用作癌症进展的标记物和治疗癌症的治疗靶标的MIR-18B

摘要

本公开内容提供了基于miR-18b表达水平预测和/或确定受试对象是否患有癌症的方法。本公开内容还提供了基于两个时间点间的miR-18b表达水平变化确定受试对象的癌症是正在进展还是正在消退的方法。本公开内容还提供了通过给予包含miR-18b的多核苷酸和/或增强miR-18b表达的物质来治疗患有癌症的受试对象的方法。

说明书

与相关申请的交叉引用

本申请根据U.S.C.§119要求2012年9月19日提交的临时申请序列号 61/703,057的优先权，该临时申请的公开内容通过引用并入本文。

政府许可权利

本申请是在国立卫生研究院/国家癌症研究所授予的基金号CA114337和 CA122947的政府支持下完成的。政府对本申请有某些权利。

技术领域

本公开内容提供用于癌症诊断、受试对象存活率、和/或癌症进展的方法， 所述方法基于对微小RNA(microRNA)miR-18b的表达水平的测量。本公开内 容还提供通过增强miR-18b的表达治疗患有癌症的受试对象的方法。

背景技术

黑色素瘤，一种在其晚期预后较差的威胁生命的恶性肿瘤，占了皮肤癌死 亡的80％。它在美国是第六种最常见的癌症，每年有60,000多个新病例。黑色 素瘤在实体瘤中很独特的一点是它们很少在p53基因中带有突变。除了可导致 p14ARF缺失的CKDN2A基因中的突变之外，p53途径在很多黑色素瘤中被抑 制的机制是未知的。除手术切除原发肿瘤外，当前还没有治愈性的标准疗法， 尤其是对于更加晚期的阶段。因此，本领域长久以来需要开发不仅能够用于追 踪黑色素瘤的进展而且能够用作调节和抑制黑色素瘤进展的靶标的分子标记 物。

发明内容

本公开内容提供了miR-18b在癌症中的功能性作用，调节其表达的分子机 制，并将原癌基因MDM2鉴定为癌症中miR-18b作用的靶标。

本公开内容提供了预测受试对象是否患有癌症如黑色素瘤的方法，包括：(i) 从受试对象获得生物学样品，如组织活检；(ii)测量所述受试对象的生物学样品 中pre-miR-18b (UGUGUUAAGGUGCAUCUAGUGCAGUUAGJGAAGCAGCUUAGAAUCUACUGCCCUAAAUGCCCCUUC UGGCA；SEQ ID NO：2)或加工的/成熟miR-18b-5p (UAAGGUGCAUCUAGUGCAGUUAG；SEQ ID NO：1(of SEQ ID NO:2的6至 28)、或miR-18b-3p UGCCCUAAAUGCCCCUUCUGGC；SEQ ID NO：3(SEQ ID  NO:2的49-70))的表达水平；(iii)将所述受试对象生物学样品中的miR-18b表达 水平与来自一个或多个对照生物学样品如良性痣的组织活检的miR-18b表达水 平进行比较；以及(iv)基于与对照样品中miR-18b的平均表达水平相比具有更 低的miR-18b表达水平来预测所述受试对象是否患有癌症。另一个实施方式中， 对照生物学样品或良性痣来自同一受试对象或者不来自同一受试对象。

本公开内容提供了确定受试对象是否患有癌症的方法，包括：(i)从受试对 象获得生物学样品，如组织活检；(ii)测量所述受试对象的生物学样品中miR-18b 的表达水平；(iii)将所述受试对象生物学样品中的miR-18b表达水平与来自一 个或多个对照生物学样品如良性痣的组织活检的miR-18b表达水平进行比较； 以及(iv)基于与对照样品中miR-18b的表达水平相比具有显著更低的miR-18b 表达水平来确定所述受试对象是否患有癌症。另一个实施方式中，对照生物学 样品来自同一受试对象或者来自不同受试对象。

本公开内容提供了确定受试对象的癌症如黑色素瘤是正在进展还是在康复 中的方法，包括：(i)在第一时间点从受试对象获得生物学样品，如组织活检；(ii) 测量来自所述第一时间点的受试对象生物学样品中miR-18b的表达水平；(iii)在 第二时间点从受试对象获得生物学样品，如组织活检；(iv)测量来自所述第二 时间点的受试对象生物学样品中miR-18b的表达水平；(v)比较来自所述第一时 间点的miR-18b表达水平与来自所述第二时间点的表达水平；以及(vi)基于来 自所述两个时间点的miR-18b表达水平的改变来确定癌症是正在进展还是在康 复中，其中所述第一时间点和所述第二时间点之间miR-18b表达水平的增加表 示癌症在康复中，其中所述第一时间点和第二时间点之间miR-18b表达水平的 减少表示癌症正在进展。

本公开内容提供了预测患有癌症如黑色素瘤的受试对象的存活率的方法， 包括(i)在第一时间点从受试对象获得生物学样品；(ii)测量来自所述第一时间点 的受试对象生物学样品中miR-18b的表达水平；(iii)在第二时间点从受试对象 获得生物学样品；(iv)测量来自所述第二时间点的受试对象生物学样品如组织 活检中miR-18b的表达水平；(v)比较来自所述第一时间点的miR-18b表达水平 与来自所述第二时间点的表达水平；以及(vi)基于来自所述两个时间点的 miR-18b表达水平的改变来预测受试对象的存活率，其中所述第一时间点和第二 时间点之间miR-18b表达水平的增加表示受试对象有较好的存活率，其中所述 第一时间点和第二时间点之间miR-18b表达水平的减少表示受试对象有较差的 存活率。

本公开内容提供了治疗受试对象的癌症如黑色素瘤的方法，包括：给予有 效量的增强miR-18b表达的物质。一个实施方式中，本公开内容提供了一种方 法，其中增强miR-18b表达的物质是表达miR-18b的载体，所述载体含有SEQ ID  NO:1或与SEQ ID NO:1至少98％相同的序列。一个实施方式中，所述载体是复 制型逆转录病毒载体如MLV(参见例如，国际公开号WO 2010/036986，其公开 内容并入本文)或腺病毒载体。其他实施方式中，载体可以是复制缺陷型载体。 在又另外的实施方式中，可使用包含双链RNA结合结构域和蛋白转导结构域(参 见，例如，美国专利出版号20090093026-A1,其公开内容通过引用并入本文) 或可中和miR-18b阴离子电荷的纳米颗粒的递送系统。在又一实施方式中， miR-18b表达的增强导致抑制或防止癌细胞增殖。在另一实施方式中，miR-18b 表达的增强导致癌细胞中MDM2表达的减少。在又一实施方式中，额外的治疗 剂与包含miR-18b的多核苷酸和/或增强miR-18b表达的物质组合给药。额外的 治疗剂的例子包括但不限于，铂类似物，烷化剂，烷基磺酸酯，雄激素，抗肾 上腺素药，抗雄激素药，抗生素，抗雌激素药，芳香酶抑制性4(5)-咪唑，抗代 谢药，叶酸类似物，氮杂环丙烷类(ethylenimines)和甲基蜜胺类 (methylamelamines)，叶酸补充剂，氮芥，亚硝基脲，嘌呤类似物，嘧啶类似 物，拓扑异构酶抑制剂，胸苷酸合成酶抑制剂，抗癌抗体，化疗剂，靶向治疗 剂如威罗菲尼(vemurafenib)、达拉非尼(dabrafenib)、曲美替尼(trametinib)、 厄洛替尼(erlotinib)和格列卫(Gleevec)，以及去甲基化剂。在一个具体的实 施方式中，额外治疗剂是顺铂。

