一种海星优质卵子的促熟和人工受精方法

摘要

本发明提供了一种海星优质卵子的促熟和人工受精方法，包括：（1）海星亲本的培育；（2）海星雌雄性腺组织的采集；（3）采用终浓度为2μM的1-甲基鸟嘌呤促熟海星卵子；（4）海星的人工受精。本发明首次建立了海星优质卵子的获得和人工受精方法，通过实验筛选到海星卵子最适促熟剂和促熟时间。本发明具有操作方便，高效、实用的特点，不会伤害亲体，卵子的获取不受季节限制；在棘皮动物生殖生物学和实验胚胎学研究方面具有重要的应用价值和推广应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种海星优质卵子的促熟和人工受精方法。

背景技术

海星是一类比较常见的无脊椎动物，是棘皮动物的代表钟，具有成为模式动物的有利条件：个体相对较小、生命力强、适应性广、在实验室控制条件下容易饲养；繁殖周期相对短，在实验室条件下可以控制；要求能分批产卵或连续产卵，有一定的产卵量；在无污染自然条件下无雌雄同体现象。早在1882年，埃黎耶·埃黎赫·梅契尼可夫就对海星幼虫进行研究，首度发现了吞噬细胞而获得1908年诺贝尔生理学或医学奖。因此，海星是开展生物学研究的良好实验材料，不仅如此，海星具有较高的药用保健和营养价值，其生物资源的开发利用也受到人们的重视。

海胆胚胎易于观察和操作，是进行显微操作、开展生殖发育生物学的良好素材，故而其优质卵子的获取显得尤为重要。关于海星优质卵子的获取及人工受精方法国内外未见报道。

发明内容

本发明提供了一种海星优质卵子的促熟和人工受精方法。本发明建立了一种快速催熟海星卵子和简便的人工受精方法。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种海星优质卵子的促熟和人工受精方法，它包括以下步骤：

（1）海星亲本的培育

    将海星亲本置于15～16℃恒温的水族箱内培养，培养期间投喂小型浮游动物，2～3天投喂一次，4～6天换水100%；

（2）海星性腺组织的采集

    分别采集海星臂雌性性腺中的卵液和雄性性腺中的精液；

（3）海星卵子的人工促熟

向采集到的所述卵液中加入终浓度为2μM的1-甲基鸟嘌呤，置于16℃培养箱中，用摇床摇动1～2h后卵子成熟；采用新鲜海水洗涤卵子备用；

（4）人工受精

将采集到的所述精液用海水稀释50～100倍得精子稀释液，吸取所述精子稀释液加入到2×10³～5×10³个卵子中，再加入30～50mL海水，轻轻摇动5～10分钟，在解剖镜下观察受精效果，卵膜举起，表明受精完成。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（1）中初始水温为12℃，采用电热棒加温，每天升温0.5～1℃，至16℃时维持此温度。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（1）中小型浮游动物为卤虫和/或小型桡足类。

对上述技术方案的进一步改进：所述小型浮游动物的饲喂量为每只海星0.5～1g。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（2）中采用直径2～3mm的锥形钢针在海星一臂上轻轻打开一个直径为2～3mm的小孔，用弯头镊子将发育良好的少量性腺取出，将取出的雌性性腺放于少许海水中，置于冰上，通过纱网过滤后获得海星卵子；将取出的雄性性腺组织剪碎离心，取上清液体为精液，置于冰上。

对上述技术方案的进一步改进：所述性腺呈橘红色为雌性且表明性腺发育良好；性腺呈乳白色为雄性且表明性腺发育良好。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（3）中卵液中卵子的浓度为1×10³~2×10³个/mL。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（4）中精子稀释液的浓度为1×10⁵~2×10⁶个/mL。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明通过实验筛选到适用于海星卵子的最适促熟剂和最适促熟时间，采用该促熟剂可以迅速获得优质的成熟卵子，且不会对后续受精等操作产生任何影响，从而建立了一种快速获得海星优质卵子和人工受精的方法；而且，本发明不会对海星亲体造成很大伤害而死亡，亲体可以多次使用，卵子的获得不受季节限制，可以做到按需供卵，为开展生殖生物学和遗传学研究提供了良好的实验材料。

附图说明

图1为本发明实施例促熟前后的海星卵子形态，其中图1A为促熟前的海星卵子图，图1B为促熟后的海星卵子图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

本发明所述海星优质卵子的促熟和人工受精方法包括以下步骤：

1、海星亲本的培育

将随机选取的20只成熟海星亲本（根据性腺决定雌性亲本和雄性亲本的数量）置于100L水族箱内养殖，初始水温为12℃，采用电热棒加温，每天升温0.5～1℃，至16℃时维持此温度。培养期间投喂小型浮游动物如卤虫和小型桡足类，每次投喂10～20g（每只海星0.5～1g），2-3天投喂1次，每隔6天换水100%，亲本培育在一周以上。

2、海星性腺组织的采集

采用直径3mm的锥形钢针在海星一臂上轻轻打开一个小孔，用弯头镊子将少量性腺取出（因海星具有5条海星臂，每条海星臂都具有性腺组织，同时海星还具有很强的再生能力，仅从1～2条海星臂取少量性腺并不会对海星造成伤害，海星借助于其快速再生能力，可以迅速恢复为原来的状态，所以采集少量性腺组织对其生物影响很小，不会对海星个体造成伤害）。性腺呈橘红色为雌性且表明性腺发育良好；将取出的少量雌性性腺放于装有少许海水的烧杯中，置于冰上，从雌性性腺中获得含有海星卵子的海星卵液。性腺呈乳白色为雄性且表明性腺发育良好，将取出后的少量雄性性腺放于1.5mL离心管中，用剪刀剪碎，取上清液体即为海星精液，置于冰上。

3、海星卵子的人工促熟

取5mL海星卵液（卵液中卵子的浓度为1×10³~2×10³个/mL）置于装有海水的50mL离心管中，加入1-甲基鸟嘌呤使其终浓度为2μM，置于16℃培养箱中，用摇床不断摇动，1h后卵子成熟。用新鲜海水冲洗卵子，冲洗后将卵子置于50mL离心管中，采用新鲜海水洗涤卵子备用。本发明中的卵子也可以采用现有的未成熟的卵子进行促熟。

本发明经实验创造性的提供了1-甲基鸟嘌呤可以具有促熟海星卵子的功能，而且1-甲基鸟嘌呤的使用量也具有至关重要的作用，只有合适的用量才可以起到有效促熟海星卵子的作用，用量太高或太低都起不到促熟作用。图1为使用1-甲基鸟嘌呤促熟前后的海星卵子形态图，从图1A和图1B的显微镜观察照片中可以看到促熟前卵子略显不规则，卵内有生殖泡，促熟后的卵子呈圆形，生殖泡消失。

4、人工受精

取10μL海星精液放于1mL海水中稀释得到精子稀释液（稀释后的精子稀释液经显微镜观察大约浓度为5×10⁵个/mL），取300μL所述精子稀释液加入到5×10³卵子中，轻轻摇动，5～10分钟后受精过程完成，解剖镜下统计受精率为95.8%，受精完成后，采用新鲜海水冲洗受精卵，备用。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。