评价细胞因子对细胞色素P450的代谢能力产生的影响的方法和药剂的筛选方法

摘要

提供评价细胞因子对细胞色素P450的代谢能力产生的影响的方法；和与细胞因子相互作用的药剂的筛选方法中利用株化肝细胞的方法。评价细胞因子对细胞色素P450的代谢能力产生的影响的方法如下：使用具有培养空间(11)的培养容器(10)，培养株化肝细胞，形成球状体(9)，使球状体形状的株化肝细胞与包含细胞因子的试验溶液在培养容器内接触1小时以上且小于96小时后，评价细胞色素P450的诱导或衰减的有无。

说明书

技术领域

本发明为评价细胞因子与细胞色素P450的相互作用的方法，例如涉及评 价由细胞因子引起的细胞色素P450的药物代谢功能的诱导和衰减的方法。另 外，本发明为与细胞因子相互作用的药剂的筛选方法。

背景技术

近年来，关于细胞因子已经进行了各种研究。

例如，炎症性的自身免疫疾病的患者的白介素的血药浓度高于健康人， 细胞色素P450的代谢功能低于健康人，炎症时由于分泌至血中的细胞因子类 而CYP3A4的代谢功能降低，因此药剂无法排泄，作为结果，显示出会引起 严重的副作用(非专利文献1)。对这样的患者给予经受了细胞色素P450的代 谢的药物(D1)时，估计该患者的代谢功能的降低程度来给予少于健康人的 量。对于这样的患者组合使用阻碍白介素的受体那样的、与细胞因子相互作 用的药剂(D2)(例如分子靶向药物)时，降低了的细胞色素P450的代谢功 能恢复，药物(D1)的代谢得到促进。其结果，临床研究中示出药物(D1) 的作用减弱化(非专利文献2)。出于这样的背景，分子靶向药物那样的药剂 与经受了细胞色素P450的代谢的药物的介由细胞因子的相互作用的研究备 受关注。

作为该方法之一，可以举出动物实验。然而，人与动物有种差，因此有 无法准确地预测生物体内的反应的问题(非专利文献3)。此外，动物实验那 样的体内(in vivo)的试验与体外(in vitro)系统相比，生产能力性能差。 因此，有不适于同时评价大量化合物的药物的筛选的问题。

出于这样的背景，要求能够准确地预测生物体内的反应的基于in vitro的 试验的评价法。另外，以白介素为代表的细胞因子类作为药物开发靶标也受 到关注，近年来要求用于评价药剂与细胞因子的相互作用的in vitro系统。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1:Kenneth W.Renton著、“Cytochrome P450 Regulation and  Drug Biotransformation During Inflammation and Infection”、Current Drug  Metabolism、2004年5月、pp.235-243

非专利文献2:Leslie J.Dickmann,Sonal K.Patel,Dan A.Rock,Larry C. Wienkers,and J.Greg Slatter著、“Effects of Interleukin-6(IL-6)and an Anti-IL-6  Monoclonal Antibody on Drug-Metabolizing Enzymes in Human Hepatocyte  Culture”、DRUG METABOLISM AND DISPOSITION 39、2011年、 pp.1415-1422

非专利文献3:C Schmitt,B Kuhn1,X Zhang,AJ Kivitz3and S Grange著、 “Disease-Drug-Drug Interaction Involving Tocilizumab and Simvastatin in  Patients With Rheumatoid Arthritis”、Clinical pharmacology&Therapeutics、 VOLUME 89 NUMBER 5、2011年5月、pp.735-740

发明内容

发明要解决的问题

作为in vitro的试验，非专利文献3中公开了使用人原代肝细胞的方法。 然而，人原代肝细胞对于由供体的基因多态性、环境因素导致的药物动态基 因的表达量及其诱导能力的批间差异大。此外，获得途径受到限制，因此成 本高、操作困难。因此，存在难以使用多种细胞因子，以同一批的细胞一次 性评价多个细胞色素P450、或者需要较大成本的问题。

另一方面，可以使株化肝细胞增殖。因此，评价细胞因子对细胞色素P450 的代谢能力产生的影响的方法中，如果能利用源自人的株化肝细胞，则可以 期待能够得到廉价且有重现性的结果。然而，已知的是，株化肝细胞的代谢 功能所具有的肝细胞的功能与原代肝细胞相比，非常低。例如，使用用来培 养细胞的底部表面平坦的培养容器培养株化肝细胞时，有时细胞色素P450 的代谢能力变为测定极限值以下，无法进行分析。这样的情况下，即使在不 添加细胞因子的对照组中也可以检测到代谢功能，测定添加细胞因子时的代 谢功能的衰减量也是极为困难的。为了克服该问题，已经研究了各种三维培 养，但存在操作烦杂、需要使用特殊的装置、或为高成本之类的问题。出于 这样的背景，使用株化肝细胞评价细胞因子对细胞色素P450的代谢能力产生 的影响的方法尚未开发。

发明人等发现了评价细胞因子对细胞色素P450的代谢能力产生的影响 的方法以及与细胞因子相互作用的药剂的筛选方法中利用株化肝细胞的方 法。

用于解决问题的方案

发明人等利用使球状体形状的株化肝细胞与包含细胞因子的试验溶液 接触1小时以上且小于96小时后测定细胞色素P450的代谢能力的方法解决了 上述问题。

本发明的评价细胞因子对细胞色素P450的代谢能力产生的影响的方法 的一个方案为，使球状体形状的株化肝细胞与包含细胞因子的试验溶液在培 养容器内接触1小时以上且小于96小时后，评价细胞色素P450的代谢功能的 诱导或衰减的有无。发现：通过形成球状体形状的株化肝细胞，使所形成的 球状体形状的株化肝细胞与试验溶液接触适合的时间，从而能够测定代谢功 能。根据该方法，测定并评价细胞因子对细胞色素P450的代谢能力产生的影 响成为可能。

另外，本发明的评价细胞因子对细胞色素P450的代谢能力产生的影响的 方法的一个方案中，优选的是，由前述株化肝细胞形成的球状体的直径的平 均值为50μm以上且小于200μm，且具有半值宽度范围内的直径的球状体为全 部球状体的70％以上。通过球状体的直径的大小为规定的范围内、且球状体 的直径的大小的偏差变小，从而可以提高代谢功能的判定的精度。

进而，本发明的评价细胞因子对细胞色素P450的代谢能力产生的影响的 方法的一个方案中，优选的是，前述试验溶液为无血清培养基。

此外，优选的是，以健康人的细胞因子的血药浓度的平均值的0.1倍至50 倍的范围中的一个浓度为基准，使用前述试验溶液的细胞因子浓度为前述基 准的1倍、10倍、100倍至少这3种浓度的包含前述细胞因子的各试验溶液。 另外，优选的是，以前述细胞因子在被分泌的疾病患者的血药浓度的平均值 的0.1倍至50倍的范围中的一个浓度为基准，使用前述试验溶液的细胞因子的 浓度为前述基准的1倍、10倍、100倍至少这3种浓度的包含细胞因子的各试 验溶液。

本发明的方法的一个方案中，优选的是，在同一孔内进行将前述株化肝 细胞培养为球状体形状的工序、和使球状体形状的前述株化肝细胞和包含前 述细胞因子的前述试验溶液接触1小时以上且小于96小时的工序。

例如，优选的是，使用具有多个孔的培养板的一个孔作为前述培养容器 来进行以下的各工序。

(1)在前述一个孔内，在包含10％血清的培养基中形成前述株化肝细 胞的球状体的工序；

(2)从前述一个孔吸取前述培养基的工序；

(3)向前述一个孔中添加包含前述细胞因子的前述试验溶液的工序；

(4)在前述一个孔内，使包含前述细胞因子的前述试验溶液与前述球 状体接触1小时以上且小于96小时的工序。

此外，发明人等利用使球状体形状的株化肝细胞、与包含细胞因子和药 剂中的任一者的试验溶液接触后测定细胞色素P450的代谢能力的方法从而 解决了上述问题。

本发明的与细胞因子相互作用的药剂的筛选方法的一个方案为，准备不 含前述细胞因子和前述药剂的第一试验溶液、包含前述细胞因子且不含前述 药剂的第二试验溶液、以及包含前述细胞因子和前述药剂的第三试验溶液，

