利用负离子发生剂协助微生物发酵制备无患子皂苷的方法

摘要

本发明公开了利用负离子发生剂协助微生物发酵制备无患子皂苷的方法，本发明的技术方案是（1）将干燥后的无患子果皮粉碎到20目，以料液比1∶4加入去离子水，在50℃的恒温条件下浸提8h，重复提取3次，滤除不容物后合并水提液；（2）用纯水清洗负离子发生剂以去除表面杂质，然后加入到水提液中，其投加浓度范围为10~250g/L，投加粒径范围为0.1~20μm；（3）将驯化后的酵母菌接种于配置好的YPD培养基中，在20~30℃的条件下培养1~3天，获得对数期的种子液；（4）接种占水提液1~10％的酵母菌种子液，在30℃的条件下培养2~25天，离心取上清液，过滤出负离子发生剂，循环使用。本发明的优势是能增加溶氧，保持溶液的酸碱平衡，加速酵母菌的新陈代谢。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术等领域，具体涉及利用负离子发生剂协助微生物发酵制备无患子皂苷的方法。

背景技术

负离子粉作为一种具有特殊功能的新型无机材料受到人们的关注，负离子粉是以含硼为特征的铝、钠、铁、锂环状结构的硅酸盐物质，具有永久性的自发电极，受到环境的影响会持久释放羟基负离子，自发调节溶液的pH值趋向碱性，对水溶液的pH具有缓冲作用；负离子能发射远红外线，使水分子团簇变小，提高水的溶解力、渗透力，增加溶氧，增强细胞活力。

无患子皂苷的提取可以采用微生物发酵法来实现，在无患子果皮浸提液中接种一种或几种微生物菌株，可以分解水提液中的糖类、蛋白质等营养成分，获得纯度较高的皂苷，如专利201210211918.1提供一种无患子皂素提取物的发酵精制方法，包括步骤：将无患子提取物酶解糖化，然后用乳酸菌接种发酵。本发明还提供一种无患子皂素提取物的发酵精制产物。本发明根据无患子果皮提取物中含有较高浓度纤维二糖和甘露糖的特点，提出将无患子果皮提取物经过酶解糖化发酵，将其中的糖类物质和少量蛋白转化成乳酸，从而充分利用无患子果皮，获得无患子皂素和乳酸的复配产物，实现无患子果实的高值化利用。该发明的方法将无患子水提液中的糖、蛋白等干扰杂质直接转化为最终产品中的有效组分，制得的无患子精制液体产品质量稳定，纯度高，可用于制备液体洗涤剂或其他液体产品。

发酵过程中，pH值和溶氧是微生物培养的重点控制参数。微生物通常可以在一个比较宽的pH范围内生长，但环境pH可引起细胞膜电荷的变化，从而影响微生物对营养物质的吸收，代谢过程中酶的活性受到抑制，微生物继续生长受阻。同时，pH变化会改变营养物质分子的电离状态，降低它们被微生物利用的有效性。同一种微生物由于培养液pH值的不同，不仅代谢途径发生变化，而且代谢产物也会不同。在发酵的不同阶段，微生物对pH的要求也有差异。好氧微生物的生长和代谢均需要氧气，由于氧在水中的溶解度很小，在发酵液中亦如此，因此，需要不断通风、搅拌或振荡，才能满足不同发酵过程对氧的需求。在不同的环境条件下，各种不同的微生物的吸氧量或呼吸强度是不同的，溶氧的大小对菌体的生长和代谢产物的形成及产量都会产生不同的影响。

综上所述，合适的供氧和pH是发酵能否成功的重要限制因素。在发酵过程中，好氧微生物的生长利用葡萄糖需要不断振荡增加溶氧，糖代谢快速利用糖分解成小分子酸、醇、CO₂，使pH下降。传统的应对方法是在发酵过程中添加相应的缓冲液调整体系的pH值，同时不间断的振荡，使微生物生长代谢处于最优的条件。该方法不仅耗时耗能，而且无法保证发酵条件的稳定。在发酵体系中加入负离子发生剂可以减少氧气的通入和维持体系的pH值稳定。

