使用生物正交结合对交联生物假体组织的方法

摘要

描述了用于处理生物假体组织的方法。该方法包括使生物组织与固定化合物接触，该固定化合物包括第一和第二官能团。第一官能团可与同生物组织相关的组织官能团反应，并且与其偶合。第二官能团是生物正交结合对中的一个。偶合至固定化合物的生物组织随后被暴露至连接化合物。连接化合物包括至少两个官能团，每一个包括生物正交结合对中的另一个。在优选的实施方式中，生物正交结合对是叠氮化物和炔烃。该方法可在催化剂存在下执行，优选铜催化剂。可选地，该方法可在不存在催化剂下执行，其中炔烃被并入环张紧的环状化合物，诸如环辛炔。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年11月13日提交的美国临时专利申请序列号 61/725,937在35U.S.C.§119(e)下的优先权权益，其全部内容通过引用 并入如同全部在本文中陈述。

发明领域

本发明涉及处理用于植入患者中的生物假体组织的方法，并且， 更具体地涉及使用生物正交结合对(bio-orthogonal binding pairs)交联 生物假体组织的方法。

背景技术

在生物假体植入物中使用非自体组织提出重大的挑战。挑战之中 的主要部分是生物假体植入物的免疫性排斥和/或钙化，这些导致组织 不期望的退化和硬化。对于生物假体心脏瓣膜，免疫性排斥和钙化是 特别存在问题的，因为在植入之后这些小叶的钙化将不利地影响小叶 保持血液所需单向流动即避免血液不期望的泄漏或回流的能力。

戊二醛长期以来是选择用于交联生物组织，并且更具体地，用于 交联心脏瓣膜的心包组织的试剂。戊二醛化学地改变和交联胶原以致 使生物组织在人类宿主中免疫地可接受并且使组织稳定。虽然戊二醛 依然是优选的交联试剂，但戊二醛不无其缺点。的确，戊二醛已经被 报道加速钙化过程，其为戊二醛-固定的心包瓣膜中长期故障的主要原 因。此外，因为戊二醛是细胞毒性的并且阻碍宿主细胞附着、迁移和 增殖，其阻碍了处理的组织在体内再生的能力。戊二醛还具有聚合并 且产生不期望的副反应的倾向。戊二醛涉及的反应的类型通常难以控 制。

因此需要可用于代替戊二醛固定或与戊二醛固定联合的、减少戊 二醛-处理的生物假体组织的一些缺点的策略。

发明内容

本文描述的优选的实施方式涉及用于处理用于与可植入的生物假 体有关的生物组织的方法。

在一个优选的实施方式中，描述了用于交联生物组织的方法。该 方法包括使生物组织与固定化合物接触，该固定化合物包括第一和第 二官能团。第一官能团偶合与生物组织相关的组织官能团，并且第二 官能团是生物正交结合对中的一个。生物组织随后被暴露至包括至少 两个官能团的连接化合物。该两个官能团各自包括生物正交结合对的 另一个。

根据第一方面，生物正交结合对包括叠氮化物和炔烃。

根据第二方面，暴露在催化剂存在下执行。催化剂可以是铜、钌、 银，铜、钌或银的盐，或铜、钌或银的衍生物。在优选的实施方式中， 催化剂是铜、铜盐或铜的衍生物。

根据第三方面，方法进一步包括在使用连接化合物暴露生物组织 后冲洗生物组织。冲洗可使用水性、非水性或无水溶液执行。水性溶 液包括盐水溶液，优选缓冲盐水溶液，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液。水 性、非水性或无水溶液包括丙三醇溶液、聚乙二醇(PEG)溶液和酮溶液， 诸如丙酮。

术语“非水性”，当其指的是溶液时，被理解为意思是其中溶液系 统的小于按重量计50％是水的溶液。因此，非水性溶液不排除水的存 在，或者作为杂质或者以小于按重量计50％的量。