使前述第一试验溶液至第三试验溶液与球状体形状的株化肝细胞接触，

测定与前述第一试验溶液接触的前述株化肝细胞的细胞色素P450的药 物代谢酶的功能，取得第一测定值，同样地测定与前述第二试验溶液和第三 试验溶液接触的前述株化肝细胞的细胞色素P450的药物代谢酶的功能，取得 第二测定值和第三测定值，

前述第一测定值大于前述第二测定值且前述第二测定值小于前述第三 测定值时，判定前述药剂使细胞色素P450的药物代谢功能恢复。

发现：通过该方法，与细胞因子相互作用的药剂的筛选方法中能够利用 株化肝细胞。

另外，本发明的筛选方法中，优选的是，由前述株化肝细胞形成的球状 体的直径的平均值为50μm以上且小于200μm，并且具有半值宽度范围内的直 径的球状体为全部球状体的70％以上。通过球状体的直径的大小为规定的范 围内，且球状体的直径的大小的偏差变小，从而可以提高代谢功能的判定的 精度。

进而，本发明的筛选方法中，优选的是，前述试验溶液的溶剂为无血清 培养基。

此外，优选的是，前述第三测定值为前述第二测定值的3倍时，判定使 细胞色素P450的药物代谢功能恢复。

进而，优选的是，前述第二试验溶液和第三试验溶液的细胞因子的浓度 如下选择：使包含至少3种浓度的细胞因子且不含前述药剂的溶液与前述株 化肝细胞接触，对细胞色素P450的药物代谢酶的功能进行测定，选择所测得 的测定值小于前述第一测定值的浓度，其中所述包含至少3种浓度的细胞因 子且不含前述药剂的溶液为，以健康人的细胞因子的血药浓度的平均值的0.1 倍至50倍的范围中的一个浓度为基准，前述第二试验溶液和第三试验溶液的 细胞因子的浓度为前述基准的1倍、10倍、100倍至少这3种浓度的包含前述 细胞因子且不含前述药剂的溶液。另外，优选的是，前述第二试验溶液和第 三试验溶液的细胞因子的浓度如下选择：使包含至少3种浓度的细胞因子且 不含前述药剂的溶液与前述株化肝细胞接触，对细胞色素P450的药物代谢酶 的功能进行测定，选择所测得的测定值小于前述第一测定值的浓度，其中所 述包含至少3种浓度的细胞因子且不含前述药剂的溶液为，以前述细胞因子 在被分泌的疾病患者的血药浓度的0.1倍至50倍的范围中的一个浓度为基准， 前述第二试验溶液和第三试验溶液的细胞因子的浓度为前述基准的1倍、10 倍、100倍至少这3种浓度的包含前述细胞因子且不含前述药剂的溶液。

本发明的筛选方法中，优选的是，在培养板的同一孔内进行将前述株化 肝细胞培养为球状体形状的工序、和使球状体形状的前述株化肝细胞与前述 第一试验溶液至第三试验溶液接触的工序。

发明的效果

根据本发明，评价细胞因子对细胞色素P450的代谢能力产生的影响的方 法以及与细胞因子相互作用的药剂的筛选方法中能够利用株化肝细胞。

附图说明

图1为示出本发明的一个实施方式中使用的培养板的整体的图。

图2A为图1所示的培养板的II-II线截面图。

图2B为图1所示的培养板的其他II-II线截面图。

图3为示出本发明的一个实施方式中使用的培养容器的整体的图。

图4为图3所示的培养容器的IV-IV线截面图。

图5A为示出在培养空间中培养球状体的状态的概要图。

图5B为示出说明在培养空间中培养的球状体的优选尺寸的一例的模式 图的图。

图6A为示出培养空间的其他形状例的图。

图6B为示出培养空间的进一步其他形状例的图。

图7A为示出培养空间的其他侧面的形状例的截面图。

图7B为示出培养空间的进一步其他侧面的形状例的截面图。

图7C为示出培养空间的进一步其他侧面的形状例的截面图。

图8为示出实施例中使用的培养板的一例的照片。

图9为示出表示使球状体形状的株化肝细胞、与包含细胞因子的试验溶 液接触的时间的长短和细胞色素P450的代谢功能的反应性的关系的试验结 果的图。

图10为示出测定添加上皮生长因子时的CYP3A4的基因表达量的结果的 图。

图11为示出测定添加肝素结合性上皮增殖因子样增殖因子时的CYP3A4 的基因表达量的结果的图。

图12为示出测定添加白介素-1β时的CYP3A4的基因表达量的结果的图。

图13为示出测定添加肿瘤坏死因子时的CYP3A4的基因表达量的结果的 图。

图14为示出测定添加肿瘤坏死因子时的CYP2C9的基因表达量的结果的 图。

图15为示出测定添加白介素-6时的CYP2C9的基因表达量的结果的图。

图16为示出白介素-6的试验中CYP3A4的蛋白量和代谢活性的试验结果 的图。

图17为示出判定细胞因子的浓度依赖性的试验结果的结果的表格。

图18为示出基于评价处理中说明的方法判定试验结果的结果的表格。

图19为示出研究试验溶液的细胞因子的浓度与CYP3A4蛋白量的关系的 试验结果的图。

图20为示出使第一试验溶液至第三试验溶液与球状体接触时的CYP3A4 的mRNA的表达量的图。

具体实施方式

以下，边参照附图边对实施方式进行说明。为了说明的明确化，以下的 记载和附图被适当地省略和简略化。各附图中，对具有同一构成或功能的构 成要素和相当部分标注同一附图标记，省略其说明。

发明人等在评价细胞因子对细胞色素P450的代谢能力产生的影响的方 法(以下适当称为“评价方法”)中利用使球状体形状的株化肝细胞与包含 细胞因子的试验溶液接触1小时以上且小于96小时后测定细胞色素P450的代 谢能力，评价基于细胞因子的细胞色素P450的代谢能力的方法，从而解决了 上述问题。更详细而言，评价方法如下：培养源自人的株化肝细胞而形成球 状体，使球状体形状的株化肝细胞与包含细胞因子的试验溶液在培养容器内 接触1小时以上且小于96小时，测定株化肝细胞的细胞色素P450的值。基于 测定结果，对于细胞色素P450的代谢能力的评价、换言之、基于细胞因子的 细胞色素P450的代谢能力的诱导或衰减的有无，细胞色素P450的值上升时， 判定为“由于细胞因子而细胞色素P450的代谢功能被诱导”，细胞色素P450 的值减少时，判定为“由于细胞因子而细胞色素P450的代谢功能衰减”。

另外，发明人等发现：通过以下步骤可以实现与细胞因子相互作用的药 剂的筛选方法(以下适当地称为“筛选方法”)。准备(A)不含细胞因子和 药剂的第一试验溶液、(B)包含细胞因子且不含药剂的第二试验溶液、以及 (C)包含细胞因子和药剂的第三试验溶液。另外，使用具有培养空间的培 养容器来培养株化肝细胞而形成球状体。然后，使第一试验溶液至第三试验 溶液与球状体形状的株化肝细胞接触，测定与第一试验溶液接触的株化肝细 胞的细胞色素P450的药物代谢酶的功能，取得第一测定值，同样地测定与第 二试验溶液和第三试验溶液接触的株化肝细胞的细胞色素P450的药物代谢 酶的功能，取得第二测定值和第三测定值。对于测定的结果，第一测定值大 于第二测定值、且第二测定值小于第三测定值时，判定药剂使细胞色素P450 的药物代谢功能恢复。