本公开内容提供了一个或多个实施方式，表示在所附的附图和以下说明书 中。鉴于本公开内容的说明书和附图以及权利要求，本发明的其他特点、目的 和优势将是显而易见的。

附图说明

图1A-C显示，miR-18b的表达在黑色素瘤中被抑制。(A)miRNA-定量分 析显示与痣样品相比，一组黑色素瘤样品中miR-18b的表达被显著抑制。(B)黑 色素瘤样品中miR-18b的抑制预测了总体存活。低miR-18b表达者定义为 miR-18b表达低于平均的样品，高miR-18b表达者定义为miR-18b表达高于平 均的样品。(C)与正常人黑色素细胞相比，miR-18b的表达在黑色素瘤细胞系中 被抑制。其中，*是p<0.05。

图2A-D显示miR-18b的表达被超甲基化抑制。(A)示例性表示针对甲基化 分析的miR-18b上游区域(2500bp)，竖线代表CpG位点。(B)5AZA处理后， miR-18b表达(通过qRT-PCR测定)在五个黑色素瘤细胞系(C8161.9、LOX、 1205-Lu、DO4和WM278)中被上调。(C)在黑色素瘤细胞系和30个肿瘤样品 中miR-18b启动子的甲基化状态；M，用识别甲基化序列的引物产生的扩增产 物；U，用识别非甲基化序列的引物产生的扩增产物。(D)miR-18b过表达后在 细胞上进行的染色质免疫沉淀。miR-18b过表达导致染色质活化修饰(乙酰组氨 酸H3、H4和甲基-2H3K4)的富集和阻抑性修饰(2H3K9和3H3K9)的减少。

图3A-F显示MDM2作为miR-18b的直接靶标，以及黑色素瘤细胞中 miR-18b和MDM2的负相关。(A)miR-18b的种子序列(SEQ ID NO:1)与 MDM2的3’UTR(SEQ ID NO:10和11)互补。(B)在不同的人黑色素瘤细胞系和 正常的黑色素细胞中mRNA和蛋白水平的MDM2表达。(C)和(D)两个重复的萤 光素酶试验，显示用MDM2-3’UTR和miR-18b分别共转染1205-Lu细胞和LOX 细胞后报告子活性的减少。突变的3UTR对报告子活性没有影响。(E)用miR-18b 转染后1205-Lu细胞中的相对miR-18b表达水平，通过miR qRT-PCR测定。(F) 免疫印迹分析显示蛋白水平上的MDM2的抑制和p53、p21以及PUMA的上调。 其中，*是p<0.05。

图4A-F miR-18b抑制1205-Lu黑色素瘤细胞增殖、集落形成，并诱导凋亡。 (A)与对照miR相比，miR-18b转染后1205-Lu细胞的增殖能力被显著降低。(B) miR-18b过表达显著抑制了1205-Lu黑色素瘤细胞的集落形成能力。(C)细胞周 期分析表明在过表达miR-18b的1205-Lu细胞中S-期显著减少。(D)与表达对 照miR的细胞相比，miR-18过表达显著诱导了1205-Lu细胞中的凋亡。(E-F) MDM2和miR-18b的共转染逆转了对细胞增殖的抑制以及p53、p21和PUMA 的表达水平。*p<0.05。

图5A-E显示，在转染的LOX细胞中，miR-18b抑制黑色素瘤细胞增殖并 在黑色素瘤细胞中诱导凋亡。(A)与对照miR相比，miR-18b转染后LOX细胞 的增殖能力被显著降低。(B)miR-18b过表达显著抑制了黑色素瘤细胞的集落形 成能力。(C)免疫印迹显示，转染了miR-18b(相对于对照miR)的LOX细胞 中MDM2、BCL2、和BCL-XL的表达被下调，而转染了miR-18b(相对于对照 miR)的LOX细胞中p53、p21、和PUMA的表达被上调。提供GAPDH作为对 照。(D)细胞周期分析表明在过表达miR-18b的LoX细胞中S-期显著减少。(E) 凋亡分析表明，相对于用对照miR转染的LOX细胞，用miR-18b转染的LOX 细胞中的凋亡细胞数目增加。

图6A-G显示miR-18b稳定的过表达在体外和体内抑制细胞增殖。(A)稳 定表达miR-18b的1205-Lu细胞中的相对miR-18b表达水平(由miR qRT-PCR 测定)。(B)黑色素瘤细胞系中miR-18b的稳定过表达显著抑制了细胞增殖。(C) 集落形成能力被miR-18b显著降低。(D)miR-18b的稳定表达抑制了细胞周期 的S-期。(E)稳定的miR-18b过表达在1205-Lu细胞中诱导凋亡。(F)免疫印迹 分析显示MDM2的抑制和p53、p21以及PUMA的上调。(G)与表达对照miR 的细胞相比，皮下注射表达miR-18b的1205-Lu细胞后肿瘤体积被显著减少 (N＝10只小鼠/组)。免疫印迹显示了表达对照miR和miR-18b的皮下肿瘤中 MDM2的表达。其中，*是p<0.05。

图7A-B显示顺铂诱导miR-18b。(A)如qRT-PCR所测定，顺铂在处理48 小时后诱导miR-18b的表达。(B)miR-18b过表达和顺铂处理比单独用顺铂处 理对黑色素瘤细胞的增殖能力产生更大的抑制。

图8A-E显示miR-18b抑制黑色素瘤细胞的迁移和侵袭性，并逆转上皮-至- 间充质-转变(EMT)。(A)和(B)两个重复的实验，显示相对于表达对照mir的细胞， miR-18b过表达显著抑制了1205-Lu黑色素瘤细胞系的迁移能力和侵袭性。(C) 和(D)免疫荧光试验表明，1205-Lu黑色素瘤细胞中miR-18b的过表达下调波形 蛋白和N-钙粘蛋白的表达。DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)指示DNA在细胞中 的位置。(E)免疫印迹显示，N-钙粘蛋白、波形蛋白和Slug表达在用miR-18b转 染相对于用对照miR转染的1205-Lu黑色素瘤细胞中被下调，而E-钙粘蛋白表 达在用miR-18b转染相对于用对照miR转染的1205-Lu黑色素瘤细胞中被上调。 提供GAPDH作为转染的对照。

图9显示miR-18b和BRAF抑制剂对黑色素瘤细胞系的细胞增殖的影响。

具体实施方式

如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“a/an(一/一个)”和“该” 包括复数指代，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“a probe(一探针)” 时，包括多个这些细胞，提及“该细胞”时，包括对一个或多个细胞的指代以 及本领域技术人员所知的其等同物，等等。

除非另有定义，本文所用所有技术和科学术语与本公开内容所属技术领域 的一般技术人员通常的理解具有相同的含义。下文描述了示例性方法和材料， 尽管在本文公开的方法和组合物的实施中可以使用与本文描述的类似或等同的 任何方法和试剂。

