一株樱桃根际促生假单胞菌及其应用

摘要

本发明公开了一株樱桃根际促生假单胞菌，其分类命名为假单胞菌pseudomonas sp.，已于2011年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5319。本发明还公开了上述樱桃根际促生假单胞菌在促进樱桃生长中的应用。该菌株制成菌剂接种于樱桃扦插苗，结果表明，该菌剂可明显促进樱桃根系生长，提高细根的比例，增加樱桃苗地径和苗高的生长。与对照相比，差异达显著水平。将本发明的樱桃根际促生假单胞菌接种到发酵鸡粪中制成生物肥料，施用于六年生的大樱桃根系周围，可显著提高根系活力，活化土壤中的磷和钾。以上研究结果表明，本发明的樱桃根际促生假单胞菌能明显促进大樱桃生长发育，改善樱桃根际土壤的生长环境。

说明书

技术领域

本发明涉及一株樱桃根际促生假单胞菌及其应用。 

背景技术

樱桃(Cerasus pseudocerasus(Lindl.)G.Don)为蔷薇科(Rosaceae)樱属(Cerasus Mill.)植物，是落叶果树中果实成熟最早的树种之一，其果实色泽鲜艳、香味浓郁、营养丰富，并具有一定的医疗保健价值。樱桃施肥是樱桃管理过程中的一个不可忽略的环节。施肥效应除了受土壤、植物本身营养特性和施肥量等的影响外，还与肥料品种等有关。现阶段樱桃施肥以速效肥料为主，虽然大幅度的提高了樱桃产量，但速效肥料养分利用率低下，容易造成土壤板结，地表水的富营养化和地下水的污染，还会导致樱桃果实品质的急剧下降。 

众所周知，微生物广泛地存在于自然界中，与土壤肥力和作物微生态环境关系密切，所以许多学者将微生物与农业联系起来，开创了微生物农业工程。各类微生态制剂的研究与应用技术不断被报道，微生物肥料就是其中之一。微生物肥料不仅能改良土壤，改善土壤区系的生态环境，还能有效提高植物对土壤养分的吸收。因此，探寻新的肥料，尤其是生物质肥料，以替代或部分替代化肥的研究备受关注。 

植物根际的微生物多而活跃，构成了根际特有的微生物区系。植物根际促生细菌(PGPR)是生存在植物根际范围中，能直接或间接促进植物生长或对病原菌有拮抗作用的有益的细菌统称。植物根际促生细菌可分泌植物促生物质，包括植物激素、维生素、氨基酸和其它活性有机小分子及衍生物等；还可改善植物根际的营养环境，有效控制植物病害等。植物根际促生细菌的类群繁多，其中既有有益的种群，也有有害的种群。据不完全统计，已发现包括假单胞菌和芽抱杆菌等20多个属的植物根际促生细菌具有防病促生潜能的报道。目前，有关大樱桃根际促生细菌菌株的筛选及应用的研究未见报道。 

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一株樱桃根际促生假单胞菌及其应用。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

一株樱桃根际促生假单胞菌，其分类命名为假单胞菌pseudomonas sp.，已于2011年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5319。 

所述樱桃根际促生假单胞菌的菌落特征为：在LB平板上培养24h后呈圆形不透明，表 面光滑；菌体细胞大小为(0.5-1.0)μm×(1.5-2.5)μm；不产芽孢，G^-，细胞直或微弯杆状。 

所述樱桃根际促生假单胞菌的生理生化特征为：明胶液化试验阴性，淀粉水解试验阴性，吲哚试验阴性，甲基红试验阴性，伏-普试验阴性，硝酸盐还原试验阳性，柠檬酸盐利用试验阳性，硫化氢试验阴性，葡萄糖产酸阳性，葡萄糖产气阴性，运动性试验阳性，果糖试验阴性，蔗糖试验阴性，甘露醇试验阴性，接触酶试验阳性，卵磷脂酶试验阴性，脲酶试阴性，鸟氨酸脱羧酶试验阴性，赖氨酸脱羧酶试验阴性。 

所述樱桃根际促生假单胞菌的最适培养条件为：LB培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml。温度：37℃，pH 7.0。 

所述樱桃根际促生假单胞菌可以用于制备微生物肥料。应用时，培养樱桃根际促生假单胞菌，得菌悬液，菌悬液作为液态肥料，菌悬液的浓度优选为1.0×10⁸cfu/ml。或：培养樱桃根际促生假单胞菌，得菌悬液，然后将菌悬液接种到有机肥中，制成樱桃生物有机肥，菌悬液的浓度优选为5.0×10⁸cfu/毫升，樱桃有机肥中活菌数优选为0.5×10⁸cfu/g。 

所述有机肥为腐熟鸡粪。 

本发明还提供了一种微生物肥料，是通过以下制备方法得到的：培养樱桃根际促生假单胞菌，得菌悬液，菌悬液作为液态肥料。或：培养樱桃根际促生假单胞菌，得菌悬液，然后将菌悬液接种到有机肥中，制成樱桃生物有机肥。 