根据第四方面，炔烃被并入具有环张力的环状化合物。在优选的 实施方式中，环状化合物环辛炔。环辛炔可包括一种或多种吸电子基 团，优选卤素，并且最优选氟。

根据第五方面，暴露在不存在催化剂下执行。

根据第六方面，组织官能团是选自下列的一种或多种：胺、羟基、 巯基、羰基和羧酸。组织官能团优选是胺，并且固定化合物的第一官 能团是醛。

根据第七方面，固定化合物的第一官能团选自：异硫氰酸酯、异 氰酸酯、磺酰氯、醛、碳二亚胺、酰叠氮、酸酐、氟苯、碳酸酯、N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)、NHS酯、亚氨酸酯、环氧化物、氟苯酯、胺、 羧酸和醇。

根据第八方面，固定化合物是咪唑-1-磺酰叠氮和三氟甲磺酰叠氮 中的一种或其组合。

根据第九方面，固定和连接化合物中的一个或二者包括间隔基。

根据第十方面，间隔基不包括与生物组织、与组织官能团或生物 正交结合对的任何一个反应的官能团。

根据第十一方面，连接化合物包括间隔基。间隔基可以是选自分 支的或直链的饱和的或不饱和的烃或聚合物中的一个或其组合。间隔 基可还或额外地包括生物活性的和可生物降解的基团中的一个或其组 合。可生物降解的基团可以是二硫化物。

在另一个实施方式中，提供了根据上述方法中的任何一种生产的 交联生物假体组织。

根据第一方面，交联生物假体组织不用戊二醛、甲醛或其他含醛 交联剂处理。

根据第二方面，将交联生物假体组织提供在不含与组织接触的液 体防腐剂溶液的密封包装中。

由以下具体实施方式，描述的优选实施方式的其他目的、特征和 优势对本领域技术人员将变得显而易见。然而，将理解的是，具体实 施方式和具体实施例虽然指示了本公开内容的优选实施方式，但是其 是以说明性并非限制性的方式给出。在不偏离本公开内容的精神下可 以做出在本公开内容的范围内的许多变化和改变，并且该公开内容包 括所有这种改变。

附图说明

参考附图在此描述了本公开内容的说明性实施方式，其中：

图1描述了铜-催化的叠氮化物-炔烃环加成反应方案。

图2描述了叠氮化物-环辛炔环加成反应方案。

图3描述了环张紧的连接化合物的实施方式。

图4描述了与生物组织相关的组织官能团反应并且因此与其偶合 的官能团的示例性实施方式。

图5A-5B描述了包括生物正交结合对的固定和连接化合物在组织 胶原纤维之间实行交联的示例性方法。

具体实施方式

现在将参考附图描述用于交联生物假体组织的方法的具体的非限 制性的实施方式。应当理解这种实施方式仅以实例的方式，并且仅仅 说明了本公开内容的范围内的仅小量的实施方式。对本公开内容涉及 领域的技术人员显而易见的各种变化和改变被认为在如所附权利要求 进一步限定的本公开内容的精神、范围和意图内。

本文描述的优选的实施方式涉及用于处理用于与可植入的生物假 体相关的生物组织的方法。因为用于可植入的生物假体的生物组织来 源于非自体源，在植入前必须处理生物组织以保持足够程度的机械强 度和尺寸稳定性。同时，也必须处理生物组织以减少其在患者中的抗 原性以及减少实际和潜在的钙的结合位点。

戊二醛长期以来是选择用于交联和消毒用于假体心脏瓣膜中的生 物组织的试剂。然而，戊二醛的使用具有许多重大缺点。由于其在溶 液中聚合的倾向，戊二醛固定经常导致产生与固定的组织相关的醛基。 此外，戊二醛与组织中的游离胺反应以产生不稳定的席夫碱。醛和席 夫碱二者均代表可能引起钙化的潜在的钙结合位点。此外，戊二醛交 联提供有限的机会来调整固定后交联组织的性质，并且为交联网络的 合理设计提供很少或没有提供合成操作。而且，因为戊二醛是细胞毒 性的，其阻碍植入的和戊二醛-处理的生物假体组织的期望的细胞向内 生长和整合。