本文提及的所有出版物均出于描述和披露方法的目的而完整地纳入本文 中，所述方法描述于所述出版物中并且可能用于本申请的说明书中。提供上文 以及在本说明书全文中讨论的出版物仅仅是因为它们的公开内容早于本申请的 提交日。任何本文的内容都不应解释为承认本发明的发明人不能由于更早的公 开而享有早于这些公开内容的日期。而且，对于在一篇或多篇出版物中出现的 与在本公开内容中已明确定义的术语类似或相同的任何术语，在所有方面均以 本公开内容中明确提供的术语定义为准。

黑色素瘤细胞对化疗有高度抗性，导致对化疗剂给药的响应率低(La Porta  CA.,Curr Cancer Drug Targets 9:391-7(2009))。此外，黑色素瘤细胞是常见的， 代表了皮肤癌和手术的一个主要原因。

微小RNA(miRNA)是新出现的一类潜在的癌症生物标记物或治疗靶标。 miRNA是被认为调节>90％的人类基因的非蛋白编码序列(Miranda et al.,Cell 126:1203-17(2006))。已在多种癌症中鉴定到miRNA表达的反常，并且越来越 多的数据表明一些miRNA可以发挥致癌基因或肿瘤抑制子基因的功能(Volinia  et al.Proc Natl Acad Sci U S A 103:2257-61(2006)；Porkka et al.,Cancer Res 67:6130-5(2007))。miRNA以组织特异性方式表达，可在细胞增殖、凋亡、和分 化中起到重要作用(Sempere et al.,Genome Biol 5:R13(2004)；和Bartel DP. Cell 116:281-97(2004))。致癌性miRNA的失活或肿瘤抑制miRNA的恢复可能 对癌症治疗具有极大的潜能(Medina et al.,Nature 467:86-90；Obad et al.Nat  Genet 43:371-8；Saito et al.,Cancer Cell 9:435-43(2006)；Lujambio et al. Cancer Res 67:1424-9(2007)；以及Lujambio et al.Proc Natl Acad Sci U S A 105:13556-61(2008))。此外，正评估miRNA作为可能的生物标记辅助不同的癌 症包括黑色素瘤的诊断和预测(Yi et al.,Cell Death Differ 17:229-35(2010)；和 Bartels et al.,Clin Chem 55:623-31(2009))。迄今为止，几乎没有在人黑色素瘤样 品上进行miRNA表达谱的分析，且已经发现一些候选的miRNA在黑色素瘤的 进展中具有推定的作用(Mueller et al.,Br J Cancer 101:551-6(2009)；Bemis et  al.Cancer Res 68:1362-8(2008)；Felicetti et al.Cancer Res 68:2745-54(2008)； Segura et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 106:1814-9(2009)；和Dar et al.,J Biol  Chem 286:16606-14(2011))。

最近，已表明肿瘤抑制性miRNA被CpG位点的DNA超甲基化灭活(Chuang  et al.,Pediatr Res 61:24R-9R(2007))。肿瘤的DNA甲基化谱已被用于定义肿瘤类 型、临床预后和对治疗的响应(Esteller M.,N Engl J Med 358:1148-59(2008)； Rodriguez-Paredes et al.,Nat Med 17:330-9)。miRNA的表观遗传(epigenetic)沉 默可能参与侵袭性和转移性表型的获得(Lujambio et al.,Cell Cycle 8:377-82 (2009))。虽然对于各种miRNA在癌症中的作用的证据越来越多，现有的关于 miRNA在黑色素瘤中的谱系(repertoire)和功能的信息非常有限，并且几乎没 有鉴定到黑色素瘤中miRNA的靶标。几个研究已通过微阵列表达谱评估了这种 癌症类型中多种miRNA的水平或者研究了所选择的miRNA在这种癌症类型中 的作用机制(Gaur et al.,Cancer Res 67:2456-68(2007)；Philippidou et al., Cancer Res(2010)；和Segura et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 106:1814-9 (2009))。例如，已表明miR-221和miR-222通过调控p27表达而参与黑色素瘤 进展(Felicetti et al.,Cancer Res 68:2745-54(2008))。miR-182的异常表达通过抑 制FOXO3和小眼球相关转录因子而促进黑色素瘤迁移(Segura et al.,Proc Natl  Acad Sci U S A 106:1814-9(2009))。已显示miR-532-3p在皮肤黑色素瘤中调控 RUNX3(Kitago et al.,Clin Cancer Res 15:2988-94(2009))；miR-193调控Mcl-1 (Chen et al.,Am J Pathol 179:2162-8(2011))；miRNA-137在黑色素瘤中靶向 MITF(Bemis et al.,Cancer Res 68:1362-8(2008))。报告了miR-205在黑色素瘤生 长的抑制和衰老诱导中的作用(Dar et al.,J Biol Chem 286:16606-14(2011))。

已利用微阵列筛选报告了miR-18b在某些癌症中差异性表达，但是缺乏在 肿瘤生成中的功能性作用，并且其作用靶标还有待确定(Kim et al., Histopathology 57:734-43(2010))。本公开内容提供了对miR-18b的表征，包括鉴 定其表达被沉默的机制并证明其在黑色素瘤中作为肿瘤抑制子的功能性作用。 在本文所公开的研究中，发现相对于在痣中，miR-18b在黑色素瘤中被下调，并 且相对于正常黑色素细胞，miR-18b在黑色素瘤细胞系中被下调。在一个具体实 施方式中，通过测量来自受试对象的癌细胞中miR-18b表达的水平，能够预测 该受试对象的存活率，从而较低的miR-18b表达水平与受试对象较低的存活率 相关。

本公开内容提供了，DNA甲基化是导致黑色素瘤中miR-18b表达抑制的重 要分子机制。越来越多的证据表明了通过近端CpG岛的DNA甲基化介导的 miRNA下调的作用，本公开内容又向此添加了证据(Saito et al.,Cancer Cell 9:435-43(2006)；Kozaki et al.,Cancer Res 68:2094-105(2008)；Iorio et al., Biochim Biophys Acta 1799:694-701；和Toyota et al.,Cancer Res 68:4123-32 (2008))。异常DNA甲基化和组氨酸修饰一起发挥作用，在人类癌症中沉默多种 肿瘤抑制子基因(Nakagawa et al.,J Urol 173:1767-71(2005)；和Kristeleit et al., Expert Opin Emerg Drugs 9:135-54(2004))。此外，组氨酸赖氨酸残基的超乙酰化 促进基因表达的转录活化和诱导(Kristeleit et al.,Expert Opin Emerg Drugs 9: 135-54(2004)；和Archer et al.,Curr Opin Genet Dev 9:171-4(1999))。本文提供 的研究表明，黑色素瘤细胞系中miR-18b的过表达导致乙酰H3、乙酰H4、2H3K4 的富集增加，这指示活性基因表达，而阻抑性的染色质修饰(2H3K9和3H3K4) 被抑制。本文提供的另外的研究证明，miR-18b在其上游区域有特别的CpG岛， 这些岛被超甲级化，导致miR-18b通过肿瘤特异性DNA超甲基化被沉默。