术语“细胞因子”是指，由细胞释放的、传递各种细胞间相互作用的蛋 白质性因子的总称，例如为调节免疫系统、引起炎症反应、抗肿瘤作用、细 胞增殖、分化、抑制之类生物体的恒常性维持中发挥作用的物质。一个实施 方式中，细胞因子以由于其存在而导致肝脏的功能的变动(诱导、衰减)的 情况为特别对象，例如包含增殖因子、干扰素、肿瘤坏死因子等。

术语“球状体”是指，细胞大量聚集形成细胞块，变为三维状态。

术语“细胞色素P450(CYP)”是指，从细菌至植物、哺乳动物的几乎 全部的生物中存在的、发挥外源物(药物)代谢的作用的酶。动物中，主要 存在于肝脏。

术语“与细胞因子相互作用的药剂”(以下也适当地称为“药剂”)为细 胞因子存在时相互作用的药剂，特别是为通过与细胞因子的相互作用，使细 胞色素P450的代谢功能变动的药剂。例如，包含利用了体内的蛋白质、基因 等的生物药物、低分子药物等。

以下的说明中，所谓“值A～值B的范围”的情况下，只要没有特别说明， 是指“值A以上且值B以下”。

术语“细胞色素P450的值”不是总细胞色素P450量的值而是表示细胞色 素P450所具有的代谢功能的值，例如是指代谢活性值、基因表达量、蛋白量。

以下，对于一个实施方式的评价方法和筛选方法、对于最初培养株化肝 细胞的培养容器进行说明，接着，对培养株化肝细胞进行评价为止的培养· 评价方法进行说明。

1.培养容器

＊培养容器的概要

图1为示出本发明的一个实施方式中使用的培养板的整体的图。图2A为 图1所示的培养板的II-II线截面图，图2B示出其他方式的截面图。培养板1具 有多个孔21。多个孔21由分隔部22与相邻的孔21隔开。多个孔21中分别形成 有培养容器10。

图3示出本发明的实施方式中使用的培养容器的构成例。图4为图3所示 的培养容器的IV-IV线截面图。

培养容器10具有培养空间11、壁12和底部13。

培养空间11为由壁12和底部13分隔的区域，变为培养细胞的三维的空间 区域(培养区域)。培养空间11也简单称为“空间”或“微空间”。

壁12为分隔培养空间11的分隔壁，也可以称为培养容器10中形成有凹凸 图案的凸部。培养空间11与分隔部22相邻时，如图2A所示那样，壁12可以变 为与分隔部22的壁面的一部分相同，如图2B所示那样，也可以与分隔部22 的壁面相邻而配置壁12。

底部13作为培养容器10的基板发挥功能，并且配置有培养空间11的一侧 的表面变为培养区域(培养表面)的一部分。底部13为与形成于培养板1的 各孔21的底部相同的区域，可以使用各孔21的底部。底部13形成培养空间11 的底。底部13中，将为形成培养空间11的面的一部分、且作为培养区域的底 部的表面也称为“底部培养面14”。

图3、图4中，关于形成于培养容器10的培养空间11，示出当量直径D、 高度(深度)H、壁12的宽度(厚度)W、和底部13的厚度T。图3、图4中示 出底部13与壁12一体而制作的情况。

当量直径D是指，与培养空间11内切的内切圆的直径。更详细而言，当 量直径D是指，与培养空间11的底部13平行的面的形状(正面的形状)、换言 之、与培养空间11的高度H的方向呈垂直的面的形状的内切圆的直径。培养 空间11的正面的形状根据高度H而不同时，将培养株化肝细胞的空间区域的 最大值设为当量直径的当量直径。

高度H是指，从培养空间11的底(底部培养面14)至壁12的上表面为止 的长度，也称为培养空间11的深度。另外，底部培养面14为平面的情况下， 高度H与壁12的高度相同。

壁12的宽度W为壁12的厚度，且也称为隔开相邻的培养空间11之间的距 离。

培养容器10内(换言之，各孔21内)，多个培养空间11如图3所示那样， 配置为阵列状。培养容器10中所含的培养空间11的数量或大小依赖于在培养 板1制作的孔21的数量(孔21的大小)和培养空间11及壁12的大小。具体而 言，存在随着孔21的数量变多，培养空间11的数量变小的关系。相同大小的 孔21时，存在孔21中的培养空间11的数量在当量直径D大的情况、宽度W大 的情况下变小的关系。图1至4中，为了便于说明构成，为减少培养空间11的 数量来表示的概要图，培养容器10中所含的培养空间11的数量与实际不同。 此外，图3、4中，示出9个培养空间11。其是为了说明而示出的，与实际的 培养容器10(各孔21)中所含的培养空间11的数量不对应。

发明人等发现：使用具有多个当量直径D为期望的球状体的直径的1～5 倍、高度H为当量直径D的0.3倍～5倍的培养空间11，且该培养空间表面的水 接触角为45度以下的培养容器10，在各培养空间11中培养株化肝细胞，从而 可以培养均匀直径的株化肝细胞的球状体。因此，根据期望的球状体的大小 来选择配置于培养容器10的培养空间11的大小，从而可以控制所培养的球状 体的大小。一个实施方式中，作为株化肝细胞，培养源自人的株化肝细胞使 其形成球状体。以下说明详细情况。

参照图1至4，说明用于形成期望的球状体的微米级的培养空间11的大 小、形状等、和培养表面的特性。

＊培养空间的大小、形状等

对于培养空间11的当量直径D，需要考虑球状体的大小随着细胞增殖而 其直径变大。因此，重要的是，确保球状体不与相邻的培养空间11的细胞接 触这样的培养空间11。因此，培养空间11的当量直径D优选为期望的球状体 的直径的1～5倍的范围、更优选为1.2～4倍的范围。

例如，为了形成直径100μm的株化肝细胞的球状体，使用具有规则地配 置有期望的球状体的直径的1～5倍的范围、即当量直径D为100～500μm的范 围、且高度H除以当量直径D的值为0.3～2的范围的培养空间11的底部13的培 养容器10。

作为一例，对培养株化肝细胞即癌细胞的情况进行研究。

通过增强与株化肝细胞培养空间11的表面的细胞粘附性，增殖·维持这 样的情况下，由于细胞与底面充分的粘附性，所以培养基交换时细胞不发生 剥离。因此，无需本实施方式这样的、培养空间11的当量直径D为期望的球 状体的直径的1～5倍的范围、高度H为当量直径D的0.3～2倍的范围这样深的空 间，因此在这样的空间内未进行培养。

另一方面，一个实施方式中，后述那样，为了抑制细胞粘附性，必须设 计可以供给氨基酸、氧等、且球状体不脱离的最佳的高度H。对于为了形成 0018段所述的优选范围的球状体而优选的高度H、当量直径D进行了研究， 结果，为了防止由于细胞增殖而导致球状体过度变大，优选当量直径D为 100μm～200μm的范围、高度H为50μm～100μm的范围。为了将氨基酸等营养 成分充分地供给至培养空间11的底部、且为了防止废物的蓄积，培养空间11 的高度H只要在培养基更换、试验溶液更换时球状体不发生剥离则高度H低 为优选。具体而言，发现培养空间11的高度H除以当量直径D的值优选为0.3～2 的范围、更优选为0.5～1的范围。

一个实施方式中，为了将试验溶液扩散或输送至球状体中心部，优选的 是，球状体的直径最大小于200μm、优选150μm以下。进而，为了最大限度 地发挥细胞间的相互作用，球状体的直径优选最小50μm、更优选 60μm～150μm的范围。此处，细胞间的相互作用为受试物质(例如细胞因子) 与细胞色素P450的相互作用。

壁12的宽度W为隔开培养空间11与相邻的培养空间11的壁12的厚度。因 此，对于壁12的宽度W，为了防止壁12的上表面的细胞增殖、且为了使细胞 易于进入至培养空间11内，可以为2～50μm的范围，优选为细胞体1个以下的 大小，即优选为5～30μm的范围，更优选为5～10μm的范围。进而，从同样的 观点出发，壁12的上表面与培养空间11的侧面所成的角θ优选为90～135度的 范围、更优选为90度～120度的范围。