本公开内容描述了使用固定化合物和双官能连接化合物交联生物 组织的替代方法，所述固定和双官能连接化合物各自包括生物正交结 合对中的互补的一个。生物正交结合对之间的反应比起戊二醛基固定 具有一些优势。一个优势是生物正交结合对之间的反应是彼此高度特 异性的，从而减少或甚至消除生物正交结合对中的任何一个和存在于 生物组织或生物组织本身的组织官能团之间的不期望副反应的可能 性。

如本文所用，“生物正交结合对”指的是一对官能团，其彼此反应 并且彼此偶合。生物正交结合对中的互补的个体之间的反应和偶合是 相互排外的，使得生物正交结合对中的每一个不与任何组织官能团或 与生命系统内发现的任何官能团反应。

如本文所用，“组织官能团”指的是生物组织本身的，以及更具体 地诸如胶原组织中的官能团，例如，心脏瓣膜、血管、皮肤、硬脑脊 膜、心包、小肠粘膜下层(“SIS组织”)、韧带和腱中。示例性组织官 能团包括胺、羟基、巯基、醛和羧酸。

在优选的实施方式中，生物正交结合对包括叠氮化物和炔烃。应 当理解，生物正交结合对的叠氮化物和炔烃基团可以作为根据该方法 使用的固定化合物或连接化合物中的末端基团或内部基团存在。虽然 生物正交结合对自身的反应特异于彼此，但固定化合物和连接化合物 中的一个或二者可包括额外的官能团，诸如与组织官能团反应的那些， 该组织官能团是可与其他官能团，诸如组织官能团反应的。然而，应 当理解，第一或连接化合物的额外的官能团不与生物正交结合对中的 任何一个反应。

生物正交结合对之间的反应既可在催化剂存在下发生也可在催化 剂不存在下发生。图1描述了包括叠氮化物和炔烃官能团的示例性生 物正交结合对之间的铜-催化的反应。如图1中所示，叠氮化物与炔烃 的反应产生了环状1,4-二取代的[1,2,3]-三唑。包含铜催化剂允许该反应 在水性溶液中并且在室温下发生。在优选的实施方式中，铜是铜盐或 铜衍生物。

在交联生物组织的背景下，生物组织与包含生物正交结合对中的 一个的固定化合物接触。为了偶合固定化合物至生物组织上，固定化 合物优选包括第一官能团，其与同生物组织相关的组织官能团形成共 价键或以其他方式与其偶合。在一个实施方式中，生物正交结合对中 的一个和第一官能团可位于固定化合物的末端，其可以是直链的或分 支的。

在优选的实施方式中，生物组织不与戊二醛或任何其他含醛试剂 交联。在特别优选的实施方式中，仅使用本文公开的固定和双官能连 接化合物交联生物组织，其中固定包括生物正交结合对中的一个，并 且双官能连接化合物包括生物正交结合对中的另一个。根据该实施方 式，固定化合物的第一官能团不是醛基团。优选地，第一官能团也不 是羧酸基团。在进一步优选的实施方式中，固定和连接化合物均不包 括醛基团或羧酸基团。在一个实施方式中，固定化合物是咪唑-1-磺酰 叠氮和三氟甲磺酰叠氮中的一个或其组合。

第一官能团的实例包括异硫氰酸酯、异氰酸酯、磺酰氯、醛、碳 二亚胺、酰叠氮、酸酐、氟苯、碳酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、 NHS酯、亚氨酸酯、环氧化物、氟苯酯，并且在图4中描述。第一官 能团也可包括胺、羧酸和醇。在每一个这些结构中表示的R可包括生 物正交结合对中的一个，或间隔基与生物正交结合对中的一个的组合。

图5A和5B描述了利用包括生物正交结合对中的一个的固定化合 物和包括生物正交结合对中的另一个的连接化合物交联生物组织的机 理。虽然图5A和5B描述了使用包括叠氮化物的固定化合物和包括双 官能炔烃的连接化合物执行的交联，但应当理解，可使用包括炔烃的 固定化合物和包括双官能叠氮化物的连接化合物执行交联。连接化合 物优选是均双官能的(homodifunctional)以防止连接化合物聚合。