理解miRNA功能的一个很大的障碍是相对缺乏的经实验验证的靶标。为了 确定miR-18b的效应子，电脑(in-silico)算法和功能分析鉴定MDM2为靶标。 本文示出的结果表明了在若干黑色素瘤细胞系中miR-18b表达和MDM2表达之 间的负相关。发现miR-18b直接靶向MDM2的3’UTR。此外，发现miR-18b过 表达后MDM2蛋白水平被显著下调，表明通过靶向MDM2的3’UTR而对MDM2 进行转录后调节。已表明MDM2在黑色素瘤进展中被过表达(Polsky et al.,J  Natl Cancer Inst 94:1803-6(2002)),并且可能通过其结合于p53(以促进p53降 解)和通过其刺激E2F1/DP1转录复合物的能力而诱导细胞转化。此外，本文示 出的研究表明，miR-18b过表达后MDM2的下调伴随着p53的活化。

p53有很强的肿瘤抑制子活性，在大多数肿瘤中通过点突变被灭活。对黑色 素瘤中p53突变的描述非常少，在这一点上黑色素瘤在人类实体瘤中是相对比 较特别的(Sparrow et al.,Melanoma Res 5:93-100(1995))。p53也可通过MDM2 的过表达或p14^ARF和p16^INK4a的缺失或失活而被灭活(Toledo et al.,Nat Rev  Cancer 6:909-23(2006))。miR-18b过表达后p14^ARF的表达没有改变，强调了 miR-18b抑制MDM2和活化p53的直接作用。本文提供的结果在相关方面首次 表明，miR-18b的缺失(通过超甲基化)是在黑色素瘤细胞中实现p53和p53 途径的抑制的一个重要可选机制。p53功能的再活化已被积极地研究作为癌症的 治疗方式(Martins et al.,Cell 127:1323-34(2006))。因此，一个实施方式中，本公 开内容提供了通过过表达miR-18b而在癌细胞中表达p53或增加p53表达的方 法和组合物。例如，一个实施方式中，如上所述，超甲基化降低了miR-18b，因 此可用抑制甲基化的物质来增加miR-18b表达和因此增加p53表达。在某个实 施方式中，可通过给予去甲基化剂从而在黑色素瘤细胞中抵消、阻碍、抑制或 阻抑miR-18b的肿瘤特异性DNA超甲基化来治疗患有黑色素瘤的受试对象。去 甲基化剂的例子包括但不限于胞苷衍生物，包括5-氮杂胞苷和5-氮杂脱氧胞苷； 以及普鲁卡因胺和衍生物，如普鲁卡因。

此外，本公开内容表明，miR-18b过表达导致PUMA(一种促凋亡蛋白) 以及细胞周期调节子p21的上调，抑制抗凋亡蛋白BCL-2和BCL-XL的表达。 基因表达中的这些变化伴随着黑色素瘤细胞中对细胞周期、集落形成的显著抑 制以及对凋亡的诱导，这个观察结果在两个不同的人类黑色素瘤细胞系中得到 了证实。miR-18b在1205-Lu细胞中稳定过表达之后，这些效果得到了进一步证 实。此外，本文提供的体内研究表明，miR-18b过表达之后小鼠中皮下肿瘤细胞 生长大大降低。这些发现将miR-18b鉴定为黑色素瘤中新的肿瘤抑制子。在某 个实施方式中，可通过过表达miR-18b激活p53和凋亡级联。本文公开的研究 表明，miR-18b过表达显著抑制了黑色素瘤细胞系的迁移和侵袭能力。

一个实施方式中，可通过增强miR-18b表达治疗患有黑色素瘤的受试对象。 一个进一步的实施方式中，可通过增强miR-18b表达并联合给予一种或多种额 外的治疗剂来治疗患有癌症如黑色素瘤的受试对象。治疗剂的例子包括但不限 于抗癌剂，去甲基化剂，烷化剂，抗代谢剂，有丝分裂抑制剂，酪氨酸激酶抑 制剂，拓扑异构酶抑制剂，癌症免疫疗法的单克隆抗体，抗肿瘤抗生素剂，以 及靶向抗癌剂。一个具体实施方式中，可通过增强miR-18b表达与给予顺铂的 组合来治疗患有癌症如黑色素瘤的受试对象。另一实施方式中，可通过增强 miR-18b表达与给予BRAF抑制剂如例如达拉非尼(dabrafenib)的组合来治疗 患有癌症如黑色素瘤的受试对象。如本文所用，"BRAF抑制剂"指靶向B-RAF 的与癌症有关的获得性突变如sup.V600EB-RAF的药物。此类B-RAF抑制剂的 代表性例子包括PLX4032/威罗菲尼(vemurafenib)，或其他类似药物如 GSK2118436/达拉非尼。

已表明上皮-至-间充质-转变(EMT)在上皮细胞瘤以及黑色素瘤的侵袭和转 移中起重要作用(Alonso et al.,Cancer Res 67:3450-60(2007))。上皮-至-间充质- 转变调控子(EMTR)如Snail、Slug、和Twist对该过程至关重要，该过程主要由 标记物如E-钙粘蛋白的消失或缺失以及标记物如波形蛋白、纤连蛋白和N-钙粘 蛋白的同时活化来协调。本文示出的研究表明，miR-18b的过表达导致黑色素瘤 细胞中波形蛋白、slug、和N-钙粘蛋白的抑制并同时恢复E-钙粘蛋白水平。这 些研究表明miR-18b可介导EMT，这代表了miR-18b影响黑色素瘤迁移和侵袭 的一种可能机制。本文公开的研究表明，miR-18b过表达显著抑制了黑色素瘤细 胞系的迁移和侵袭能力。

另一实施方式中，本公开内容提供了治疗癌症的方法，所述方法包括给予 有效量的增强miR-18b表达的物质。

术语“治疗”，如本文所用，指缓解与疾病或病况例如黑色素瘤相关的症状， 包括防止或延迟疾病症状的发作，和/或减轻疾病或病况的症状的严重性或频率。 术语“受试对象”和“个体”在本文中定义为包括动物如哺乳动物，包括但不 限于，灵长类动物，牛，绵羊，山羊，马，狗，猫，兔，豚鼠，大鼠，小鼠或 其他牛科、绵羊、马科、犬科、猫科、啮齿目或鼠科物种。一优选实施方式中， 哺乳动物是人。

如本文所用，“有效量”的miR-18b是足以在患有癌症的受试对象中抑制 癌细胞增殖或侵袭的量。本领域技术人员能通过考虑诸如以下因素而容易地确 定要给予给定受试对象的miR-18b基因产物的有效量：受试对象的身材和体重； 疾病渗透的程度；受试对象的年龄、健康和性别；给药途径；以及给药是区域 性的还是全身性的。

可以用包含含有miR-18b的多核苷酸和/或增加miR-18b表达的物质的组合 物治疗的癌症包括未血管化的肿瘤、或还未显著血管化的肿瘤、以及血管化的 肿瘤。癌症可包括非实体瘤(白血病和淋巴瘤)或者可以是实体瘤。