图5A示出表示在培养空间11中培养球状体的状态的概要图。图5A中， 使用图4所示的截面图，球状体9用符号○表示。球状体9在多个培养空间11 中分别被培养。

在图1所示的培养板1中进行培养时，对每个孔21实施培养条件的设定、 培养基的更换等。因此，由于在各孔21中形成多个培养空间11，所以在各孔 21中，在相同条件下培养多个球状体成为可能。此外，可以使用孔板培养球 状体，因此可以利用现有细胞培养中使用的装置等。

将球状体9的直径DSP设为值dsp(dsp为正的数值)时，对于培养空间11 的当量直径D，值dsp至值dsp的5倍的范围(dsp≤D≤5dsp)变为优选的范围。 另外，对于培养空间11的高度H，值dsp的0.3倍至值dsp的25倍(5×5)的范围 (0.3dsp≤H≤25dsp)变为优选的范围。

图5B示出说明在培养空间中培养的球状体的优选的尺寸的一例的模式 图。图5B为示意性示出沿着球状体9的当量直径D切断的切断部端面的图。 如上述那样，球状体的直径的平均优选为50μm以上且小于200μm，特别优选 为60μm～150μm的范围。图5B中，示出球状体9的切断部端面由5个细胞8形 成的样子。例如，形成细胞8的直径DCL为20μm、球状体9的直径DSP为60μm 的球状体9时，例如通过细胞8在直线上排列3个而形成。同样地，形成球状 体9的直径DSP为150μm的球状体9时，例如通过细胞8在直线上排列5个而形 成。图5B中，为了便于说明，示意性示出在直线上排列细胞8，细胞8未必在 直线上排列。

此外，位于1个试验区域(1个孔、1个培养皿)的球状体优选其直径处 于半值宽度范围内的球状体包含全部的70％以上。换言之，优选球状体的直 径的大小一致。其理由如以下所述。首先，已知的是根据球状体的大小而代 谢活性值不同，因此各种直径的球状体混合存在时，无法得到精度高的结果。 另外，已知的是，小(50μm以下)的球状体的代谢功能极其低。因此，包 含大量的这样的球状体的情况下，评价使代谢功能衰减的细胞因子时变为测 定极限值以下，有无法判定代谢功能的衰减的有无的可能性。

“半值宽度的范围”是指，位于1个试验区域的球状体的总个数NT中， 直径的大小和存在的个数取得对应时，对于存在的个数变为最大的直径D1 的个数N1，变为个数N1的一半的个数(N1/2)的多个直径中，从最小的直 径D2至最大的直径D3为止的范围内存在的球状体的个数N2。

为了使球状体的大小一样，优选上述个数N2相对于总个数NT为70％以 上，更优选个数N2相对于总个数NT的比例变高。

培养空间11的形状(正面的形状)、或者与底部13平行的面的形状不限 定于图3所示的形状，例如可以为图6A～6B所示那样的形状，也可以为其他 形状(楕圆、菱形等)。为了形成具有更高密度、且均匀的直径的球状体， 优选为左右对称结构。

培养空间11的侧面的形状不限定于图4所示的形状，例如可以为图 7A～7C所示那样的形状。

作为构成培养容器10的材料，可以选自丙烯酸类树脂、聚乳酸、聚乙醇 酸、苯乙烯系树脂、丙烯酸-苯乙烯系共聚树脂、聚碳酸酯系树脂、聚酯系 树脂、聚乙烯醇系树脂、乙烯-乙烯醇系共聚树脂、热塑性弹性体、氯乙烯 系树脂和有机硅树脂中的1者或它们的组合。

从观察性的观点出发，培养容器10的底部13的厚度T优选为1mm以下。 但是，只要不妨碍用显微镜的观察，也可以为1mm以上，不限定底部13的厚 度T。由于确保培养容器的底部13的观察性，所以可以直接使用培养板，观 察所培养的球状体。由于确保培养容器的观察性，所以可以直接使用培养容 器，可以进行基于免疫组织学法的荧光染色观察、使用了绿色荧光蛋白 (Green Fluorescent Protein(GFP))等报告基因的原位(in situ)法。

＊培养表面的特性

接着，对于培养细胞的培养表面、即、包围培养空间11的壁12和底部培 养面14的特性、特别是亲水化处理进行说明。对于培养表面，由于在各培养 空间11内加入了培养基，而且使用涂覆溶液的情况下，如果该溶液不进入培 养空间11内则无法覆盖表面。因此，优选将水接触角设为45度以下。更优选 为0度～20度的范围。另外，对于水接触角的值，以在与培养容器10相同的条 件下制作未形成培养空间11和壁12的凹凸图案的平板来测定的值为前提。

关于将培养空间11配置为阵列状的表面，该表面的疏水性高、水接触角 超过45度时，即湿润性低的情况下，添加培养基、涂覆溶液时，有时空间内 易于进入气泡，产生无法培养细胞的空间。因此，必须以水接触角变为45度 以下的方式进行亲水化。作为进行亲水化的方法，可以举出：蒸镀SiO₂的方 法、进行等离子体处理的方法。

此外，为了在培养容器10中效率良好地形成球状体，优选抑制细胞粘附 性。为了抑制细胞粘附性，可以使用水接触角为45度以下、优选40度以下、 更优选20度以下那样的表面。对于抑制细胞粘附性与水接触角的关系，例如 如Y Ikada著、“Surface modification of polymers for medical applications”、 Biomaterials 1994,vol.15 No.10,pp725-736所记载。作为使水接触角为45度以 下的方法，可以举出：将玻璃蒸镀于底部培养面14的方法、使用等离子体处 理法在表面形成官能团的方法。利用等离子体处理等，在表面形成官能团。

另外，通过使水接触角为45度以下，涂覆抑制细胞粘附性的物质，进一 步抑制粘附性，从而可以效率良好地形成球状体。例如可以实施等离子体处 理使水接触角为45度以下，然后涂覆磷脂-高分子复合体、聚(甲基丙烯酸 2-羟乙酯)。

2.株化肝细胞的培养·评价方法和药剂的筛选方法

接着，对培养株化肝细胞，评价细胞因子对细胞色素P450的代谢能力产 生的影响为止的方法进行说明。

＊培养·评价方法和药剂的筛选方法的概要

一个实施方式的从培养至评价中例如实施以下(A)至(F)的工序。

(A)工序，培养源自人的株化肝细胞，形成球状体(球状体形成处理)。

(B)工序，从同一个孔21中吸取培养基(培养基抽吸处理)。

(C)工序，向同一个孔21中添加包含细胞因子的试验溶液或对照溶液 (试验溶液添加处理)。

(D)工序，在同一个孔21内使包含细胞因子的试验溶液与球状体形状 的株化肝细胞接触1小时以上且小于96小时(接触处理)。

(E)工序，对细胞色素P450的代谢功能进行分析(分析处理)。

(F)工序，对所分析的结果进行评价(评价处理)。

＊筛选方法的概要

一个实施方式的从培养至判定中例如实施以下(A’)至(F’)的工序。

(A’)工序，培养源自人的株化肝细胞，形成球状体(球状体形成处理)。

(B’)工序，从同一个孔21中吸取培养基(培养基抽吸处理)。

(C’)工序，向同一个孔21中添加第一试验溶液至第三试验溶液(试验 溶液添加处理)。

(D’)工序，在同一个孔21内使包含细胞因子的试验溶液与球状体形状 的株化肝细胞接触1小时以上且小于96小时(接触处理)。

(E’)工序，对细胞色素P450的代谢功能进行分析(测定)(分析处理)。

(F’)工序，对所分析的结果进行判定(判定处理)。

此处，第一试验溶液为不含细胞因子和药剂的溶液(无细胞因子和药 剂)。第二试验溶液为包含细胞因子且不含药剂的溶液(有细胞因子、无药 剂)。第三试验溶液为包含细胞因子和药剂的溶液(有细胞因子和药剂)。另 外，使第一试验溶液至第三试验溶液与球状体形状的株化肝细胞接触，测定 细胞色素P450的代谢功能，将所得结果作为第一测定值至第三测定值。

