十二烷基癸烯酸BDSF在提升RAW264.7巨噬细胞吞噬能力中的应用

摘要

本发明涉及十二烷基癸烯酸BDSF在提升RAW264.7巨噬细胞吞噬能力中的应用，属于生物药品技术领域。加入BDSF的浓度为3～300μmol/L时可以提升RAW264.7巨噬细胞吞噬C.albicans的能力，BDSF提升RAW264.7巨噬细胞吞噬C.Albicans的作用时间为2h，3h，4h，5h，6h。BDSF具有低生物毒性，且对免疫细胞RAW264.7巨噬细胞吞噬能力的提升有显著效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种十二烷基癸烯酸BDSF在提升RAW264.7巨噬细胞吞噬的能 力中的应用，属于生物药品技术领域。

背景技术

C.abicans白色假丝酵母(又称白念珠菌)是人体重要的条件致病真菌。在正 常人体中,白假丝酵母是一种无害共生真菌；在免疫力低下人群中,白假丝酵母可 引起假丝酵母病,轻者可导致黏膜感染,重者可发展为系统性疾病,甚至危及生命。 白假丝酵母从酵母相至菌丝相的形态转变是极其重要的致病因素之一。

十二烷基癸烯酸(BDSF)是小分子短链脂肪酸，由Burkholderia cenocepacia 分泌产生。BDSF属于DSF家族在结构上与DSF十分相似，分子结构式为 文献(Boon C,Deng Y,Wang  LH,He Y,Xu JL,Fan Y,Pan SQ,Zhang LH.A novel DSF-like signal from Burkholderia  cenocepacia interferes with Candida albicans morphological transition[J].ISME  J,2008,2(1):27-36.)

RAW264.7巨噬细胞(单核巨噬细胞)属免疫细胞，有多种功能，是研究细 胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。一旦机体创伤活动开始,巨噬细胞 就能大量分泌多种生物活性物质以及多种酶类物质，其中生物活性物质又称巨噬 细胞源性生物因子，包括多肽转换生长因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、血小 板衍生生长因子以及一氧化氮等；酶类物质主要包括胶原酶、弹性蛋白酶、纤溶 酶原激活剂等；些生物活性物质直接引导着机体修复的整进程。同时，巨噬细胞 作为炎症阶段的主要吞噬细胞，负责清除机体损伤处组织和细胞的坏死碎片以及 病原体等，这些物质对创伤愈合过程都有重要的调控作用。因此，研究创伤修复 过程中巨噬细胞释放的细胞因子的种类和含量在创伤后不同时间的变化规律，将 可能从分子水平和细胞水平上提供一些与损伤时间相关的标志性变化或依据；而 文献报道巨噬细胞吞噬物的变化亦具有与时间相关的特点，巨噬细胞吞噬物在形 态上易于观察和检测，这些特征使得巨噬细胞在损伤时间推断过程中具有重要的 法医学意义。

发明内容

本发明解决的技术问题是：提供BDSF的新用途，即BDSF在提升RAW264.7 巨噬细胞吞噬C.albicans的能力中的应用。

本发明的技术方案是十二烷基癸烯酸BDSF在提升RAW264.7巨噬细胞吞噬 能力中的应用，加入BDSF的浓度为3～300μmol/L时可以提升RAW264.7巨噬 细胞吞噬C.albicans的能力。

优选的，所述BDSF的浓度为100μmol/L。

优选的，BDSF提升RAW264.7巨噬细胞吞噬C.Albicans的作用时间为2h， 3h，4h，5h，6h。

有益效果：

本研究中的BDSF具有低生物毒性，且对免疫细胞RAW264.7巨噬细胞吞噬 能力的提升有显著效果，使得小分子脂肪酸BDSF对动物细胞免疫功能方面的影 响有重要的研究意义，同时为免疫学研究提供了新的材料，对微生物及生物免疫 方面具有重要的研究意义。