用本公开内容的所述物质或组合物治疗的癌症的类型包括上皮细胞癌 (carcinoma)，母细胞瘤，和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤，良性和恶 性肿瘤，和恶性肿瘤如肉瘤、上皮细胞癌和黑色素瘤。成人肿瘤/癌症和类似地 儿科肿瘤/癌症都可以根据本文公开的方法进行治疗。

可治疗的肿瘤/癌症的例子包括卵巢癌，乳腺癌(包括HER2+和转移性)， 结肠直肠癌，结肠癌，肾癌，直肠癌，胰腺癌，前列腺癌，胃癌，胃肠道癌， 胃(gastric)癌，胃(stomach)癌，食道癌，胆管癌，肺癌(包括小细胞和非 小细胞肺肿瘤；肺的腺癌和肺的鳞状细胞癌)，肝癌，表皮样肿瘤，鳞状肿瘤 如头颈部肿瘤，上皮鳞状细胞癌，甲状腺癌，子宫颈癌，消化系统神经内分泌 肿瘤，神经内分泌肿瘤，腹膜癌，肝细胞癌，肝母细胞瘤，HPCR，成胶质细 胞瘤，膀胱癌，肝细胞瘤，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌或肾脏癌， 骨癌，软组织肉瘤(包括胚胎和肺泡横纹肌肉瘤，GIST，肺泡软组织肉瘤和透 明细胞肉瘤)，胆管癌，胆汁癌，胆囊癌，骨髓瘤，外阴癌，肝癌，肛门癌， 阴茎癌，视网膜癌，造血癌症，雄激素依赖性肿瘤，雄激素非依赖性肿瘤。其 他的例子包括卡波氏肉瘤，滑膜肉瘤，血管活性肠肽分泌性肿瘤，CNS肿瘤， 神经母细胞瘤，毛细血管母细胞瘤，脑膜瘤，和脑转移瘤，黑色素瘤，横纹肌 肉瘤，胶质母细胞瘤，包括多形性胶质母细胞瘤，EMB，RMS，ALV，髓母细 胞瘤，室管膜瘤，肾母细胞癌，尤文癌，骨肉瘤，PNT，横纹肌瘤，横纹肌肉 瘤，视网膜母细胞瘤，肾上腺皮质癌，肾上腺癌，和平滑肌肉瘤。在一具体实 施方式中，待治疗的癌症是黑色素瘤。

一具体实施方式中，本公开内容提供了治疗受试对象的癌症如黑色素瘤 的方法，所述方法包括给予有效量的增强miR-18b表达的物质。另一实施方式 中，所述物质是来自聚合酶II或III启动子的shRNA。另一实施方式中，所述物 质是双链miRNA模拟物(mimic)。miRNA模拟物技术是本领域公知的。参见 例如，Wang,Z.,2009,miRNA mimic technology，MicroRNA Interference  Technologies,93-100页，Springer-Link出版社。另一实施方式中，所述物质是基 于寡核苷酸的pre-miR-18b药物。

以编码miRNA如miR-18b的多核苷酸为特征的多核苷酸疗法是在受试对象 中增强所述miRNA的转录本数目或表达水平的另一个治疗途径。可将编码 miR-18b的表达载体递送到受试对象的细胞中治疗或预防癌症。核酸以它们能够 被吸收并被有利地表达的形式递送到受试对象的细胞中，从而可达到治疗有效 的水平。能够表达miR-18b的表达载体可通过商业途径从多个供应商获得。

递送含有miR-18b的多核苷酸和/或增加miR-18b表达的物质至细胞的方法 包括使用递送系统，如脂质体、聚合物、微球、基因治疗载体、和裸DNA载体。

转导病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒、慢病毒和腺伴随病毒)载体可用 于体细胞基因治疗，尤其是由于它们的高感染效率以及稳定的整合和表达(参 见，例如，Cayouette et al.,Human Gene Therapy 8:423-430(1997)；Kido et al., Current Eye Research 15:833-844(1996)；Bloomer et al.,Journal of Virology 71:6641-6649(1997)；Naldini et al.,Science 272:263-267(1996)；和Miyoshi et  al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:10319(1997))。例如，编码miR-18b的多核苷 酸可被克隆到逆转录病毒载体中，其表达可被内源启动子、逆转录病毒长末端 重复、或对感兴趣的目标细胞类型特异性的启动子驱动。可用的其他病毒载体 包括，例如，牛痘病毒、牛乳头状瘤病毒、或疱疹病毒，如Epstein-Barr病毒(还 参见，例如，以下的载体：Miller,Human Gene Therapy 15-14,(1990)；Friedman, Science 244:1275-1281(1989)；Eglitis et al.,BioTechniques 6:608-614(1988)； Tolstoshev et al.,Current Opinion in Biotechnology 1:55-61(1990)；Sharp,The  Lancet 337:1277-1278(1991)；Cornetta et al.,Nucleic Acid Research and Molecular  Biology 36(31):1-322(1987)；Anderson,Science 226:401-409(1984)；Moen,Blood  Cells 17:407-416(1991)；Miller et al.,Biotechnology 7:980-990(1989)；Le Gal La  Salle et al.,Science 259:988-990(1993)；以及Johnson,Chest 107:77S-83S (1995))。逆转录病毒载体尤其得到了很好的开发并已用于临床环境中(Rosenberg  et al.,N.Engl.J.Med 323:370(1990)；Anderson et al.,美国专利号5,399,346)。非 病毒方式也可用于将基于miR-18b的治疗剂引入到诊断为带有瘤(neoplasia)的 患者的细胞中。例如，可通过以下方式将含有miR-18b的多核苷酸引入到细胞 中：在阳离子脂质的存在下给予核酸(Feigner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 84:7413(1987)；Ono et al.,Neuroscience Letters 17:259(1990)；Brigham et al.,Am. J.Med.Sci.298:278(1989)；和Staubinger et al.,Methods in Enzymology 101:512 (1983))；asialoorosoinucoid-聚赖氨酸缀合(Wu et al.Journal of Biological  Chemistry 263:14621(1988)；Wu et al.,Journal of Biological Chemistry 264:16985 (1989)；或者通过在手术条件下显微注射(Wolff et al.,Science 247:1465(1990)。含 有miR-18b的多核苷酸和/或增强miR-18b表达的物质可与脂质体和鱼精蛋白组 合给药。

也可用涉及体外转染的非病毒方式来实现基因转移。这些方法包括使用磷 酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔、和原生质体融合。脂质体也潜在地有利地用于递 送DNA进入细胞中。用于多核苷酸治疗方法中的miR-18b表达可受任意合适的 启动子的指导(例如，人巨细胞病毒(CMV)，猿猴病毒40(SV40)或金属硫 蛋白启动子)，由任意合适的哺乳动物调控元件调控。例如，如果需要的话，可 用已知优先指导在特定细胞类型中的基因表达的增强子来指导核酸表达。所用 的增强子包括但不限于表征为组织-特异性或细胞-特异性增强子的那些增强子。 对于任何特定受试对象，应根据个体需要和给予组合物或监督组合物给药的人 的专业判断而随时间调整具体给药方案。