从操作性的观点出发，一个实施方式的评价方法优选使用具备多个孔的 培养板。特别是，更优选的是，在同一孔内进行将株化肝细胞培养为球状体 形状的球状体形成处理(工序A、A’)、和使包含细胞因子的试验溶液与所培 养的细胞接触规定时间的接触处理(工序D、D’)。因此，一个实施方式中， 使用图1所示的培养板1的多个孔21，在多个孔21中，在一个孔21内实施从球 状体形成处理至接触处理为止的各工序。换言之，在一个孔内从培养至评价 为止的处理中，在各工序的中途不使细胞移动至其他孔21。

以下，只要不特别区分，将工序A’至D’以工序A至D的形式表现。

＊工序A球状体形成处理

工序A的球状体形成处理中，使用上述培养容器10，在包含10％血清的 培养基中培养源自人的株化肝细胞，形成期望尺寸的球状体。

所形成的球状体的至少其一部分可以粘附于壁12或底部培养面14。

作为得到球状体形状的株化肝细胞的方法，不特别限定于转瓶培养、旋 转烧瓶培养、悬滴培养等。然而，这些方法中，由于使用与培养方法相适应 的装置，必须在不同的容器中进行球状体形成处理和接触处理。发明人等发 现：通过使用形成有上述培养容器10的孔21，从而可以在同一容器中实施球 状体形成处理和接触处理。由此，操作变得简便，可以使细胞与细胞因子接 触而不移动所形成的球状体。特别是，在一次性评价大量化合物这样的药物 的筛选中，可以用于自动培养装置。此外，可以防止细胞的损伤、污染。

对于用于形成球状体的培养容器10的优选尺寸如上述，但发现实施球状 体形成处理至接触处理时，特别优选以下培养容器10的尺寸。

对于培养容器10，优选的是，高度H除以当量直径D所得的值为0.3～2的 范围，当量直径D为100μm～1000μm的范围的培养空间11配置有至少2个以 上。此外，隔开培养空间11的壁12的宽度W优选为2μm至50μm的范围。通过 使用这样的培养容器10，可以简单地得到均匀直径的球状体。

为了在具有培养空间11的培养容器10中效率良好地形成球状体，优选抑 制细胞粘附。另一方面，培养基更换、试验溶液更换时，从防止球状体从培 养空间11脱离的目的出发，优选球状体的一部分与培养表面(壁12的表面或 底部培养面14)粘附。因此，可以将抑制细胞对培养表面的粘附的聚合物、 与促进细胞对培养表面的粘附的聚合物的混合物涂覆于培养表面。抑制细胞 对培养表面的粘附的聚合物为选自抑制细胞粘附的亲水性的聚合物链、磷 脂、磷脂-高分子复合体、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚乙烯醇、 琼脂糖、脱乙酰壳多糖、聚乙二醇和白蛋白的组中的一者或为包含它们的组 合的聚合物。促进细胞粘附性的聚合物为选自多聚-L-赖氨酸、多聚-D-赖氨 酸、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白的组中的一者或为包含它们的组合的 聚合物。作为涂覆溶液的一例，可以举出：磷脂、磷脂-高分子复合体即2- 甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)聚合物与多聚-L-赖氨酸溶液的混合 物。MPC溶液浓度优选为0.001％～1％的范围、更优选为0.01％～0.1％的范围。 多聚-L-赖氨酸溶液的浓度优选为0.001～0.1％的范围、更优选为0.005～0.015％ 的范围。MPC溶液与多聚-L-赖氨酸溶液的混合比优选为50:50～100:0的范围、 更优选为75:25～90:10的范围。

对使用培养容器10进行球状体形成时的细胞接种密度没有特别限定，优 选为5000个/cm²～1000000个/cm²的范围，为了形成直径50～150μm的球状体， 优选50个～250个细胞存在于11个区域，所以更优选为100000个/cm²～500000 个/cm²的范围。用于形成球状体的培养时间可以为1天～15天。

＊工序B抽吸处理

培养基的抽吸例如使用巴斯德吸管(Pasteur pipette)进行抽吸。球状体 形成处理中使用的培养基优选抽吸全部量。这是为了消除培养基中所含的血 清的影响。此外，培养基的抽吸中，注意维持形成于培养空间11的球状体与 培养空间11的壁12或底部培养面14粘附的状态。这是由于，通过维持球状体 与壁12或底部培养面14粘附的状态，从而可以防止与形成于其他培养空间11 的球状体粘接。此外，由于若更换试验溶液时和通过用于其的清洗操作而细 胞剥离则无法进行试验，所以优选使细胞与培养空间11粘附。

＊工序C试验溶液添加处理

将该工序与工序C’区别进行说明。

工序C的试验溶液添加处理中，将试验溶液和对照溶液的任一者添加至 孔21。使用对照溶液作为相对于添加试验溶液的实施例的比较例。

对于试验溶液，为了排除基于血清中所含的细胞因子的对细胞的影响而 优选不含血清。另一方面，使试验溶液与细胞接触48小时以上时，为了保持 细胞的生理功能，可以加入0.1～1％范围的血清。

试验溶液的溶剂只要为200～315mOsm/kg的渗透压、且在pH范围6.8～8.4 内有缓冲作用即可。此外，为了保持细胞的生理功能恒定，优选使用包含葡 萄糖、氨基酸、和维生素类等营养素的溶剂。例如通过使用Dulbecco改良Eagle 培养基(DMEM:Dulbecco's modified Eagle medium)和Nutrient Mixture F-12 的混合培养基，从而可以保持生理功能恒定。

对照溶液为从上述试验溶液中去除了细胞因子的溶液，其他条件与试验 溶液相同。

对于试验溶液的细胞因子浓度，设定基准值、使用相对于基准值的至少 3种不同的浓度。对于基准值，以作为对象的疾病患者的细胞因子的血药浓 度的平均值作为基准，设定0.1倍～50倍的范围的浓度。另一方面，疾病患者 的血中细胞因子浓度不明显时，基准值设定为健康人的细胞因子的血药浓度 的平均值的0.1倍～50倍的范围的浓度。然后，使用包含相对于基准值的至少3 种不同的浓度、例如1倍、10倍、100倍这3种浓度的细胞因子的试验溶液。 通过将作为对象的疾病患者的细胞因子的血药浓度设为基准，从而可以评价 基于细胞因子的细胞色素P450的衰减或诱导，由于把握细胞因子的影响，因 此可以对疾病患者的给药量的调整等有用。此外，通过使用相对于基准值的 多个不同浓度，从而可以评价基于细胞因子的细胞色素P450的衰减或诱导是 否依赖于细胞因子的浓度。进而，这是由于，对于基准值的设定方法，为了 反映生物体内的基于细胞因子的代谢酶的影响，优选利用生物体内的浓度进 行评价。

＊工序C’试验溶液添加处理

工序C’的试验溶液添加处理中，将第一试验溶液至第三试验溶液的任一 者添加至孔21。对于各试验溶液，为了排除血清中所含的细胞因子对细胞的 影响，优选不含血清。另一方面，使各试验溶液与细胞接触48小时以上时， 为了保持细胞的生理功能，可以加入0.1～1％的范围的血清。

试验溶液的溶剂只要为200～315mOsm/kg的渗透压、且在pH范围6.8～8.4 内有缓冲作用即可。此外，为了保持细胞的生理功能恒定，优选使用包含葡 萄糖、氨基酸、和维生素类等营养素的溶剂。例如通过使用Dulbecco改良Eagle 培养基(DMEM:Dulbecco's modified Eagle medium)和Nutrient Mixture F-12 的混合培养基，从而可以保持生理功能恒定。

