甘蔗促根壮苗培养基及甘蔗组培瓶苗直接田间定植方法

摘要

本发明提出一种甘蔗促根壮苗培养基，其由包括有含有大量元素的混合物Ⅰ、含有微量元素的混合物Ⅱ、铁盐混合物、有机混合物、植物激素和蔗糖以琼脂为固化剂制备成；特别地，混合物Ⅰ包括有KNO3（800～1000）mg/L、Ca(NO3)2·4H2O（650～800）mg/L、NH4NO3（500～650）mg/L、KH2PO4（100～150）mg/L、MgSO4·7H2O（170～200）mg/L和CaCl2·2H2O（60～80）mg/L。本发明培养基能显著培壮甘蔗组培苗、促进根系发育。又提出甘蔗组培瓶苗直接田间定植方法，包括：1、分装本发明的培养基于玻璃试管内；2、玻璃试管内接种组培分化苗并封口培养；3、组培分化苗培养后依次炼苗、田间定植。本发明方法具有步骤少、操作简单的特点。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，更确切地是涉及甘蔗组织培养基以及甘蔗瓶苗的培养方法。

背景技术

甘蔗是无性繁殖作物，生产上一直采用茎芽繁殖，用种量大，增加生产成本投入，且繁殖系数低，严重制约了优良新品种推广速度，使得品种更新困难；同时，绝大多数蔗区均是采用连作栽培制度，甘蔗长期遭受病害侵害，使产量和品质下降严重，加速了品种退化。

甘蔗组织培养是一种高效的繁殖技术，也是获得甘蔗无毒种苗的有效途径，在甘蔗产业中发挥着重要作用。在巴西、古巴等国90%蔗区已实现组织培养技术培育脱毒种苗、扩繁良种、加快良种推广，其使用甘蔗脱毒健康种苗使甘蔗增产20%-40%，蔗糖分增加0.5%（绝对值）以上，经济和社会效益显著。巴西已通过政府立法，在全国建立甘蔗脱毒健康种苗生产繁育体系。在国内，自1998年开始到现在，许多专家先后采用不同技术和材料对甘蔗进行脱毒健康种苗的研究，取得了显著效果。但是，移栽成活率低直接影响了植物组培工厂化快速繁育生产的应用效果，而影响组培苗移栽成活率低的主要因素是由于采用最普遍的MS培养基培育出的组培苗植株较为弱小、根系欠发达，很难适应外界环境所致。培养基是甘蔗快繁的关键，培养基的配比，因植物的不同而异，随植物不同生长和发育阶段而存在显著差异。因植物在不同生长发育时期所需的营养物质也不相同，只有满足它生长发育所需的各种营养条件和环境条件，其才能生长迅速、植株健壮。因此，迫切需要技术方法上的改进革新，保证甘蔗组培苗的健壮和发达根系，以提高其成活率，为甘蔗组培苗进入商业化规模生产提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的是提出一种甘蔗促根壮苗培养基，其能显著培壮甘蔗组培苗、促进根系发育，使甘蔗组培苗植株坚挺、叶片直立、根系发达；又提出一种甘蔗组培瓶苗直接田间定植方法，该方法只需更换培养基和控制培养条件即可显著提高组培苗炼苗成活率，具有步骤少、操作简单的特点，非常适合于甘蔗组培苗工厂化、专业化生产。

本发明人首先采用不同硝铵比的组培培养基进行组培苗的生根试验，具体是以1/2MS培养基及1/2MS培养基的总N含量（31mmol/L）为基础，通过修改1/2MS培养基中含有N元素物质的配方使N元素总量为31mmol/L，取硝态氮与铵态氮的摩尔浓度比为1：4、1：3、1：1、3：1和4：1的分别作为培养基A至E，培养基A至E的含N物质的配比见表1，培养基A至E含有的其他物质与1/2MS培养基的配方相同。

分别取培养基A至E 100ml分装到若干玻璃试管中后灭菌，然后在无菌操作台上，在每个玻璃试管内接种1株继代增殖的组培苗并封口，然后在温度25℃、光照度4000 lx、湿度70%~85%、光照时间12 h/d的条件下培养，使组培苗的根系在较短的时间（约50天）内生产至玻璃试管的底部时停止培养，将组培苗从玻璃试管中取出用纯水洗净后，用根系扫描分析系统（WinRHIZO-LA2400，Canada）对甘蔗组培苗根系进行扫描，得到甘蔗组培苗根系形态（见表2），还对甘蔗组培苗生物量和株高进行了测试（见表3）。