另一实施方式中，本公开内容提供了用于治疗癌症如黑色素瘤的治疗组合 物，所述治疗组合物包含含有miR-18b的增加miR-18b表达的多核苷酸。另一 实施方式中，本公开内容提供了含有增强miR-18b表达的物质的药物组合物。 此类物质的例子包括但不限于阻止或抑制miR-18b甲基化的化合物。

含有miR-18b的多核苷酸和/或增加miR-18b表达的物质可作为药物组合物 的一部分来给药。药物组合物优选是无菌的，并在适于给予受试对象的单位重 量或体积中包含治疗有效量的含有miR-18b的多核苷酸分子和/或增加miR-18b 表达的物质。

含有miR-18b的治疗性多核苷酸分子和/或增加miR-18b表达的物质可以与 药学上可接受的载体一起给药，以单位剂型的形式。可用传统的药学实践来提 供稳定的制剂或组合物以将所述化合物给予患有癌症的患者。

本文所用载体包括药学上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂，这些载体、 赋形剂、或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对所暴露的细胞或哺乳动物是无毒 的。通常生理学上可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学上可接受的载体的实 例包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸； 低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋 白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、 精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖，和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或 糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐的抗衡离子如钠；和 /或非离子表面活性剂，如TWEEN^TM、聚乙二醇(PEG)、和PLURONICS^TM。

含有miR-18b的多核苷酸和/或增加miR-18b表达的物质也可分别在胶体递 送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子、和纳米胶囊)中或 者在粗乳液(macroemulsion)中被包裹在例如通过界面聚合而制备的微胶囊中， 所述微胶囊例如分别是羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微 胶囊。用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可由通过无菌过滤膜过滤而容易 地实现。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括固态疏水性聚合 物的半透性基质，所述固态疏水性聚合物的半透性基质包含含有miR-18b的多 核苷酸和/或增强miR-18b表达的物质，所述基质是成形制品例如膜或微胶囊的 形式。持续释放基质的例子包括聚酯，水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯 酸酯)，或聚(乙烯醇))，聚交酯(美国专利号3,773,919)，L-谷氨酸和γ-乙 基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共 聚物诸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可 注射微球)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚 合物能够使分子释放100天以上，但某些水凝胶释放分子持续较短的时间。

另一实施方式中，包含含有miR-18b的多核苷酸和/或增加miR-18b表达的 物质的药物组合物与其他治疗剂联合给药。提及给予其他治疗剂时的“联合” 时，是指可在包含含有miR-18b的多核苷酸和/或增加miR-18b表达的物质的药 物组合物之前、同时、或之后给予治疗剂。

一具体实施方式中，包含含有miR-18b的多核苷酸和/或增加miR-18b表达 的物质的药物组合物与放疗、化疗、光动力疗法、手术或其他免疫疗法联合给 予患有增生性疾病如癌症或肿瘤的患者。一个实例中，本公开内容的药物组合 物与化疗、放疗、或化疗和放疗二者联合给予受试对象。本公开内容的药物组 合物可与一种或多种其他预防剂或治疗剂联合给药，所述预防剂或治疗剂包括 但不限于细胞毒试剂，化疗剂，细胞因子，生长抑制剂，抗激素剂，激酶抑制 剂，抗血管生成剂，保心药，免疫刺激剂，免疫抑制剂，血液细胞增殖促进剂， 血管生成抑制剂，蛋白酪氨酸激酶(PTK)抑制剂，抗癌抗体，或其他治疗剂。

化疗剂的例子包括但不限于，铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；铂；蛋白 如精氨酸脱亚胺酶和天冬酰胺酶；烷化剂如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺 (CYTOXAN^TM)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌 泊舒凡(piposulfan)；雄激素，如7β,17α-二甲睾酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮 (dromostanolone propionate)，环硫雄醇(epitiostanol)，美雄烷(mepitiostane)，睾 内酯(testolactone)；抗肾上腺素药如氨鲁米特(aminoglutethimide)，米托坦 (mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；抗雄激素药如氟他胺(flutamide)，尼 鲁米特(nilutamide)，比卡鲁胺(bicalutamide)，亮丙瑞林(leuprolide)，和 戈舍瑞林(goserelin)；抗生素如阿克拉霉素(aclacinomysins)，放线菌素， authramycin，重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C(cactinomycin)，加利车霉 素(calicheamicin)，carabicin，caminomycin，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素 (chromomycin)，更生霉素，柔红霉素，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5- 氧代-L-正亮氨酸，多柔比星，表阿霉素，依索比星(esorubicin)，伊达比星 (idarubicin)，麻西罗霉素(marcellomycin)，丝裂霉素，霉酚酸，诺加霉素 (nogalamycin)，olivomycins，平阳霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤 霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素，链脲 菌素，结核菌素，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星 (zorubicin)；抗雌激素药包括例如他莫昔芬，雷洛昔芬，芳香酶抑制性4(5)- 咪唑，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，雷洛昔芬(keoxifene)，LY 117018，奥那司酮(onapristone)，和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；抗代 谢药，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)， 甲氨蝶呤，蝶罗呤，三甲曲沙(trimetrexate)；氮丙啶，如苄替哌(benzodopa)， 卡波醌(carboquone)，四甲尿烷亚胺(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；氮 杂环丙烷类和甲基蜜胺类包括六甲蜜胺，三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑 硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；叶酸补充剂，如亚叶酸；氮芥类如苯丁酸氮芥，萘 氮芥，cholophosphamide，雌莫司汀(estramustine)，异环磷酰胺，氮芥 (mechlorethamine)，盐酸氧氮芥，美法仑(melphalan)，新氮芥 (novembichin)，苯芥胆甾醇(phenesterine)，松龙苯芥(prednimustine)， 氯乙环磷酰胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亚硝基脲如卡莫司汀 (carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司 汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；嘌呤类似 物如氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤，硫唑嘌呤胺(thiamiprine)，硫鸟 嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿 苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷(cytarabine)，二脱氧尿苷，去氧氟尿苷， 依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷，5-FU；紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOL^TM, Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)和多西他赛(docetaxel) (TAXOTERE^TM,Rhne-Poulenc Rorer,Antony,France)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；胸苷酸合成酶抑制剂(如Tomudex)；另外的化疗药物包括醋葡醛内酯 (aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸 (aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)； edatraxate；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；二氟甲 基鸟氨酸(DMFO)；elformithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；乙环氧啶 (etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；诺尼达明(lonidamine)； 米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)； 二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)； 吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙肼；甲基苄肼 (procarbazine)；PSK^TM；雷佐生(razoxane)；sizofuran；螺环锗 (spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三氮杂环丙烷苯醌 (triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡 巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷 (pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷("Ara-C")；环磷酰胺；塞替派；苯丁酸 氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；依托泊苷 (etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C；米托蒽醌 (mitoxantrone)；长春新碱；长春瑞滨(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；诺肖林 (novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊 班膦酸钠(ibandronate)；CPT-11；维甲酸；esperamicins；和卡培他滨 (capecitabine)。

可以在受试对象被确定患有癌症或被怀疑患有癌症之后开始给予本文公开 的药物组合物。可使用任何合适的给药途径，例如，给药可以是肠胃外、静脉 内、动脉内、皮下、肿瘤内、肌肉内、颅内、眶内、眼部、心室内、肝内、囊 内、鞘内、脑池内、腹膜内、鼻内、气雾剂、栓剂、或口服给药。例如，治疗 制剂可以是液体溶液或悬浮液的形式；对于口服给药，制剂可以是片剂或胶囊 的形式；对于鼻内制剂，可以是粉末、滴鼻剂或气雾剂的形式。