附图说明

下面结合附图对本发明的作进一步说明。

图1.RAW264.7巨噬细胞在BDSF作用下吞噬一个或多个C.albicans细胞

图2.BDSF对RAW264.7巨噬细胞吞噬C.albicans细胞的吞噬率的影响

图3.BDSF对RAW264.7巨噬细胞吞噬C.albicans细胞的吞噬指数的影响

图4.共聚焦显微镜连续拍摄RAW264.7巨噬细胞吞噬多个C.albicans细胞 的过程

图5.MTT比色法检测BDSF对RAW264.7巨噬细胞作用12、24、36、48h 的细胞活力情况

具体实施方式

为了更好地理解本发明专利的内容，下面通过具体的实例来进一步说明本发 明的技术方案。但这些实施实例并不限制本发明。

实施例1

MTT比色法检测BDSF对RAW264.7巨噬细胞的细胞活力影响的实验:

在RAW264.7细胞培养液中加入BDSF，浓度分别为0、3、30、100、200、 300μmol/L。

传代培养RAW264.7巨噬细胞，将细胞接种于5块96孔板上每孔100μL(密 度为1×104)每组6个复孔，37℃5％CO2孵育箱内培养过夜后，加入含不同 浓度的BDSF的培养液继续培养12、24、36、48h，空白对照组不加BDSF，达 到药物作用时间后加入MTT孵育4h后加入DMSO 150μL震荡10min，使用酶 标仪在波长570nm处检测吸光度。

如图5实验结果显示，加入BDSF对RAW264.7巨噬细胞的生长及活力影响 和对照组相比无明显变化，可以显示出，BDSF对RAW264.7巨噬细胞的生长增 值无不良影响，生物毒性低，显示出BDSF的应用前景良好。

实施例2

瑞氏吉姆萨染色法分析BDSF作用下RAW264.7巨噬细胞吞噬C.albicans 120min的实验：

将传代培养的RAW264.7巨噬细胞以5×105的密度接种于24孔板中，细胞 贴壁后加入不同浓度的BDSF(浓度分别为0，3，30，100，200，300μmol/L) 并培养24h后，更换新培养液；将过夜培养的酵母态C.albicans加入24孔板中 共同培养，C.albicans与RAW264.7巨噬细胞的比例为3：1；经过C.albicans与 RAW264.7巨噬细胞的的共同培养120min后，用1％PBS洗液洗涤3次，洗去未 固定的细胞，用瑞氏吉姆萨染液固定并染色20分钟后，用1％PBS洗液洗涤3 次，再在荧光显微镜下观察并计算出RAW264.7吞噬C.albicans的吞噬率(至少 吞噬一个真菌细胞的巨噬细胞百分数)及吞噬指数(每100个巨噬细胞吞噬真菌 细胞的总数)。如图2实验结果显示，不同浓度BDSF作用于RAW264.7巨噬细 胞后吞噬C.albicans的吞噬率分别为4.0％、6.9％、11.8％、11.9％、11.8％、8.0％， BDSF为3～300μmol/L时RAW264.7巨噬细胞的吞噬率均高于对照组的4.0％， 其中BDSF浓度为100μmol/L达到最大吞噬率为11.9％；如图3实验结果显示， 不同浓度BDSF作用于RAW264.7巨噬细胞后吞噬C.albicans的吞噬指数分别为 0.28、0.46、0.61、0.60、0.69、0.36，BDSF为3～300μmol/L时RAW264.7巨 噬细胞的吞噬指数均高于对照组的0.28。总结得出BDSF作用2h可以提高 RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力。数据获取于三组独立的实验，分析至少每孔200 个巨噬细胞。

实施例3

瑞氏吉姆萨染色法分析BDSF作用下RAW264.7巨噬细胞吞噬C.albicans 180min的实验:

(1)将传代培养的RAW264.7巨噬细胞以5×105的密度接种于24孔板中， 细胞贴壁后加入不同浓度的BDSF并培养24h后，更换新培养液；将过夜培养的 酵母态C.albicans加入24孔板中共同培养，C.albicans与RAW264.7巨噬细胞 的比例为3：1；

