醇、维生素，及其他营养素等，对处理后的孕鼠进行干预，观察 其是否可以降低致畸率，从而进行深入的研究和进一步验证。

附图说明：

图1-正常胎鼠与神经管畸形胎鼠形态学观察

其中：A-正常胚胎；B，C-露脑畸形(后脑)；D-露脑畸形(后脑)合并颜面部畸形；E- 露脑畸形(全脑)。

图2-5-FU注射后小鼠胚胎胸苷酸合成酶的活性

图3-5-FU注射后小鼠胚胎dUMP，dTMP指标的变化

图4-正常小鼠胚胎与神经管畸形小鼠胚胎的后脑HE染色

其中：A-正常胎鼠后脑组织HE切片的病理改变(50×)；B-神经管畸形的胎鼠后脑组织 切片的病理改变(50×)

图5-DNA损伤-彗星电泳实验

其中：A-正常胎鼠的胎脑DNA损伤-彗星电泳情况；B-神经管畸形小鼠胎脑DNA损伤- 彗星电泳情况；C-正常胎鼠与神经管畸形胎鼠胎脑DNA损伤指标，尾长(tail length，TL) 和尾矩(tail moment，TM)的情况

图6-TUNEL检测细胞凋亡

其中，A-正常胎鼠胎脑中细胞凋亡情况；B-神经管畸形胎鼠胎脑中细胞凋亡情况；C- 凋亡细胞的阳性细胞数

具体实施方式：

以下实施例仅为本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

《实施例1》胸苷酸合成酶抑制剂制备构建神经管畸形小鼠模型

1.实验动物与材料

SPF级成年C57BL/6J小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司,中国，许可证编号： SCXK(京)2006-0009)，7-8周，体重19～20g，购买后饲养一周以适应SPF级别动物房的环 境。动物房温度控制在18-29℃；相对湿度：50％-80％；换气次数：10-20次/h；空气流速 <0.18m/s；空气洁净度：相当于一万级。饲料喂养(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)， 常规饮水。实验动物的使用遵循中华人民共和国卫生部令(第55号)-医学实验动物管理实施 细则，遵循首都儿科研究所医学实验动物管理委员会章程。

5-FU购自Sigma公司，配制为贮存液浓度(25mg/ml)。Cell Lytic MTTM Cell  LysisReagent、苏木精、伊红、BSA(bovine serumalbumin)、多聚赖氨酸均购自Sigma公司； Caspase-3抗体(Mouse Specific)(Cell Signaling)、phosphohistone H3(Ser10)抗体(Cell  signaling,Boston,USA)、兔超敏两步法检测试剂盒(Cal Biochem)、comet assay kit (Trevigen,Inc.)、In Situ Cell Death Detection Kit,POD(Roche,11684817910)。

2.实验仪器

连续变倍体视显微镜、普通电子天平、精密电子天平、手术器材(眼科显微手术镊、手 术剪、眼科显微手术剪)、医用超净工作台、NanoDrop 2000分光光度计、超低温冰箱、低温 离心机、全自动切片机、摊片机、烘片机、全自动免疫组化染色机、石蜡包埋机、智能化组 织脱水机、Leica DM3000智能型生物显微镜、Leica QwinV3图像分析系统、染色机、移液 器、无菌注射器、培养皿、光学显微镜、垂直板电泳系统、脱色摇床、电泳槽、电泳仪、GelDoc  XR全自动凝胶成像系统。

3.神经管畸形小鼠动物模型的制备

C57BL/6J小鼠，自购买后在SPF级别动物房饲养适应环境一周。合笼前观察雌鼠阴道， 筛选出适合交配的雌鼠，在7:00p.m以1:1雌雄鼠合笼后，第二天早上检查阴栓，于第二天 12:00p.m记为0.5天，每组30只，然后将孕鼠随机分为实验组和对照组，在孕7天，实验 组孕鼠给予0mg/kg-60mg/kg剂量范围的5-FU水溶液腹腔注射；正常对照组孕鼠给予等体积 的生理盐水。