如图5A和5B中所示，叠氮化物通过第一官能团被偶合至组织胶 原纤维，该第一官能团与组织官能团偶合以将固定化合物偶合至生物 组织。被偶合至固定化合物的生物组织随后被暴露至包括至少两个官 能团的连接化合物，该两个官能团各自包括生物正交结合对中的另一 个。如图5A和5B中描绘，连接化合物是双官能炔烃，炔烃位于连接 化合物的末端。

固定和连接化合物中的任何一个或二者可进一步包括间隔基。在 图5B中，双官能炔烃被描绘为包括具有长度n的烷基间隔基。间隔基 的长度可基于所得的交联生物组织的期望的机械性质进行调整。例如， 可提供较长的间隔基以产生更柔韧的或柔性的交联组织，然而可提供 较短的间隔基以产生较硬的交联组织。在优选的实施方式中，间隔基 具有10≥n≥3的长度。间隔基可选自分支的或直链的饱和的或不饱和 的烃或聚合物的一种或组合，诸如聚乙二醇(PEG)。间隔基还可以是聚 合弹性体中的一种或组合，诸如聚氨酯、聚异丁烯和聚硅氧烷，聚合 碳水化合物，诸如多糖、透明质酸、硫酸葡聚糖和肝硫酯。

间隔基可进一步包括生物活性的或可生物降解的基团中的一种或 其组合。可生物降解的基团可以是下列中的一种或组合：二硫化物、 聚酯、原酸酯、聚羟基丁酸、聚(乙交酯)、聚(丙交酯)和聚(乙交酯)和 聚(丙交酯)的共聚物。一旦被植入，生物活性的基团可被并入以促进或 抑制生物组织内的或生物组织和宿主细胞之间的特定细胞相互作用。 可将可生物降解的基团诸如二硫化物提供在间隔基上以允许在植入宿 主后期望的时间部分或完全溶解或分解在生物组织内形成的交联的能 力。部分或完全溶解或分解交联的能力可能是期望的以允许细胞迁移 和向内生长，使得植入的生物组织变得与宿主在细胞水平上整合。间 隔基可进一步包括可用于偶合或系住特定药物或成像分子的额外的官 能团。

应当理解，然而，在间隔基上包含额外的官能团优选不包括将与 生物组织、组织官能团或生物正交结合对中的任何一个或二者反应的 任何官能团。

可使用催化剂促进生物正交结合对之间的反应。因此，将被偶合 至固定化合物的生物组织暴露至连接化合物可在催化剂存在下执行。 优选的催化剂包括铜基催化剂、钌基催化剂和银基催化剂中的一种或 组合。在另一个优选的实施方式中，催化剂包括铜盐、钌盐和银盐中 的一种或组合。在进一步优选的实施方式中，催化剂包括铜基衍生物、 钌基衍生物和银基衍生物中的一种或组合。

在优选的实施方式中，催化剂是Cu(I)催化剂。因为Cu(I)催化剂是 细胞毒性的，其具有用作交联生物组织的杀菌剂的优势。在使用细胞 毒性的催化剂的实施方式中，方法进一步包括在暴露步骤后冲洗生物 假体组织以消除或减少细胞毒性的催化剂的水平至或低于生理学可接 受的限度。

在一个优选的实施方式中，可使用水性、非水性或无水溶液执行 冲洗。水性溶液包括盐水溶液，优选缓冲盐水溶液，诸如磷酸盐缓冲 盐水溶液。水性、非水性或无水溶液包括丙三醇溶液、聚乙二醇(PEG) 溶液和酮溶液，诸如丙酮。用某些水性、非水性或无水溶液诸如包括 丙三醇的那些处理允许生物假体组织干燥地储存，即以组织不与液体 防腐剂溶液接触的方式。在可选的实施方式中，生物组织的交联可在 催化剂存在下执行。在该实施方式中，生物正交结合对可包括叠氮化 物和环炔烃。环炔烃以具有足够的环张力为特征，以在室温下并且不 需要催化剂来驱动向前反应的情况下驱动叠氮化物和环炔烃之间的环 加成反应。