第二试验溶液和第三试验溶液的细胞因子浓度预先按照以下步骤确定。

设定基准值，使用相对于基准值的至少3种不同的浓度，实施工序A’至 工序F’的各处理，分析细胞色素P450的代谢功能，得到测定值。

对于基准值，将健康人的细胞因子或疾病患者的细胞因子的血药浓度的 平均值的0.1倍～50倍的范围的浓度设定为基准。准备包含基准值的1倍、10 倍、100倍至少这3种浓度的细胞因子且不含药剂的3种溶液(换言之，3种第 二试验溶液)、和不含细胞因子及药剂的溶液(第一试验溶液)，与球状体形 状的株化肝细胞接触。测定与多种溶液接触的多个株化肝细胞的细胞色素 P450的代谢功能。进行测定，结果多种细胞因子的浓度中，将小于接触第一 试验溶液的细胞的测定值的浓度用于第二试验溶液和第三试验溶液的细胞 因子浓度。

此外，确定细胞因子浓度时，存活率为80％以上、且使球状体形状的株 化肝细胞与第二试验溶液接触1小时以上且小于96小时时的细胞色素P450的 代谢功能的值(第二测定值)相对于使球状体形状的株化肝细胞与第一试验 溶液接触时的细胞色素P450的代谢功能的值(第一测定值)只要为三分之一 以下即可，更优选为五分之一以下。确定细胞因子浓度时，优选调整为细胞 色素P450的药物代谢功能浓度依赖性地衰减。

通过选择小于第一试验溶液的测定值的细胞因子浓度，形成对细胞色素 P450的代谢功能产生影响的环境。然后，通过使用第三试验溶液的试验，由 于细胞因子的存在而即使为细胞色素P450的代谢功能衰减的情况，也生成可 以检测药剂对细胞色素P450的代谢功能是否产生影响的环境。为了准确地判 定衰减和恢复，第二测定值相对于第一测定值必须为显著小的值。假设约 ±30％的偏差时，第二测定值的平均值如果为第一测定值的平均值的60％的值 以下，则可以明确判断由细胞因子导致药物代谢酶的功能衰减。鉴于该结果， 认为第二测定值优选为第一测定值的三分之一以下。但是，通过显著性检验 (例如t检验)可以判定衰减、恢复，无需为该范围(三分之一以上)。

对于第三试验溶液的药剂的浓度，采用使任意的药剂的浓度的溶液在1 小时至96小时的范围内与细胞接触、存活率超过80％的浓度。设想到浓度过 低时未见基于药剂的细胞色素P450的恢复的情况，因此优选在存活率不低于 80％的范围内使用尽可能高的药剂浓度的试验溶液。

需要说明的是，用于确定细胞因子和药剂的浓度的试验中，与实施例或 比较例同样地实施工序A至工序F的各工序的处理。

＊工序D接触处理

使试验溶液或对照溶液与细胞接触的时间(接触时间)由细胞因子的细 胞毒性的程度确定。细胞毒性为引起细胞死亡的强度。工序D中，接触时间 采用的是，使用预先用于试验的细胞因子浓度的最大值的试验溶液，以1小 时至96小时的范围与细胞接触而存活率变为80％以上的时间。例如，使用1、 10、100倍这3种浓度时，使用包含基准值的100倍的细胞因子的试验溶液来 测定存活率。另外，工序D’中，接触时间采用的是，使用预先用于试验的第 二试验溶液和第三试验溶液，以1小时至96小时的范围与细胞接触而存活率 变为80％以上的时间。确定细胞因子的浓度时，可以选择适合的浓度，使存 活率变为80％以上。

在任意时间内存活率变为80％以下时，采用将设定细胞因子浓度的基准 值为较低、且存活率变为90％以上的反应时间。工序D’中，使各试验溶液与 球状体形状的株化肝细胞接触的时间只要第一试验溶液至第三试验溶液各 自的接触时间相同即可，并且存活率只要为超过80％的范围即可。

图9示出表示使球状体形状的株化肝细胞、与包含细胞因子(白介素-1β) 的试验溶液接触的时间的长短和细胞色素P450的反应性的关系的试验结果。 接触白介素-1β0小时、4小时、8小时时，CYP3A4的基因表达量经时地减少。 误差为20～30％左右。如图9那样，制成近似曲线，算出接触时间1小时的值。 近似曲线使用图9所示的数学式。可以预计，误差20％时，接触时间小于1小 时的情况下，相对于接触时间0小时的值未见显著性差异。因此，细胞与细 胞因子接触的时间设为最低1小时。为了缩短评价期间接触时间越短越好。 此外，还可以削减成本。

培养使用包含营养成分的培养基，但是由于不含血清，所以有细胞的生 理功能降低的可能性。另外，通常培养基更换以培养基中的营养成分没有被 完全消耗的频率、且废物蓄积而不对生理功能造成影响的频率实施。例如， 需要每3～4天更换培养基。即，5天以上的培养从维持细胞的生理活性的观点 出发不适合。因此，使细胞与细胞因子接触的时间设为最大96小时。

＊工序E分析处理

工序E的分析处理中，使用与试验溶液或对照溶液或第一试验溶液至第 三试验溶液接触后的细胞来分析细胞色素P450的代谢功能。测定与第一试验 溶液接触的株化肝细胞的细胞色素P450的药物代谢酶的功能，取得第一测定 值。同样地，测定与第二试验溶液和第三试验溶液接触的株化肝细胞的细胞 色素P450的药物代谢酶的功能，取得第二测定值和第三测定值。

作为细胞色素P450的分析方法，可以使用基于PCR法的基因表达量的测 定、基于蛋白质印迹法的蛋白分析、或使用了液相色谱质谱法(LC/MS/MS: Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry)、高效液相色谱法(HPLC: High performance liquid chromatography)的代谢活性测定等这样的方法。

＊工序F评价处理

将该工序与工序F’区别地进行说明。

工序F的评价处理中，基于工序E的分析处理中分析的代谢功能的值(测 定值)，如下所述进行判定。将与试验溶液接触的细胞的分析结果设为“值T”、 与对照溶液接触的细胞的分析结果设为“值C”时，如下评价工序E中分析的 代谢功能的数值。

值T大于值C(值T＞值C)时，判定为“由于受试物质而细胞色素P450 的代谢功能被诱导”。可知，随着细胞色素P450的分析结果的值增加，细胞 因子诱导细胞色素P450的代谢功能。

另一方面，值T小于值C(值T＜值C)时，判定“由于受试物质而细胞 色素P450衰减”。可知，随着细胞色素P450的分析结果的值减少，细胞因子 使细胞色素P450的代谢功能衰减。

值T与值C相同时，判定“细胞色素P450不受受试物质的影响”。

此外，评价处理中，优选的是，使1倍、10倍、100倍这3种浓度的试验 溶液与细胞接触后的细胞色素P450的功能的分析结果浓度依赖性地增加时， 判定“由于细胞因子而细胞色素P450的代谢功能被诱导”，另外减少时，判 定“由于细胞因子而细胞色素P450的代谢功能衰减”。

然而，没有浓度依赖性的情况下，相对于不含细胞因子的试验溶液、细 胞色素P450的功能的值明显高时也可以判定“由于细胞因子而细胞色素P450 的代谢功能被诱导”、或明显低时也可以判定“由于细胞因子而细胞色素P450 的代谢功能衰减”。

如上述那样，对于一个实施方式的评价方法，使用源自人的株化肝细胞， 培养该株化肝细胞使其增殖，形成期望尺寸的球状体，使该球状体与受试物 质接触，从而评价对细胞色素P450的代谢功能的影响。细胞色素P450的评价 中，基于测定与试验溶液或对照溶液接触的球状体的代谢功能的测定值，对 于受试物质对细胞色素P450的代谢能力是否有影响，判定为衰减、诱导、无 影响的任一者。对于判定结果的种类，不限定于衰减、诱导、无影响的评价， 也可以使用体现受试物质的影响的其他判定结果。