怀孕11.5天时，对孕鼠采取摘眼球采血。剪除小鼠胡须，避免污染，左手持鼠，使鼠眼 球突出，持镊子将小鼠眼球摘出，将血滴入预先加有抗凝剂的玻璃管内，可按摩小鼠的心脏， 增加采血量和时间。然后离心取上清，贮存于超低温冰箱。

然后将孕鼠断颈处死，浸泡于75％酒精消毒。剖腹取出妊娠子宫，将左侧和右侧的子宫 放入盛有PBS(PH7.4)的培养皿中，在体视显微镜下剥离出胎鼠，观察其畸形情况并拍照，

记录每窝胎鼠情况，活胎鼠数，死胎鼠数，吸收胎数，畸形情况及其数量，测量胎鼠体 长和体重，计算致畸率。取正常胚胎和畸形胚胎固定于10％的中性甲醛进行固定。

实验结果如表1所示,60mg/kg剂量组吸收胎100％，300mg/kg剂量组吸收胎为96.4％，随 着剂量的降低，吸收胎比例逐渐降低，12mg/kg剂量组吸收胎比例最低，神经管畸形的比例 最高，为最佳的造模剂量。畸形的大体表型如图1所示，A图是正常胚胎；B、C图是露脑畸 形(后脑未闭)；D图是后脑未闭合并颜面部畸形；E图是露脑(全脑未闭)。

表1 5-FU对胚胎的影响

《实施例2》胸苷酸合成酶活性测定及叶酸代谢生化指标检测

2.1组织总蛋白的提取与蛋白浓度的测定

参照试剂盒(CelLytic MTTM Cell Lysis Reagent)操作说明书提取正常组和实验干预组 胎鼠的脑组织中的蛋白。称取适量的胎鼠脑组织样本，加入适量的CelLytic MT试剂，转移 到预冷的研磨器中研磨后，将其转移到EP管中，低温离心10分钟取其上清进行Bradford法 测定其蛋白浓度。

溶解蛋白标准品，使其终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20ul加到96 孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20ul。加适当体积样品到96孔板样品中，然后 加标准品稀释液到20ul。各孔加入200ul的G250染色液，室温放置3-5分钟。用酶标仪测 定A595波长的吸光度。根据标准曲线计算其样本中的蛋白浓度。

2.2胸苷酸合成酶活性测定

在不同时间点0，3，9，24，48，96小时，对正常对照组和5-FU组胎鼠的胎脑取材，然 后进行超声匀浆处理，离心以105,000*g(4℃，60min)，把上清取出分为几个不同的EP管 里，一部分保存在-70℃，一部分进行酶活性检测，将饱和的5-[³H]-dUMP(10μM)和5-[³H]-dUMP, Tris–HCl buffer,5,10-CH₂-FH₄试剂加到EP管里，30℃孵育1小时，孵育结束后添加25％的 冰TCA，用10％中性活性炭进行终止反应。然后离心，收集上清，然后用liquid scintillation  spectrometer液体闪烁谱仪(Beckman LS 6500)，每一次至少重复三次。取其均值和SD。结 果表明，在5-FU干预3小时后TS活性最低。虽然之后随着时间的延长TS活性逐渐升高，但 在96h(怀孕11.5天)仍显著低于对照组结果(图2所示)。