用于制剂的本领域公知方法可见于，例如，"Remington:The Science and  Practice of Pharmacy"Ed.A.R.Gennaro,Lippincourt Williams&Wilkins, Philadelphia,Pa.,2000。肠胃外给药的制剂可例如含有赋形剂，无菌水，或盐 水，聚亚烷基二醇如聚乙二醇，植物来源的油，或氢化萘。生物相容的、可生 物降解的交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以 用于控制所述化合物的释放。其它可能对于抑制性核酸分子有用的肠胃外递送 系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒，渗透泵，可植入的输注系统，和脂质 体。用于吸入的制剂可以含有赋形剂，例如乳糖，或可以是含有例如聚氧乙烯 -9-月桂基醚、甘氨胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或者可以是用于以滴鼻剂形 式给药的油性溶液，或作为凝胶。

除了miR-18b表达和过表达的治疗性方面之外，miR-18b也可用作癌症治疗 如黑色素瘤的诊断和预测标记物。在某个实施方式中，从来自一个或多个受试 对象的一个或多个生物学样品中确定miR-18b的表达水平。所述生物学样品可 以是组织、血液、或本领域技术人员所知的其他生物学样品。一个实例中，可 根据本领域技术人员知晓的方法从受试对象中取出组织样品如组织活检。另一 个实例中，可从受试对象中取出血液样品，并分离血液样品中的各个成分以用 标准技术提取核酸或蛋白。

一具体实施方式中，从一个或多个受试对象的一个或多个良性痣获得一个 或多个对照样品。痣的例子包括但不限于，复合痣，Spitz痣，晕痣，交界痣， 假黑色素瘤(pseudomelanoma)，蓝痣，先天性黑色素细胞痣，气球细胞痣，发 育不良痣/发育不良痣综合征，肢端痣，Becker’s痣，良性黑色素细胞痣、和斑 痣。测量对照样品中miR-18b的表达水平，在一个实施方式中，miR-18b的平均 表达水平作为miR-18b的对照表达水平。一具体实施方式中，一个或多个对照 样品和测试样品获自同一受试对象。在另一实施方式中，一个或多个对照样品 来自多个受试对象，所述多个受试对象可包括或不包括测试受试对象。

可定量miRNA的表达水平，将该水平与对照值比较。例如，可测量测试样 品中miRNA的表达水平，并确定所述水平。因此，可确定miRNA水平是否小 于对照样品中miRNA的表达水平(即，miRNA基因产物的表达是“低表达 (under-expressed)”)。如本文所用，当来自受试对象的测试样品中miRNA表 达的量小于对照样品中miRNA表达水平的量时，miRNA的表达是“低表达”。 另一实施方式中，测试样品中miRNA的表达水平可大于对照样品中miRNA的 表达水平(即miR基因产物的表达是“过表达”)。如本文所用，当来自受试对 象的测试样品中miRNA表达的量大于对照样品中miRNA表达水平的量时， miRNA的表达是“过表达”。在另一实施方式中，测试样品中miRNA的表达水 平等于对照样品中miRNA的表达水平。

可用适于检测生物学样品中RNA表达水平的任何技术来测量样品中 miRNA的水平。用于检测来自生物学样品的细胞中的RNA表达水平的合适技 术是本领域技术人员公知的。这些技术的例子包括但不限于Northern印迹分析、 RT-PCR、微阵列、原位杂交。一具体实施方式中，用高通量系统例如微阵列来 测量多个基因的表达水平。

某个实施方式中，用Northern印迹分析来检测miRNA水平。例如，可通过 在核酸提取缓冲液的存在下匀浆、然后离心，从细胞中纯化总细胞RNA。沉淀 核酸，用DNA酶处理并沉淀来除去DNA。然后根据标准技术在琼脂糖凝胶上 凝胶电泳来分离RNA分子，并转移至硝酸纤维素滤膜。然后通过加热使RNA 固定在滤膜上。使用与测试的RNA互补的适当地标记的DNA或RNA探针来实 现对具体RNA的检测和定量。

可由给定miRNA的核酸序列来产生对于该miRNA的Northern印迹杂交合 适的探针。制备标记的DNA和RNA探针的方法以及将探针与靶核苷酸序列杂 交的条件描述于《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory  Manual)，J.Sambrook et al.,eds.,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989,第10章和11章。

一个实例中，可用例如下述物质来标记核酸探针：放射性核苷酸，如³H,³²P, ³³P,¹⁴C或³⁵S；重金属；或能够用作标记的配体的特异性结合对成员的配体(例 如，生物素、抗生物素蛋白或抗体)，荧光分子，化学发光分子，或酶。探针 可以通过切口平移、随机引物法、或本领域技术人员所知的其他方法以高比活 性被标记。例如，通过根据切口平移方法用高放射性的核苷酸替换预先存在的 核苷酸，已知可制备比活性远超过10⁸cpm/微克的³²P-标记的核酸探针。

然后可通过将杂交的滤膜暴露于照相胶片来进行杂交的放射自显影检测。 被杂交的滤膜曝光的照相胶片的光密度扫描提供了miRNA转录本水平的精确测 量。另一实施方式中，miRNA基因转录本水平可以通过计算机化成像系统如可 得自Amersham Biosciences,Piscataway,N.J.的Molecular Dynamics 400-B 2D磷 光影像扫描分析仪(Phosphorimager)来量化。

另一实施方式中，随机引物法可用于将类似物例如dTTP类似物5-(N-(N-生 物素基-ε-氨基己酰基)-3-氨基烯丙基)脱氧尿苷三磷酸掺入探针分子。生物素 化的探针寡核苷酸可以通过与偶联到荧光染料或产生颜色反应的酶的生物素结 合蛋白如抗生物素蛋白、链霉亲和素、和抗体(例如，抗生物素抗体)反应来 进行检测。

进一步的实施方式中，可用原位杂交的技术来实现对miRNA表达水平的确 定。该技术比Northern印迹技术需要更少的细胞，并涉及将完整的细胞沉积到 显微镜盖玻片上并用含有放射性标记的核酸或者以其他方式标记的核酸(例如, cDNA或RNA)探针的溶液来探测细胞的核酸含量。该技术尤其适合分析来自受 试对象的组织活检样品。原位杂交技术的实践更详细地描述于美国专利号 5,427,916,其公开内容通过引用并入本文。

细胞中miRNA基因转录本的相对数目还可通过将miRNA基因转录本反转 录、然后通过聚合酶链式反应扩增反转录的转录本(RT-PCR)来确定。可以相比 较于内标例如同一样品中存在的“管家”基因的mRNA水平来定量miRNA基 因转录本的水平。用作内标的合适“管家”基因包括例如肌球蛋白或甘油醛-3- 磷酸脱氢酶(G3PDH)。用于定量RT-PCR的方法及其变化形式在本领域技术人 员的能力范围内。另一实施方式中，使用高通量颈环实时定量聚合酶链式反应 (RT-qPCR)来检测miRNA表达。参见Mestdagh et al.,Nucleic Acid Research 36(21) (2008))。