 从表2可见，在总根长、根平均直径、根表面积和总体积的根系生长情况上，培养基D培养的组培苗显著高于其他培养基，培养基C和E次之；从表3可见，在干重、株高、根冠比的组培苗生长情况上，培养基D培养的组培苗显著高于其他培养基，培养基C和E次之。因此，培养基中硝态氮与铵态氮的摩尔浓度比为3：1时能很好的促进组培苗的生长发育，对甘蔗苗有壮苗、促根作用，硝态氮与铵态氮的摩尔浓度比为1：1和4：1次之。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

甘蔗促根壮苗培养基，其由包括有含有大量元素的混合物Ⅰ、含有微量元素的混合物Ⅱ、铁盐混合物、有机混合物、植物激素和蔗糖，并以琼脂为固化剂制备成。

含有大量元素的混合物Ⅰ包括有KNO₃ （800～1000）mg/L、Ca(NO₃)₂·4H₂O（650～800）mg/L、NH₄NO₃ （500～650）mg/L、KH₂PO₄（100～150）mg/L、MgSO₄·7H₂O（170～200）mg/L和CaCl₂·2H₂O（60～80）mg/L，其中硝态氮与铵态氮的摩尔浓度比为2.5：1～4：1。

含有微量元素的混合物Ⅱ包括有H₃BO₃（2～4）mg/L、MnSO₄·4H₂O（8～15）mg/L、ZnSO₄·7H₂O（3～6）mg/L、NaMoO₄·2 H₂O（0.1～0.2）mg/L、KI（0.3～0. 5）mg/L。

铁盐混合物包括有Na₂-EDTA（16～22）mg/L、FeSO₄·7H₂O（12～16）mg/L和Na₂SiO₃·9H₂O（24～33）mg/L。

有机混合物包括有肌醇（37～65）mg/L、甘氨酸（0.3～0. 6）mg/L、盐酸硫胺素（0.3～0.6）mg/L、盐酸吡哆醇（0.2～0.3）mg/L和烟酸（0.2～0.3）mg/L。

植物激素包括有IBA（0.1～0.2）mg/L和NAA（0.05～0.1）mg/L。

蔗糖为（10～15）mg/L；琼脂为（4～6）mg/L。

先分别按比例配制混合物Ⅰ、混合物Ⅱ、铁盐混合物和有机混合物；再将混合物Ⅰ、混合物Ⅱ、铁盐混合物和有机混合物放入容器内混匀，然后加入蔗糖和植物激素的IBA和NAA，同时加入蒸馏水定容使各组份含量达到设定比例，调整溶液pH值至5.5～6.0；向上述溶液加入琼脂并加热使琼脂全部溶化，最后使溶液冷却得到甘蔗促根壮苗固体培养基。

优化方案，本发明的甘蔗促根壮苗培养基还包括有活性炭（400～600）mg/L，活性炭随琼脂加入到溶液中。

甘蔗组培瓶苗直接田间定植方法，其包括如下步骤：

步骤1、准备若干玻璃试管，每个玻璃试管内装入50mL如上所述的甘蔗促根壮苗固体培养基后进行灭菌。

步骤2、在无菌环境下，在每个玻璃试管内的甘蔗促根壮苗固体培养基上接种1株继代增殖的组培分化苗并用封口膜封口，放置于培养室内培养，控制培养室光照强度为2500～3000 lx，照明14 h/d，温度为26～28℃，湿度70%～80%，每天照明10～16小时。

步骤3、待组培分化苗生长至接触到玻璃试管的封口膜时，将玻璃试管放置于培养室外或温室内炼苗，3d后，打开玻璃试管的封口膜，再放置14d后，拔出组培苗，剪去老叶和叶尖，直接进行田间定植。

本发明具有以下突出的实质性特点和显著的进步：

1、本发明确立了适合于甘蔗组培分化苗促根壮苗培养基配方，再通过调控甘蔗组培苗的培养条件，使得甘蔗组培苗在组培瓶内生长健壮，直立，完成从异养到自养的过程，在减少了组培苗假植过程的前提下，保证了组培苗移栽成活率，同时组培苗移栽后恢复期短。

2、本发明的甘蔗组培瓶苗直接田间定植方法，程序简化、步骤少、操作简单，节约了人力和物力，且田间定值后成苗率高，恢复期短，非常适合专业化、工厂化扩繁生产，对推进甘蔗组培苗扩繁体系具有重大意义。