2.3血液生化指标检查

采用梯度洗脱程序，对dTMP和dUMP进行洗脱以及量化分析。将孕鼠置于冰上，处死后 快速取胎鼠的脑组织，迅速将其放入液氮中。在实验之前,将冰冻组织均浆研磨，然后加入冰 冷TCA孵育20-30分钟。孵育结束后以3,000*g 10min，低温离心，用三辛胺氟利昂进行 中和后，再次低温离心，收集上层水相到EP管里，进行后续的HPLC检测，检测的色谱条件： 色谱柱，Polaris C18-A column(4.6×150mm，5μM；Agilent)；流动相：buffer A，10mM， 四丁基氢氧化胺(TBAH)，10mM KH2PO4；buffer B成分为10mM TBAH和甲醇。进样量：10ul， 检验波长：254nm；流速：1.5ml/min。指标结果如图3所示，注射5-FU后孕鼠血浆生化指标 在不同时间点的变化水平，结果显示与对照组相比5-FU组具有显著性差异。

TS是催化dUMP生成dTMP的关键酶。抑制TS活性会影响细胞内dTMP和dUMP的含量。 给予5-FU干预后的胎鼠在给药3、9h后dTMP的含量降低，而dUMP的含量升高。随后变化 更加明显，在96h(孕11.5天)改变最为明显，与对照组相比，5-FU干预组的dTMP含量减 少了将近50％，见图3。这些结果表明，5-FU抑制TS酶的活性影响体内dTMP的含量。

《实施例3》病理形态学检查

3.1石蜡包埋及切片

1、脱水与透明

取出固定液中的胎鼠，进行脱水与透明，经由低浓度到高浓度的乙醇逐级进行脱水：50％ 酒精→70％酒精→85％酒精→95％酒精→95％酒精→100％酒精。

透明：二甲苯I，二甲苯II(纯二甲苯)，实验中观察标本情况，直到标本完全透明。

2、渗蜡和包埋

用熔点为52-60℃的石蜡，透明后的组织块放于1:1的二甲苯与石蜡中37℃渗透过夜， 然后将温度调至58℃换为纯石蜡继续渗透，一般间隔3小时换一次纯石蜡，直到没有二甲苯 气味即可进行后续的包埋，将处理后的胎鼠放入包埋盒中，加入已经被熔化的纯石蜡，然后 使石蜡迅速凝固包埋。

3、切片与展片

用组织切片机对包埋好的胎鼠组织块进行连续切片，一般组织厚度为5μM，用毛笔拖起 蜡带，分割后放在洁净的载玻片上，滴上适量的蒸馏水放置展片台上在37-40℃烤片过夜。

4、HE染色

二甲苯(I)10min→二甲苯(II)5min→100％(I)酒精5min→100％(II)酒 精5min→95％酒精(I)5min→95％酒精(II)5min→85％酒精3min→75％酒精2min →蒸馏水中3min；苏木精染色：放入苏木精中5min，自来水洗；

盐酸酒精分化：将切片放入1％盐酸水溶液约5～15s，待切片变红并颜色较浅即可；

返蓝：流水过洗至返蓝；

伊红染色：0.5％伊红染液1-3min；

蒸馏水稍洗1-2s；

脱水：95％酒精I5min→95％酒精II 5min(新酒精)→100％酒精I5min→ 100％酒精II(纯酒精)；

透明：二甲苯(I)5min→二甲苯(II)3min；

封片：中性树胶封片；

对其进行镜下观察，结果如图3、图4所示，胚胎前脑、后脑的形态学呈现改变。

HE染色结果显示，对照组胚胎神经管发育正常，后脑完全闭合。正常对照组发育良好， 管腔规则，神经上皮的内外界膜平整，细胞的排列规则整齐密集。但是，NTDs胚胎的后脑发 育异常未完全融合，其脑神经上皮细胞排列不规整，结构紊乱，管腔不规则，内外的界膜边 缘不整齐，细胞排列松散，不规律。