＊工序F’判定处理

工序F’的判定处理中，基于工序E’的分析处理中分析的第一测定值至第 三测定值，第一测定值大于第二测定值、且第二测定值小于第三测定值时， 判定药剂使细胞色素P450的药物代谢功能恢复。用数学式表示时，成为“第 一测定值＞第二测定值”、且“第二测定值＜第三测定值”的情况。特别优 选的是，第三测定值为第二测定值的3倍以上时，判定使药物代谢功能恢复。 其理由如上述，这是由于，为了准确地判定衰减和恢复，第二测定值相对于 第一测定值必须为显著小的值。

实施例

对实施例和比较例进行说明。

1.细胞的准备(球状体形成处理)

[实施例]

(1-1)培养容器和细胞

使用图8所示的具有多个孔21a的培养板1a。在各孔21a的底部培养面形 成有多个培养容器10a。各培养容器10a具有以当量直径D为200μm、高度H为 100μm形成的培养空间11a。另外，壁12a的宽度W为10μm。

培养的细胞使用源自日本人的株化肝细胞即FLC-4细胞。

(1-2)培养容器的准备

使用将0.01％MPC溶液和0.01％的多聚-L-赖氨酸(株式会社SIMGA制造) 以9:1的比例混合而成的溶液作为涂覆剂。

向各孔中加入涂覆溶液0.3mL，在净化台内使其干燥。

使用前用磷酸缓冲生理盐水(PBS:phosphate-buffered saline)清洗。

(1-3)细胞培养

培养基使用包含10％的胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基。调整细 胞悬浮液，使细胞接种密度变为16×10⁵个/mL。

在每1个孔中加入500μL的细胞悬浮液。

在CO₂培养箱内培养细胞10天至11天。培养基更换3天进行1次。

培养基更换时，不吸取全部培养基而残留约100μL，重新加入500μL的培 养基。

[比较例]

培养容器使用市售的培养面为平坦的24孔板。培养板的等级使用细胞培 养等级。

除此之外，在与实施例相同的条件下实施。

2A.用于评价方法研究的试验条件(培养基抽吸处理、试验溶液添加处 理、接触处理)

实施例、比较例均在以下条件下实施试验。

(2A-1)步骤

按照以下步骤处理培养的细胞。

·用吸移管从各孔中抽吸旧的培养基的全部量(培养基抽吸处理)。

·向各孔中添加试验溶液或对照溶液(试验溶液添加处理)。

·在37℃、CO₂培养箱内将细胞孵育8小时、24小时或48小时(接触处理)。

(2A-2)试验溶液、对照溶液的调整

对于试验溶液，在不含血清的DMEM/F12的溶液(DMEM/E12FBS(-)) 中按照表1的浓度溶解细胞因子。

对于对照溶液，使用不含血清的DMEM/F12的溶液，将细胞因子浓度 设为0mM。

(2A-3)分析

利用表1所述的分析方法，分析CYP3A4的代谢功能。对于TNF-α，加 入CYP3A4也分析CYP2C9的功能。

2B.用于筛选方法研究的试验溶液的细胞因子浓度的研究和试验条件

试验溶液的细胞因子浓度的研究在实施例、比较例中均按照以下步骤实 施。

(2B-1)试验溶液的准备

细胞因子使用表皮增殖因子(EFG:Epidermal Growth Factor)。

试验溶液的溶剂使用不含血清的DMEM/F12(DMEM/E12 FBS(-))。

为了研究第二试验溶液和第三试验溶液的细胞因子的浓度，制作EGF浓 度为0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL的试验溶液。需要说明的是，预先用各试 验溶液培养细胞而得到细胞存活率，确认了在这些浓度下的细胞存活率为 80％以上。

(2B-2)步骤

按照以下步骤处理培养的细胞。

·用吸移管从各孔中抽吸旧的培养基的全部量(培养基抽吸处理)。

·向各孔中添加用于研究细胞因子的浓度的试验溶液(试验溶液添加处 理)。

·在37℃、CO₂培养箱内孵育细胞8小时、24小时或48小时(接触处理)。

·分析通过蛋白质印迹法实施。

(2B-3)结果

图10示出研究试验溶液的细胞因子的浓度的试验结果。图中，实施例用 “微空间(MICRO-SPACE)”表示，比较例用“汇合(CONFLUENT)”表 示。将EGF的浓度为0、0.1、1、10ng/mL各自的CYP3A4蛋白量用蛋白质印 迹法分析得到的结果以条带表示。

实施例中，随着EGF的浓度变大，条带变窄，所以确认到CYP3A4的功 能浓度依赖性地降低。作为试验溶液的细胞因子的浓度，第二试验溶液和第 三试验溶液采用10ng/mL的浓度。

比较例中，无法确认浓度依赖性。为了与实施例比较，采用10ng/mL的 浓度。

·试验条件(培养基抽吸处理、试验溶液添加处理、接触处理)

实施例、比较例均在以下条件下实施试验。

(2B-4)试验1

实施对使第一试验溶液和第二试验溶液与球状体形状的株化肝细胞接 触时的细胞色素P450的药物代谢酶的功能的值进行比较的试验。

作为试验，使用2.试验溶液的浓度的研究中实施的试验结果。试验步骤 如上述。

(2B-5)试验2

实施对使第一试验溶液至第三试验溶液与球状体形状的株化肝细胞接 触时的细胞色素P450的药物代谢酶的功能的值进行比较的试验。

对于比较例，试验1的结果中，第一试验溶液和第二试验溶液的试验结 果变为基本相同，由于不满足条件，所以没有实施。对于试验1的结果如后 述。

细胞因子使用表皮增殖因子(EFG:Epidermal Growth Factor)。

药剂使用吉非替尼(Gefitinib)。

试验溶液的溶剂使用不含血清的DMEM/F12(DMEM/E12FBS(-))。

细胞因子的浓度采用10ng/mL。

第一试验溶液包含0mM的EGF和0mM的吉非替尼。

第二试验溶液包含10ng/mL的EGF和0mM的吉非替尼。

第三试验溶液浓度包含10ng/mL的EGF和5μM的吉非替尼。

按照以下步骤处理培养的细胞。

·用巴斯德吸管从各孔中抽吸旧的培养基的全部量(培养基抽吸处理)。

·向各孔中添加第一试验溶液至第三试验溶液(试验溶液添加处理)。

·在37℃、CO₂培养箱内孵育细胞8小时、24小时或48小时(接触处理)。

·分析通过基因分析实施。

3.分析方法

(3-1)代谢活性测定法

去除反应后的上清后，添加包含50μM三唑仑(triazolam)的分析用溶 液，在37℃、5％CO₂的条件下孵育24小时。将回收后的培养基150μL取至试 管，添加作为内标物的奥沙西泮(oxazepam)(甲醇中(in methanol) 0.2μg/mL)50μL，然后加入经过冰冷的乙腈(acetonitrile)(和光纯药工业) 300μL进行搅拌，并离心分离(3000r.p.m.，10分钟，4℃)，从而使蛋白沉降。 之后，使用减压蒸发仪使乙腈蒸发，将上清进行过滤器过滤，将所得溶液70μL 注入HPLC。作为标准曲线用样品，使用将包含10、40、80、160和320皮摩 尔(pmol)的α-羟基三唑仑和4-羟基三唑仑的甲醇溶液各10μL加入至130μL 的培养基而得到的样品。α-羟基三唑仑和4-羟基三唑仑通过HPLC定量。标准 曲线如下求出：将相对于标准曲线用样品的内标物的α-羟基三唑仑和4-羟基 三唑仑的峰高度的比通过最小二乘法进行直线回归，从而求出。

(3-2)基因分析法(RT-qPCR)

对于RNA提取，将培养板1a的2个孔21a量作为1个样品，依据NucleoSpin  RNAII(Macherey-Nagel)的方案进行提取。仅改变Dnase处理的部分，使用 DnaseI重组体(recombinant),RNase-free(脱氧核糖核酸酶)(Roche, Branchburg,NJ,USA)。总RNA(Total RNA)使用高容量cDNA反转录试剂盒 (High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Applied Biosystems,Foster  City,CA,USA))和附带的random hexamer primer(六聚体随机引物)进行逆 转录反应来合成first strand cDNA(第一链cDNA)。