(2)经过C.albicans与RAW264.7巨噬细胞的的共同培养180min后，用 1％PBS洗液洗涤3次，洗去未固定的细胞，用瑞氏吉姆萨染液固定并染色 20分钟后，用1％PBS洗液洗涤3次，再在荧光显微镜下观察并计算出RAW264.7 吞噬C.albicans的吞噬率(至少吞噬一个真菌细胞的巨噬细胞百分数)及吞噬指 数(每100个巨噬细胞吞噬真菌细胞的总数)。如图2实验结果显示，不同浓度 BDSF作用于RAW264.7巨噬细胞后吞噬C.albicans的吞噬率分别为12.0％、 15.9％、24.0％、34.5％、27.7％、30.1％，BDSF为3～300μmol/L时RAW264.7 巨噬细胞的吞噬率均高于对照组的12.0％，其中BDSF浓度为100μmol/L达到 最大吞噬率为34.5％；如图3实验结果显示，不同浓度BDSF作用于RAW264.7 巨噬细胞后吞噬C.albicans的吞噬指数分别为0.39，0.61，1.01，0.80，1.20，0.84， BDSF为3～300μmol/L时RAW264.7巨噬细胞的吞噬指数均高于对照组的0.39。 总结得出BDSF作用3h可以提高RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力。数据获取于 三组独立的实验，分析至少每孔200个巨噬细胞。

实施例4

瑞氏吉姆萨染色法分析BDSF作用下RAW264.7巨噬细胞吞噬C.albicans 240min的实验:

(1)将传代培养的RAW264.7巨噬细胞以5×105的密度接种于24孔板中， 细胞贴壁后加入不同浓度的BDSF并培养24h后，更换新培养液；将过夜培 养的酵母态C.albicans加入24孔板中共同培养，C.albicans与RAW264.7巨噬 细胞的比例为3：1；

(2)经过C.albicans与RAW264.7巨噬细胞的的共同培养240min后，用 1％PBS洗液洗涤3次，洗去未固定的细胞，用瑞氏吉姆萨染液固定并染色 20分钟后，用1％PBS洗液洗涤3次，再在荧光显微镜下观察并计算出RAW264.7 吞噬C.albicans的吞噬率(至少吞噬一个真菌细胞的巨噬细胞百分数)及吞噬指 数(每100个巨噬细胞吞噬真菌细胞的总数)。如图2实验结果显示，不同浓度 BDSF作用于RAW264.7巨噬细胞后吞噬C.albicans的吞噬率分别为12.2％、 30.5％、32.9％、55.3％、37.5％、34.0％，BDSF为3～300μmol/L时RAW264.7 巨噬细胞的吞噬率均高于对照组的12.2％，其中BDSF浓度为100μmol/L达到 最大吞噬率为55.3％；如图3实验结果显示，不同浓度BDSF作用于RAW264.7 巨噬细胞后吞噬C.albicans的吞噬指数分别为0.35，0.63，1.9，1.73，1.86，1.23， BDSF为3～300μmol/L时RAW264.7巨噬细胞的吞噬指数均高于对照组的0.35。 总结得出BDSF作用4h可以提高RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力。数据获取于 三组独立的实验，分析至少每孔200个巨噬细胞。

实施例5

瑞氏吉姆萨染色法分析BDSF作用下RAW264.7巨噬细胞吞噬C.albicans 300min的实验

(1)将传代培养的RAW264.7巨噬细胞以5×105的密度接种于24孔板中， 细胞贴壁后加入不同浓度的BDSF并培养24h后，更换新培养液；将过夜培 养的酵母态C.albicans加入24孔板中共同培养，C.albicans与RAW264.7巨噬 细胞的比例为3：1；