具体实施方式

下面对本发明作进一步说明，但它们不是对本发明的进一步限制。

实施例1

本实施例的甘蔗促根壮苗培养基，其由包括有含有大量元素的混合物Ⅰ、含有微量元素的混合物Ⅱ、铁盐混合物、有机混合物、植物激素和蔗糖以琼脂为固化剂制备成。

含有大量元素的混合物Ⅰ包括有KNO₃ 800 mg/L、Ca(NO₃)₂·4H₂O 650 mg/L、NH₄NO₃ 650 mg/L、KH₂PO₄ 100 mg/L、MgSO₄·7H₂O 170 mg/L和CaCl₂·2H₂O 60 mg/L，其中硝态氮与铵态氮的摩尔浓度比为2.65:1，总氮含量为29.7 mmol/L。

含有微量元素的混合物Ⅱ包括有H₃BO₃ 2 mg/L、MnSO₄·4H₂O 8 mg/L、ZnSO₄·7H₂O 3 mg/L、NaMoO₄·2H₂O 0.1 mg/L、KI 0.3 mg/L。

铁盐混合物包括有Na₂-EDTA 16 mg/L、FeSO₄·7H₂O 12 mg/L和Na₂SiO₃·9H₂O 24 mg/L。

有机混合物包括有肌醇 37 mg/L、甘氨酸 0.3 mg/L、盐酸硫胺素 0.3 mg/L、盐酸吡哆醇 0.2 mg/L和烟酸 0.2 mg/L。

植物激素包括有IBA 0.1 mg/L和NAA 0.05 mg/L。

蔗糖为 5 mg/L；琼脂为 3 mg/L；活性炭为400 mg/L。

为方便配置，先分别将混合物Ⅰ扩大10倍、混合物Ⅱ扩大200倍、铁盐混合物扩大200倍、有机混合物扩大200倍配成母液，使用时再取母液稀释相应倍数即可。分别移取混合物Ⅰ100 mL、混合物Ⅱ5 mL、铁盐混合物5 mL和有机混合5 mL物放入容器内混匀，然后加入蔗糖5mg和植物激素的IBA0.1mg和NAA0.05mg，同时加入蒸馏水定容至1000mL使各组份含量达到设定浓度，调整溶液pH值至5.5；向上述溶液加入400mg活性炭和3mg琼脂并加热使琼脂全部溶化，最后使溶液冷却得到甘蔗促根壮苗固体培养基。

实施例2

本实施例的甘蔗促根壮苗培养基，其由包括有含有大量元素的混合物Ⅰ、含有微量元素的混合物Ⅱ、铁盐混合物、有机混合物、植物激素和蔗糖以琼脂为固化剂制备成。

含有大量元素的混合物Ⅰ包括有KNO₃ 900 mg/L、Ca(NO₃)₂·4H₂O 720 mg/L、NH₄NO₃ 600 mg/L、KH₂PO₄ 125 mg/L、MgSO₄·7H₂O 185 mg/L和CaCl₂·2H₂O 70 mg/L，其中硝态氮与铵态氮的摩尔浓度比为3:1，总氮含量为30 mmol/L。

含有微量元素的混合物Ⅱ包括有H₃BO₃ 3 mg/L、MnSO₄·4H₂O 11.5 mg/L、ZnSO₄·7H₂O 4.5 mg/L、NaMoO₄·2 H₂O 0.15 mg/L、KI 0.4 mg/L。

铁盐混合物包括有Na₂-EDTA 19 mg/L、FeSO₄·7H₂O 14 mg/L和Na₂SiO₃·9H₂O 28 mg/L。

有机混合物包括有肌醇50 mg/L、甘氨酸0.45 mg/L、盐酸硫胺素0.45 mg/L、盐酸吡哆醇0.25 mg/L和烟酸0.25 mg/L。

植物激素包括有IBA0.2 mg/L和NAA0.1 mg/L。

蔗糖为12.5mg/L；琼脂为4.5 mg/L；活性炭为500 mg/L。

为方便配置，先分别将混合物Ⅰ扩大10倍、混合物Ⅱ扩大200倍、铁盐混合物扩大200倍、有机混合物扩大200倍配成母液，使用时再取母液稀释相应倍数即可。分别移取混合物Ⅰ100 mL、混合物Ⅱ5 mL、铁盐混合物5 mL和有机混合5 mL物放入容器内混匀，然后加入蔗糖12.5 mg和植物激素的IBA0.2 mg和NAA0.1 mg，同时加入蒸馏水定容至1000mL使各组份含量达到设定浓度，调整溶液pH值至5.5；向上述溶液加入500 mg活性炭和4.5 mg琼脂并加热使琼脂全部溶化，最后使溶液冷却得到甘蔗促根壮苗固体培养基。