对于分析，在总量20μL中，加入9.6μL EagleTaq Master Mix with ROX (Roche,Branchburg,NJ,USA)、0.96μL 20×Assays-on-DemandTM Gene  Expression Assay Mix(Applied Biosystems)、7.1μL sterilized MiliQ water和5 倍稀释的cDNA 1.8μL，将其作为反应液，利用Real-time PCR进行测定。

(3-3)蛋白质印迹法(WB)

将3～6孔量的细胞用包含0.1％的蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor  cocktail)和1mM PMSF(苯甲基磺酰氯、Phenylmethyl sulfonyl fluoride)的 Lysis buffer进行声波降解，然后以12000g进行15分钟离心，将其上清作为总 细胞提取液。将所得总细胞提取液(10-15μg/泳道)通过10％SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳进行分离，然后以2小时、54V的电压转录至硝化纤维素膜。转录 后的硝化纤维素膜用加入了5％脱脂牛奶的含有0.05％Tweem20的PBS (PBST)在室温下振荡1小时来进行封闭。对于一次抗体，使用将抗人CYP3A 抗体(单克隆,BD Gentest)用加入了3％BSA的PBST稀释至6000倍而成的抗 体，在4℃下孵育一晩。对于二次抗体，使用将抗小鼠IgG-过氧化物酶抗体 (Sigma-Aldrich)用加入了3％BSA的PBST稀释至5000倍而成的抗体，在室温下 振荡1小时。蛋白使用ImmunoStar LD(和光纯药)，用LAS-1000plus(Fujifilm, Tokyo)检测。

4.试验结果

图10至18示出评价方法研究的试验结果。图中，实施例用“微空间 (MICRO-SPACE)”表示，比较例用“汇合(CONFLUENT)”表示。另外， 将向细胞中添加对照溶液的情况(非添加组)表示为“UNT”(未处理、 Untreated)，将添加了试验溶液的情况用添加的细胞因子的浓度(例如 0.1ng/mL)表示。图10至15所示的结果为在正副3次独立的实验的标准平均 值中加入了标准偏差而得到的值。

得到图10的试验结果的操作中，培养FLC-4细胞10天。向所培养的细胞 中添加对照溶液或包含0.1ng/mL、1ng/mL、和10ng/mL的上皮生长因子(EFG: Epidermal Growth Factor)的试验溶液，培养24小时。图10示出对于培养后的 4种EGF浓度的细胞的用RT-qPCR分析CYP3A4mRNA的表达量得到的结果。

得到图11的试验结果的操作中，培养FLC-4细胞10天。向所培养的细胞 中添加对照溶液或包含1ng/mL、10ng/mL、和100ng/mL的肝素结合性上皮增 殖因子样增殖因子(HB-EGF)的试验溶液，培养24小时。图11示出对于培 养后的4种HB-EGF浓度的细胞的用RT-qPCR分析CYP3A4mRNA的表达量的 结果。

得到图12的试验结果的操作中，培养FLC-4细胞10天。向所培养的细胞 中添加对照溶液或包含1ng/mL、10ng/mL、和100ng/mL的白介素-1β(IL-1β) 的试验溶液，培养24小时。图12示出对于培养后的4种IL-1β浓度的细胞的用 RT-qPCR分析CYP3A4mRNA的表达量的结果。

得到图13、14的试验结果的操作中，培养FLC-4细胞10天。向所培养的 细胞中添加对照溶液或包含0.1ng/mL、1ng/mL、和10ng/mL的肿瘤坏死因子 (TNF-α:Tumor Necrosis Factor-α)的试验溶液，培养24小时。图13、14示出 对于培养后的4种EGF浓度的细胞的用RT-qPCR分析CYP3A4 mRNA(图13) 和用RT-qPCR分析CYP2C9 mRNA(图14)的表达量的结果。

得到图15的试验结果的操作中，培养FLC-4细胞10天。向所培养的细胞 中添加对照溶液或包含0.1ng/mL、1ng/mL、和10ng/mL的白介素-6(IL-6: Interluekin-6)的试验溶液，培养24小时。图15示出对于培养后的4种IL-6浓 度的细胞的用RT-qPCR分析CYP3A4mRNA的表达量的结果。

得到图16的试验结果的操作中，培养FLC-4细胞10天。向所培养的细胞 中添加对照溶液或包含0.1ng/mL、1ng/mL、和10ng/mL的IL-6的试验溶液， 培养48小时，之后，添加50μg/mL的三唑仑(triazolam)，培养24小时。图15 示出对于培养后的4种IL-6浓度的细胞的用蛋白质印迹法分析CYP3A4蛋白 量的结果。

图17示出细胞因子的浓度依赖性的试验结果。

图18示出基于评价处理中说明的方法判定试验结果的结果。图18中，项 目“细胞因子的影响”为根据添加了试验溶液的细胞(细胞因子添加组)与 添加了对照溶液的细胞(非添加组)的比较判定的试验结果，项目“浓度依 赖性”表示基于不同的细胞因子浓度的试验结果判定浓度依赖性的试验结 果。图18中，“-”表示无法判定。

实施例中，全部细胞因子均可以确认到相对于对照(细胞因子浓度0mM) CYP3A4的基因表达量优势性地减少。

比较例中，相对于对照(细胞因子浓度0mM)CYP3A4的基因表达量没 有优势性地减少。

上述实施例中使用的细胞因子为一例，对于其他细胞因子当然也可以使 用一个实施方式的评价方法。

筛选方法研究的结果示于以下。

试验1的结果

使用图19所示的试验溶液浓度的研究的试验结果进行判定。图19的试验 结果中，实施例、比较例均对EGF的浓度为0ng/mL的第一试验溶液的结果和 EGF的浓度为10ng/mL的第二试验溶液的结果(图19所示的虚线所围成的4 个条带、CYP3A4蛋白量)比较来进行判定。使第一试验溶液与球状体接触 时的CYP3A4的蛋白量在实施例中设为M0、在比较例中设为C0，使第二试验 溶液与球状体接触时的CYP3A4的蛋白量在实施例中设为M10、在比较例中 设为C10。

实施例中，第二试验溶液的条带比第一试验溶液条带要浅。换言之， M0大于M10(M0＞M10)。

另一方面，比较例中，第一试验溶液的条带与第二试验溶液的条带之间 无法检测到差异。换言之，C0与C10基本相同(C0≒C10)。

试验2的结果

图20示出用RT-qPCR分析使第一试验溶液至第三试验溶液与球状体形 状的株化肝细胞接触时的CYP3A4的mRNA的表达量的结果。图20中，将 CYP3A4mRNA的表达量在第一试验溶液的情况下用(A)表示、第二试验 溶液的情况下用(B)表示、第三试验溶液的情况下用(C)表示。图20的 结果中，对于CYP3A4的代谢功能的值，与第一试验溶液(无细胞因子和药 剂)的情况相比，第二试验溶液(有细胞因子、无药剂)的情况要低。此外， 与第二试验溶液的情况相比，第三试验溶液(有细胞因子和药剂)的情况高 至3倍以上。由该结果可以判定，药剂使细胞色素P450的药物代谢功能恢复。

上述实施例中使用的细胞因子为一例，对于其他细胞因子当然也可以使 用一个实施方式的筛选方法。

需要说明的是，本发明不限定于上述所示的实施方式。本发明的保护范 围中，可以将上述实施方式的各要素变更、追加、变换为对于本领域技术人 员来说能够容易想到的内容。

该申请要求以2012年9月27日申请的日本申请特愿2012-213977、和2012 年9月27日申请的日本申请特愿2012-213978为基础的优先权，将其公开的全 部内容引入至此。

附图标记说明

1、1a  培养板

8  细胞

9  球状体

10、10a  培养容器

11、11a  培养空间

12  壁

13  底部

14  底部培养面

21、21a  孔

22  分隔部