透明：二甲苯(I)5min→二甲苯(II)3min；

封片：中性树胶封片；

5、彗星电泳实验观察DNA断裂情况

1)将胎鼠的胎脑组织制备成细胞悬液；

2)制备胶片：滴加0.8％正常熔点琼脂糖(以无钙镁磷酸缓冲盐溶液配制)100μl于 洁净的毛玻璃载玻片上，用盖玻片压平胶面，使琼脂糖均匀地分布在载玻片上，4℃固化10min， 揭去盖玻片，此为第一层胶；取细胞悬液与0.8％低熔点琼脂糖凝胶混匀后，取75μl滴加在 第一层胶上，用盖玻片压平胶面，4℃放置10min，此为第二层胶；待其凝固后滴加0.8％低熔 点琼脂糖，加盖盖玻片，4℃固化10min，此为第三层胶；

3)裂解：揭去盖玻片，将凝胶玻片浸没于新鲜配置的预冷裂解液中(NaCl 2.5mol/L， EDTA)；100mmol/L，Tris-HCl 10mmol/L，PH＝10，用前加入1％Triton X-100和10％DMSO)， 4℃下放置1h，使细胞裂解并使DNA松散；

4)解旋：取出铺有胶片的载玻片，置于水平电泳槽中，用碱性电泳缓冲液(NaOH 300mmol/L，EDTA 1mmol/L)盖过胶面约2.5mm，静置20min,使DNA充分解旋；

5)电泳：调节电泳仪至电压25V，电流300mA，4℃下电泳20min；

6)中和：电泳完毕后取出载玻片，用中和缓冲液滴洗3次，每次5min；

7)染色：向琼脂上滴加20μg/ml Goldviewnal I型核酸染料避光染色后，去离子水 洗掉表面染料，用盖玻片覆盖胶层，荧光显微镜下观察细胞核彗星情况。以上步骤均需避光 操作，以避免光线对DNA的再次损伤；

8)图像分析：染色后通过荧光显微镜观察细胞，采用CASP彗星图像分析软件进行分 析；

9)观察指标：尾长(tail length，TL)和尾矩(tail moment，TM)是评价DNA损伤 程度的两个重要参数。尾长是指彗星长径与短径相减的差，即DNA片段从主核向电泳正极迁 移的长度；尾矩为复合指标，指彗尾DNA百分含量与彗尾长度的乘积，它既包含尾长度的信 息，又包含尾光密度的信息。

彗星电泳实验结果表明(图5)，神经管畸形胎鼠胎脑中DNA损伤较正常胎鼠严重，并且 具有统计学差异。

6、TUNEL检测细胞凋亡

1)将石蜡包埋的组织切片用二甲苯浸洗2次，每次5min；

2)用梯度乙醇(100％、95％、90％、80％、70％)各浸洗1次，每次3min；

3)PBS漂洗3min×3次；

4)新鲜配制3％H₂O₂,室温处理10min；

5)PBS漂洗3min×3次；

6)用Proteinase K工作液(10-20μg/ml，10mM Tris/HCl，pH 7.4-8)，室温处理 15-20min；

7)PBS漂洗3min×3次；

8)制备TUNEL反应混合液，处理组50μl TdT+450μl荧光素标记的dUTP液混匀； 而阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNaseⅠ，反应 在15～25℃×10min，后面步骤同处理组；

9)玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP 液)于标本上，加盖玻片在暗湿盒中反应37℃×1h；

10)PBS漂洗3min×3次；

11)玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片在暗湿盒中反应37℃× 30min；

12)PBS漂洗3min×3次；

13)在组织处加50～100μl DAB底物，反应15～25℃×10min；

14)PBS漂洗3min×3次；

15)用苏木素，几秒后立即用自来水冲洗；

16)梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片；

17)用光学显微镜观察凋亡细胞(共计200～500个细胞)并拍照。可结合凋亡细胞形 态特征来综合判断(未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁 细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割 成块状/凋亡小体)。

TUNEL检测细胞凋亡实验结果表明(图6)，神经管畸形胎鼠发生了过度的细胞凋亡，并 且具有统计学差异。图5和图6均显示了神经管畸形胎鼠的DNA损伤显著增加，并且有统计 学意义，表明5-FU可能通过影响dTMP的合成干扰DNA复制，进而引起了DNA的损伤。