(2)经过C.albicans与RAW264.7巨噬细胞的的共同培养300min后，用 1％PBS洗液洗涤3次，洗去未固定的细胞，用瑞氏吉姆萨染液固定并染色 20分钟后，用1％PBS洗液洗涤3次，再在荧光显微镜下观察并计算出RAW264.7 吞噬C.albicans的吞噬率(至少吞噬一个真菌细胞的巨噬细胞百分数)及吞噬指 数(每100个巨噬细胞吞噬真菌细胞的总数)。如图2实验结果显示，不同浓度 BDSF作用于RAW264.7巨噬细胞后吞噬C.albicans的吞噬率分别为13.1％、 33.5％、33.8％、54.1％、41.5％、35.1％，BDSF为3～300μmol/L时RAW264.7 巨噬细胞的吞噬率均高于对照组的13.1％，其中BDSF浓度为100μmol/L达到 最大吞噬率为54.1％；如图3实验结果显示，不同浓度BDSF作用于RAW264.7 巨噬细胞后吞噬C.albicans的吞噬指数分别为0.38，0.67，1.16，1.90，1.78，1.27， BDSF为3～300μmol/L时RAW264.7巨噬细胞的吞噬指数均高于对照组的0.38。 总结得出BDSF作用5h可以提高RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力。数据获取于 三组独立的实验，分析至少每孔200个巨噬细胞.

实施例6

瑞氏吉姆萨染色法分析BDSF作用下RAW264.7巨噬细胞吞噬C.albicans 360min的实验

(1)将传代培养的RAW264.7巨噬细胞以5×105的密度接种于24孔板中， 细胞贴壁后加入不同浓度的BDSF并培养24h后，更换新培养液；将过夜培 养的酵母态C.albicans加入24孔板中共同培养，C.albicans与RAW264.7巨噬 细胞的比例为3：1；

(2)经过C.albicans与RAW264.7巨噬细胞的的共同培养360min后，用 1％PBS洗液洗涤3次，洗去未固定的细胞，用瑞氏吉姆萨染液固定并染色 20分钟后，用1％PBS洗液洗涤3次，再在荧光显微镜下观察并计算出RAW264.7 吞噬C.albicans的吞噬率(至少吞噬一个真菌细胞的巨噬细胞百分数)及吞噬指 数(每100个巨噬细胞吞噬真菌细胞的总数)。如图2实验结果显示，不同浓度 BDSF作用于RAW264.7巨噬细胞后吞噬C.albicans的吞噬率分别为12.3％、 33.4％、34.1％、47.7％、40.0％、36.3％，BDSF为3～300μmol/L时RAW264.7 巨噬细胞的吞噬率均高于对照组的12.3％，其中BDSF浓度为100μmol/L达到 最大吞噬率为47.7％；如图3实验结果显示，不同浓度BDSF作用于RAW264.7 巨噬细胞后吞噬C.albicans的吞噬指数分别为0.36，0.65，0.99，1.98，1.85，1.40， BDSF为3～300μmol/L时RAW264.7巨噬细胞的吞噬指数均高于对照组的0.36。 总结得出BDSF作用6h可以提高RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力。数据获取于 三组独立的实验，分析至少每孔200个巨噬细胞.

实施例7

共聚焦显微镜连续拍摄在100μmol/LBDSF作用下，RAW264.7巨噬细胞 吞噬C.albicans的实验。

步骤i.传代培养的RAW264.7巨噬细胞以5×105的密度接种于培养皿中， 细胞贴壁后加入100μmol/L的BDSF并培养24h；

步骤ii.将过夜培养的酵母态C.albicans加入步骤i中的培养中共同培养， C.albicans与RAW264.7巨噬细胞的比例为3：1；

步骤iii.利用共聚焦显微镜的连续拍摄功能每隔10s拍摄一次培养皿中细胞 的状态，连续拍摄五小时，观察其中RAW264.7巨噬细胞与C.albicans的作用情 况。

如图1所示，在100μmol/LBDSF作用下，RAW264.7巨噬细胞吞噬一个 和多个C.albicans的现象。细胞的活力增强，吞噬能力得到提升。

如图4所示，图中的RAW264.7巨噬细胞从A-L这段时间内不断吞噬多个 C.albicans的现象，可以看出BDSF可显著提高RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力。

本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的 技术方案均为本发明要求的保护范围。