发明内容

本发明的目的是提供利用负离子发生剂协助微生物发酵制备无患子皂苷的方法。该方法不仅能有效增加发酵液中溶氧，调节环境pH，促进酵母菌生长，提高杂质成分的降解率，而且原料易取得、成本低廉、操作简单、经济可行，促进了该工艺的推广和普及。

本发明的技术方案所采取的技术方案如下：

将干燥后的无患子果皮粉碎到20目，以料液比1：4加入去离子水，在50℃的恒温条件下浸提8h，重复提取3次，，滤除不容物后合并提取液。

用纯水清洗负离子发生剂以去除表面杂质，然后加入到水提液中，其投加浓度范围为10~250g/L，投加粒径范围为0.1~20μm。

将驯化后的酵母菌接种于配置好的YPD培养基中，在20~30℃的条件下培养1~3天，获得对数期的种子液。

.接种占水提液1~10％的酵母菌种子液，在30℃的条件下培养2~25天，离心取上清液，过滤出负离子发生剂，循环使用。

本发明所述的用于酵母菌培养的YPD培养基成分为:10 g酵母膏，20 g蛋白胨，20g葡萄糖，水1L，调节pH 值约为5.5。

本发明具有的优点是：

负离子发生剂廉价易得，其成本远低于其他缓冲液试剂及仪器运行成本；另一方面，负离子发生剂能刺激酵母菌的生长，增加溶氧，并有效缓冲溶液的pH值；又由于负离子发生剂具有较高的物理化学稳定性，因此可重复利用，不产生二次污染。本发明通过投加负离子发生剂来提高酵母菌活性用于皂苷杂质处理的方法具有广泛的应用前景与极高的推广价值。

具体实施方案

实施例1

无患子果皮于60℃烘箱中烘干，粉碎过20目筛，取无患子果皮1 Kg放入10 L反应器中，加4 L去离子水，常压、50℃恒温浸提3次，每次8h，合并提取液并离心，得低纯度提取液。将负离子发生剂加到水提液中，搅拌使其均匀分散，空白对照样品不加负离子粉。在YPD培养基中逐步加入无患子果皮水提液，让酵母菌循序渐进的适应该发酵环境，驯化出对水提液具有耐受性的酵母菌。将驯化后的酵母菌接种于配置好的YPD培养基中，在20~30℃的条件下培养1~3天，获得对数期的种子液。接种5％对数期的酵母菌种子液于混合液中，常压、28℃下恒温培养15d，离心分离得到上清液，过滤负离子发生剂。

实施例2

处理方案为：

负离子发生剂平均粒径为10 μm，投加浓度设为40 g/L，调节pH为5，其他步骤如实施例1所述。培养结束后，投加负离子发生剂的样品中无患子皂苷的纯度为40%，未添加负离子发生剂的样品中无患子皂苷的纯度为30%，投加负离子发生剂的样品比空白对照纯度提高33.3%，负离子发生剂促进细胞的生长代谢，加速杂质的分解。

实施例3

处理方案为：

负离子发生剂平均粒径为10μm，投加浓度设为80g/L，调节pH为5，其他步骤如实施例1所述。培养结束后，投加负离子发生剂的样品中无患子皂苷的纯度为50%，比空白对照纯度提高66.7%，适当增大负离子发生剂的投加量，利于负离子发生剂更好的发挥效益，增强细胞活力。

实施例4

处理方案为：

负离子发生剂平均粒径为1μm，投加浓度设为80g/L，调节pH为5，其他步骤如实施例1所述。培养结束后，投加负离子发生剂的样品中无患子皂苷的纯度为60%，比空白对照纯度提高100%，负离子发生剂的平均粒径减小，有利于酵母菌对营养成分的降解，提高皂苷纯度。

实施例5

处理方案为：

负离子发生剂平均粒径为0.1μm，投加浓度设为100g/L，调节pH为5，其他步骤如实施例1所述。培养结束后，投加负离子发生剂的样品中无患子皂苷的纯度为70%，投加负离子发生剂的样品比空白对照纯度提高133%，负离子发生剂的平均粒径越小，投加量在一定的范围内增加，皂苷的纯度越高。