实施例3

本实施例的甘蔗促根壮苗培养基，其由包括有含有大量元素的混合物Ⅰ、含有微量元素的混合物Ⅱ、铁盐混合物、有机混合物、植物激素和蔗糖以琼脂为固化剂制备成。

含有大量元素的混合物Ⅰ包括有KNO₃ 1000 mg/L、Ca(NO₃)₂·4H₂O 800 mg/L、NH₄NO₃ 500 mg/L、KH₂PO₄ 150 mg/L、MgSO₄·7H₂O 200 mg/L和CaCl₂·2H₂O 80 mg/L，其中硝态氮与铵态氮的摩尔浓度比为3.67:1，总氮含量为29.2mmol/L。

含有微量元素的混合物Ⅱ包括有H₃BO₃ 4 mg/L、MnSO₄·4H₂O 15 mg/L、ZnSO₄·7H₂O 6 mg/L、NaMoO₄·2H₂O 0.2 mg/L、KI 0.5 mg/L。

铁盐混合物包括有Na₂-EDTA 22 mg/L、FeSO₄·7H₂O 16 mg/L和Na₂SiO₃·9H₂O 33 mg/L。

有机混合物包括有肌醇 65 mg/L、甘氨酸 0.6 mg/L、盐酸硫胺素 0.6 mg/L、盐酸吡哆醇 0.3 mg/L和烟酸 0.3 mg/L。

植物激素包括有IBA 0.3 mg/L和NAA 0.15 mg/L。

蔗糖为 15 mg/L；琼脂为 6 mg/L；活性炭为600 mg/L。

为方便配置，先分别将混合物Ⅰ扩大10倍、混合物Ⅱ扩大200倍、铁盐混合物扩大200倍、有机混合物扩大200倍配成母液，使用时再取母液稀释相应倍数即可。分别移取混合物Ⅰ100 mL、混合物Ⅱ5 mL、铁盐混合物5 mL和有机混合5 mL物放入容器内混匀，然后加入蔗糖15mg和植物激素的IBA0.3mg和NAA0.15mg，同时加入蒸馏水定容至1000mL使各组份含量达到设定浓度，调整溶液pH值至5.5；向上述溶液加入600mg活性炭和6mg琼脂并加热使琼脂全部溶化，最后使溶液冷却得到甘蔗促根壮苗固体培养基。

实施例4

甘蔗组培瓶苗直接田间定植方法，其包括如下步骤：

步骤1、准备若干玻璃试管，每个玻璃试管内分别装入50mL实施例1、实施例2和实施例3的甘蔗促根壮苗固体培养基后进行灭菌。

步骤2、在无菌环境下，在每个玻璃试管内的甘蔗促根壮苗固体培养基上接种1株继代增殖的组培分化苗并用封口膜封口，放置于培养室内培养，控制培养室光照强度为3000 lx，温度为28℃，湿度为75%，每天照明14 小时。

步骤3、待组培分化苗生长至接触到玻璃试管的封口膜时，将玻璃试管放置于培养室外或温室内炼苗，3d后，打开玻璃试管的封口膜，再放置14d后，拔出组培苗，剪去老叶和叶尖，直接进行田间定植。

定植后30d后调查甘蔗苗的成活率，量取株高，数叶片数，拔取10株洗净烘干称取鲜重。具体结果如表4所示。

同时，进行本发明的甘蔗组培瓶苗直接田间定植方法的对照试验，对照试验与本发明的甘蔗组培瓶苗直接田间定植方法的区别为步骤1中每个玻璃试管内装入50mL的1/2MS培养基，步骤2和步骤3相同。

从表4可见，由本发明的方法培养的甘蔗组培瓶苗的成活率、株高、干重和叶片数均显著高于对照试验。可见，采用本发明的甘蔗促根壮苗固体培养基培养后的甘蔗组培瓶苗田间种植的存活情况明显优于以常规培养基——1/2MS培养基培养后的甘蔗组培瓶苗，可见本发明的甘蔗促根壮苗固体培养基能显著培壮甘蔗组培苗、促进根系发育，使甘蔗组培苗植株坚挺、叶片直立、根系发达，本发明的定植方法在炼苗后不需要对甘蔗苗进行杀菌、清洗等工序就直接田间定值，在达到甘蔗苗成苗率高、生长好的前提下，本发明的定植方法简化了培养步骤，节约了人力和物力，非常有利于甘蔗育苗的专业化、工厂化扩繁生产。