甘蔗根际假单胞菌的分离鉴定及其对甘蔗的促生作用

摘要

甘蔗是世界主要的能源作物和糖料作物，广西是甘蔗的主产区，年甘蔗糖产量约占全国的70％。然而广西蔗区土壤肥力低，氮肥施用量高，不仅造成高成本还会污染环境。通过接种促生固氮菌而降低氮肥施用量，从而降低甘蔗种植成本，是一种节能环保的有效途径。本研究从甘蔗根际土壤中分离了一批促生假单胞菌，对其16S rRNA基因，nifH固氮基因和抗生素基因进行了克隆测序及鉴定，并通过Rep-PCR指纹图谱分析技术揭示了细菌个体间在遗传上的亲缘关系，根据细菌的促生特性及对甘蔗病原真菌的拮抗作用，筛选出优良菌株CY4和CN11，结合BIOLOG技术，检测了优良菌株的代谢多样性，同时结合GFP标记技术检测了其在甘蔗中的定殖能力，并用该优良菌株接种了两个不同甘蔗品种，证实了其能促进甘蔗的生长，用15N稀释技术证实了其对甘蔗具有联合固氮的能力。主要研究结果如下:　　1.从甘蔗根际土壤分离到250株根际细菌，筛选得到100株优良促生菌，经16SrDNA序列分析显示，有30个菌株属于假单胞菌属。　　2.30株假单胞菌均具有多种促生特性，其中26株具有良好的溶解无机磷的能力，20株具有分泌嗜铁素的能力，12株具有分泌氨的能力，13株具有分泌氰化氢的能力，18株能以ACC为唯一氮源生长，IAA分泌量在13.12～312.07μg mL-1（添加色氨酸）和12.92～23.24μg mL-1(不添加色氨酸)，固氮酶活性在6.16～108.30μmol C2H2 h-1 mL-1，ACC脱氨酶活性在15.13～77.0 mol mg-1 h-1。真菌拮抗实验表明，14株抗甘蔗黑穗病病原菌，11株抗甘蔗凤梨病病原菌。　　3.利用PCR技术对30株假单胞菌的nifH基因和抗生素相关基因进行分子检测，结果发现有10株菌株的基因组DNA中能扩增出大小约为360 bp的固氮酶nifH基因，4株能扩增出大小约为1.15 kb的吩嗪-1-羧酸PCA基因，5株能扩增出大小约为786 bp的吡咯菌素PRN基因，9株能扩增出大小约为587 bp的氢氰酸HCN基因。　　4.利用GFP标记技术证实优良菌株CY4和CN11均能在甘蔗组培苗中定殖。采用室内盆栽试验，分别比较了优良促生菌株CY4和CN11接种对不同固氮特性的两个甘蔗品种GT11和GXB9生长生理、内源激素和固氮效率的影响。结果表明，接种促生假单胞菌CY4和CN11均能不同程度地促进甘蔗植株生长，显著增加其株高和鲜重，同时也能在一定程度上提高甘蔗内源激素的含量及固氮效率。　　本试验筛选获得30株具有良好抗病或促生作用的假单胞菌，尤其是促生效果突出的Pseudomonas koreensis CY4和Pseudomonas entomophila CN11，这两株假单胞菌具有研发成为生物菌肥的潜力。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 植物根际促生菌的概念

1．2 植物根际促生菌的种类

1．3 禾本科植物的根际固氮菌

1．4 假单胞菌属

1．5 假单胞菌对植物促生作用的机制

1．5．1 嗜铁素作用

1．5．2 抗生作用

1．5．3 细菌的定殖与竞争

1．5．4 消除植物根际土壤的有毒物质

1．5．5 次生抗性代谢产物

1．5．6 诱导系统抗性作用

1．6 假单胞菌的应用及展望

1．7 BIOLOG方法

1．8 本研究的研究内容及意义

1．9 技术路线

2 甘蔗根际土壤假单胞菌的分离和纯化

2．1 材料和方法

2．1．1 土壤的采集

2．1．2 培养基

2．1．3 甘蔗根际固氮细菌的分离

2．1．4 甘蔗根际固氮细菌的纯化与保存

2．2 结果与分析

2．2．1 甘蔗根际细菌的分离和纯化

2．3 小结

3．1 材料与方法

3．1．1 培养基

3．1．2．固氮酶活性的测定

3．1．3 平板法检测细菌溶解磷酸钙特性

3．1．4 细菌产嗜铁素测定

3．1．8 16S rRNA基因序列的扩增与测定

3．1．9 假单胞菌的系统发育分析

3．1．11 固氮酶nifH基因的检测

3．1．12 假单胞菌抗生素基因的检测

3．2 结果与分析

3．2．1 假单胞菌的筛选和鉴定结果

3．2．2 假单胞菌系统进化树分析

3．2．3 假单胞的PGPR特性

3．2．4 假单胞菌nifH基因检测结果

3．2．5 假单胞菌抗生素基因检测结果

3．3 讨论

4 假单胞菌属Rep-PCR指纹图谱分析

4．2 Rep-PCR聚类分析

4．3 结果与分析

4．3．2 假单胞菌的REP-PCR基因指纹图谱分析

4．3．3 假单胞菌的ERIC-PCR基因指纹图谱分析

4．4 小结

5 BIOLOG表型微平板检测试验

5．1 BIOLOG试验方法

5．2 结果与分析

5．2．2 假单胞菌CY4和CN11代谢多样性主成分分析

5．3 小结

6 CY4和CN11在甘蔗组培苗中的定殖

6．1 材料和方法

6．1．1 材料

6．1．4 荧光显微镜检测CY4和CN11在甘蔗组培苗中的定殖

6．2 结果与分析

6．2．2 CY4和CN11在甘蔗组培苗根、茎和叶中的定殖

6．3 小结

7．1 试验材料

7．1．1 植物材料

7．1．2 供试菌株

7．1．3 试验土壤

7．2．1 接种液的准备

7．2．2 甘蔗育苗移栽

7．2．7 甘蔗β-1，3葡聚糖酶和几丁质酶含量的测定

7．2．8 甘蔗RNA的提取及逆转录合成cDNA

7．2．10 CY4和CN11接种桶栽甘蔗的15N同位素稀释试验

7．3 结果与分析

7．3．1 接种假单胞菌对两个品种甘蔗不同时期株高、鲜重的影响

7．3．2 接种假单胞菌对两个品种甘蔗不同时期抗氧化物酶活的影响

7．3．3 接种假单胞菌对两个品种甘蔗不同时期植物内源激素的影响

7．3．4 接种假单胞菌对两个品种甘蔗不同时期β-1，3葡聚糖酶活性和几丁质酶活性的影响

7．3．5 接种假单胞菌后甘蔗固氮基因的表达

7．3．6 接种假单胞菌对两个品种甘蔗全氮含量、15N原子百分超和固氮百分率的影响

7．4 讨论

8 结论

8．1 全文总结

8．2 论文创新点

8．3 问题与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况