在优选的实施方式中，环炔烃具有大于5kcal/mol的环张力，更优 选地大于10kcal/mol，并且最优选地大于15kcal/mol。

在另一个优选的实施方式中，环炔烃包括一种或多种吸电子取代 基。一种或多种吸电子取代基优选包括一种或多种卤素，最优选氟。 在特别优选的实施方式中，环炔烃是单或二氟环辛炔，其中吸电子氟 取代基位于丙炔的位置。

图2描绘了叠氮化物-二-氟环辛炔环加成反应方案，其中吸电子氟 取代基位于丙炔的位置。图6进一步描绘了连接化合物在具有长度n 的烷基或聚合物间隔基的末端包括两个二-氟环辛炔基团。

在用包括生物正交结合对的固定和连接化合物处理组织后，可进 一步处理组织以封端起组织钙化作用的官能团。这种官能团可包括本 体组织上的醛基和羧基或由用戊二醛、甲醛或其他含醛化合物处理或 暴露组织产生的醛基和羧基。

因此，在一个优选的实施方式中，特别是在也用戊二醛、甲醛和 其他含醛化合物处理组织的实施方式中，方法可进一步包括使用以上 描述的固定和双官能连接化合物交联组织后，用封端剂和还原剂处理。

只要组织可包括残余醛基，可通过使组织与封端剂诸如乙醇胺和 还原剂诸如硼氢化钠接触，使组织进行封端过程。示例性封端剂和还 原剂和过程在美国专利号7,972,376中描述，其全部内容通过引用并入， 如同全部在本文中陈述。

可选地，组织醛也可被氧化为羧酸，并且羧酸可与醇或胺反应。

在又进一步实施方式中，在适当催化剂存在下组织官能团可与各 种亲核体和/或亲电体反应，如在2013年11月7日提交的美国专利申 请序列号14/074,379中描述，其全部内容通过引用并入，如同全部在 本文中陈述。

生物假体组织可进一步经受用无水、非水性或水性丙三醇溶液处 理，以如果不完全，也基本上使生物假体组织脱水以干燥储存。

在优选的实施方式中，无水或非水性溶液包括丙三醇，并且更优 选75wt％丙三醇和25wt％乙醇的溶液，并且生物假体组织在丙三醇 溶液中被浸泡持续至少一小时。生物假体组织随后被移出并且被放置 在干净的通风橱中以允许移除过多的溶液。

在优选的实施方式中，无水或非水性溶液是丙三醇和C₁-C₃醇的溶 液。其中处理溶液包括按体积计60-95％的丙三醇。生物组织的适当的 处理在2011年8月30日授权给Edwards Lifesciences Corp.的美国专利 号8,007,992中描述，其全部内容通过引用并入，如同全部在本文中陈 述。

在另一个优选的实施方式中，水性丙三醇溶液可用于使组织部分 脱水，如在2003年3月18日授权给The Cleveland Clinic Foundation 的美国专利号6,534,004中描述，其全部内容通过引用并入，如同全部 在本文中陈述。

如本文所用，术语“干燥”或“脱水”被理解为在用无水、非水 性或水性丙三醇溶液处理后包括残余处理溶液或来自周围环境的水分 或湿气。

将脱水的生物假体组织提供在密封包装中，优选在由具有蒂维克 (Tyvek)盖子的硬托盘(PETG)组成的双重无菌防渗包装中。密封包装优 选不含与组织接触的液体防腐剂溶液。包装在无尘室中密封，并且在 100％环氧乙烷中消毒。

虽然本公开内容描述了生物正交结合对的具体实施方式，但是应 当理解，其不限于此，并且本公开内容包括进行相互排斥反应并且彼 此偶合的任何官能团对。因此，应当理解，虽然具体实施方式和具体 实施例指示了本发明优选的实施方式，但是其以说明性而非限制性的 方式给出。在不偏离本发明的精神的情况下可以在本发明范围内作出 其许多变化和改变，并且本公开内容包括所有这种改变。