经研究表明，本发明的樱桃根际促生假单胞菌制备的菌悬液接种于樱桃扦插苗可明显促进樱桃根系生长，提高细根(＜2mm)的比例，增加樱桃苗地径和苗高的生长。与对照相比，差异达极显著水平。将本发明的樱桃根际促生假单胞菌接种到发酵鸡粪中制成生物肥料，施用于六年生的大樱桃根系周围，可显著提高根系活力，活化土壤中的磷和钾。以上研究结果表明，本发明的樱桃根际促生假单胞菌能明显促进大樱桃生长发育，改善樱桃根际土壤的生长环境，本发明为将来开发大樱桃专用的微生物肥料提供了优良的菌株资源，将会得到广泛的应用。 

附图说明

一株樱桃根际促生假单胞菌，菌株为YT3，该菌株分类命名为假单胞菌pseudomonas sp.，已于2011年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.5319。 

图1为YT3处理组与对照组的樱桃根系对比图。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。 

实施例1樱桃根际促生假单胞菌的筛选 

(1)筛选过程： 

通过梯度稀释法，从山东省泰安市樱桃根际土样中分离出73株分离物，从山东省淄博市沂源县南麻樱桃园的根际土样中分离出373株分离物。通过三区划线法对分离到的细菌进行纯化，并通过镜检判断菌株是否纯化，对纯化后的细菌进行编号，挑取单菌落，转接到LB斜面上保存备用。通过保绿法筛选出25株保绿效果较好的菌株，结合萝卜子叶增重法，最终筛选出1株具有良好促生效果的细菌，记为YT3。 

(2)菌落特征及菌体形态 

在LB平板上培养24h后呈圆形不透明，表面光滑。菌体细胞大小为(0.5-1.0)μm×(1.5-2.5)μm。不产芽孢，G^-，细胞直或微弯杆状。 

(3)生理生化特征 

明胶液化试验阴性，淀粉水解试验阴性，吲哚试验阴性，甲基红试验阴性，伏-普试验阴性，硝酸盐还原试验阳性，柠檬酸盐利用试验阳性，硫化氢试验阴性，葡萄糖产酸阳性，葡萄糖产气阴性，运动性试验阳性，果糖试验阴性，蔗糖试验阴性，甘露醇试验阴性，接触酶试验阳性，卵磷脂酶试验阴性，脲酶试阴性，鸟氨酸脱羧酶试验阴性，赖氨酸脱羧酶试验阴性。 

(4)16S rDNA序列分析 

16SrDNA基因序列，见核苷酸序列表所示。将所测16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明：YT3与Pseudomonas putida同处于一个最小分支上，其16S rDNA序列与Pseudomonasputida(D84020)的相似性达97.16％。结合菌落形态，生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp.，已于2011年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.5319。 

实施例2盆栽试验 

将保存的樱桃根际促生枯草芽孢杆菌YT3在LB斜面上活化，挑取一环接入牛肉膏蛋白胨培养基中，于37℃，180rpm条件下振荡培养2天，调菌液含量为2.5×10⁸cfu/ml(悬液A)，备用。将樱桃苗在悬液A中沾根后定植。将制备好的悬液A调菌液浓度至1.0×10⁸cfu/ml(悬液B)，取50ml悬液B均匀浇灌于樱桃苗根部周围。樱桃苗在无菌水中沾根后，浇灌等量的无菌水为对照。正常管理，于当年樱桃苗停止后测定樱桃根系的鲜重、毛细根重、苗高和地径。结果如表1和图1所示。 

从表中可以看出，YT3处理樱桃的总根重、细根重(＜2mm)、苗高和地径均分别比对照提高了18.33％、66.51％、15.28％和18.84％。差异均达显著水平。以上表明：菌株YT3对樱 桃生长，尤其对毛细根的生长具有明显的促进作用。 

表1 

实施例3田间试验 

大樱桃根际促生假单胞菌YT3在往返式振荡器中，于37℃，180rpm条件下振荡培养2天，调菌液含量为5.0×10⁸cfu/ml，接种到腐熟鸡粪中，制成樱桃生物有机肥(0.5×10⁸cfu/g)。每棵树施用樱桃生物有机肥8.5kg，以等量的腐熟鸡粪为对照。施肥方式采用四侧沟施，沟长、宽和高分别为60、30和20cm，将樱桃生物有机肥与挖出的土壤充分混匀后再回填。每处理12棵树，设置保护行。 

施用两年后测定土壤的速效磷、速效钾和根系活力，结果见表2，可以看出，施用大樱桃根际促生假单胞菌YT3制成的生物肥能促进土壤中的速效磷和速效钾含量，提高根系活力。与对照(CK)相比，根际促生假单胞菌生物肥处理的速效磷和速效钾的提高率分别达到了22.13％和13.28％，活化作用明显。 

表2