一些情况中，可能希望同时确定样品中多种不同miRNA基因产物的表达水 平。其他情况中，可能希望确定与癌症相关的所有已知miRNA的转录本的表达 水平。一个实施方式中，评估几百种miRNA的癌症特异性表达水平需要大量的 总RNA(例如,每个Northern印迹需要20μg)和需要放射性同位素的放射自显影 技术。另一实施方式中，可以构建微芯片(即微阵列)形式的寡文库，该寡文 库含有对一组miRNA基因具有特异性的一组探针寡脱氧核苷酸。利用这样的微 阵列，可通过将RNA反转录以产生一组靶寡脱氧核苷酸并将它们与微阵列上的 探针寡脱氧核苷酸杂交以产生杂交谱或表达谱，从而确定生物学样品中多种 miRNA的表达水平。然后可将测试样品的杂交谱与对照样品的预先确定的表达 水平比较以确定哪种miRNA在癌细胞中具有改变的表达水平。如本文所用，“探 针寡核苷酸”或“探针寡脱氧核苷酸”指能够与靶寡核苷酸杂交的寡核苷酸。“靶 寡核苷酸”或“靶寡脱氧核苷酸”指待检测的分子(例如，通过杂交)。“miRNA- 特异性探针寡核苷酸”或“对miRNA具有特异性的探针寡核苷酸”指探针寡核 苷酸具有经选择与特定miRNA基因产物杂交或与所述特定miRNA基因产物的 反转录本杂交的序列。

特定样品的“表达谱”或“杂交谱”本质上是该样品的状态的指纹图谱； 虽然两种状态可能具有类似表达的任何特定基因，但同时评估若干个基因允许 产生对细胞的状态独特的基因表达谱。即，可将正常组织与癌组织区分开来， 在癌组织内，可确定不同的预后状态(例如，好或差的长期存活可能性)。通过 比较不同状态中的癌组织的表达谱，获得关于在这些状态中的每一个状态中哪 个基因重要(包括基因上调和下调两者)的信息。对在癌组织或正常组织中差 异表达的序列的鉴定以及导致不同预后结果的差异表达，允许以多种方式利用 这一信息。例如，可评估特定的治疗方案(例如，以确定化疗药在特定患者中 是否发挥改善长期预后的作用)。类似地，可通过比较患者样品与已知表达谱来 进行诊断或对诊断加以确认。而且，这些基因表达谱(或个体基因)允许筛选 抑制癌症表达谱或将较差预后谱转变为较好预后谱的药物候选物。

可从由已知miRNA序列包括miR-18b产生的基因特异性寡核苷酸探针来制 备微阵列。一个实施方式中，阵列含有针对各miRNA的两个不同的寡核苷酸探 针，一个含有活性的、成熟序列，另一个对miRNA的前体具有特异性。阵列可 还含有对照，如与人直系同源物相差仅几个碱基的一个或多个小鼠序列，其可 用作杂交严格条件的对照。也可将来自两个物种的tRNA印刷在微芯片上，为特 异性杂交提供内部的、相对稳定的阳性对照。也可在微芯片上包括用于非特异 性杂交的一个或多个合适对照。为该目的，基于与任何已知miRNA没有任何同 源性来选择序列。

可用本领域已知技术制作微阵列。例如，合适长度的探针寡核苷酸在位置 C6被5'-胺修饰并用可商购的微阵列系统例如GENEMACHINE、OMNIGRID 100 MICROARRAYER和AMERSHAM CODELINK活化的薄片上印刷。通过用标记 的引物反转录靶RNA来制备与靶RNA对应的标记的cDNA寡聚物。第一链合 成之后，将RNA/DNA杂合体变性以降解RNA模板。然后将如此制备的标记的 靶cDNA在杂交条件下(例如6x SSPE/30％甲醛)与微阵列芯片于25℃杂交 18小时，然后在0.75x TNT中37℃洗涤40分钟。在阵列上固定的探针DNA 识别出样品中互补靶cDNA的位置，发生杂交。标记的靶cDNA标示出阵列上 发生结合的确切位置，允许自动检测和定量。输出的结果由一系列杂交事件组 成，指示患者样品中特定cDNA序列的相对丰度，以及因此指示相应的互补 miRNA的相对丰度。根据一个实施方式，标记的cDNA寡聚物是由生物素标记 的引物制备的生物素标记的cDNA。然后通过使用例如 STREPTAVIDIN-ALEXA647缀合物直接检测含有生物素的转录本并用传统的扫 描方法扫描来处理微阵列。阵列上各点的图像密度与患者样品中相应miRNA的 丰度成比例。

除了用于具体miRNA的定量表达水平试验之外，还可使用含有与相当大部 分的miRNA组(miRNome)优选整个miRNA组相应的miRNA-特异性探针寡 核苷酸的微芯片来制作miRNA基因表达谱，用于分析miRNA表达模式。独特 的miRNA特征可与已建立的疾病标记物相关联或直接与疾病状态相关联。

根据本文描述的表达谱方法，将来自被怀疑患有癌症(例如，黑色素瘤) 的受试对象样品的总RNA定量反转录以提供与样品中的RNA互补的一组标记 的靶寡脱氧核苷酸。然后将靶脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的 微阵列杂交以提供样品的杂交谱。结果是代表样品中miRNA表达模式的样品杂 交谱。杂交谱包含来自样品中的靶寡脱氧核苷酸与微阵列中的miRNA-特异性探 针寡核苷酸的结合的信号。杂交谱可记录为存在或不存在结合(信号相对于零 信号)。更优选地，记录的杂交谱包括来自各杂交的信号强度。将该杂交谱与从 对照样品产生的杂交谱比较。信号的变化指示受试对象中的化疗响应。

测量miRNA基因表达的其他技术也在本领域技术人员的能力范围内，包括 用于测量RNA翻译和降解的速率的各种技术，包括RNA酶保护试验、核连缀 (Nuclear run-ons)、狭线印迹，等。

另一实施方式中，本公开内容提供了预测受试对象中癌症的存在情况的方 法。该方法包括以下步骤：确定来自受试对象的生物学样品中的miR-18b相对 于一个或多个对照样品的miR-18b表达是过表达还是低表达。一具体实施方式 中，与对照生物学样品相比较，受试对象生物学样品中miR-18b低表达的水平 指示受试对象样品是否是恶性的。进一步的实施方式中，所述恶性肿瘤是黑色 素瘤。

又另一实施方式中，本公开内容提供了确定受试对象中癌症进展的方法。 该方法包括步骤：在多个时间点测量取自患者的生物学样品中miR-18b的表达 水平，从而来自不同时间点的样品间miR-18b表达水平的变化指示受试对象癌 症的进展或受试对象自癌症的康复。一具体实施方式中，如果在较早和较晚时 间点之间miR-18b的低表达水平在增加(即，miR-18b水平在进一步下降或保持 相同)，指示受试对象的癌症正在向较晚阶段进展。另一个实施方式中，如果在 较早和较晚时间点之间miR-18b的低表达水平在下降(即，miR-18b水平在增 加)，指示受试对象的癌症在康复过程中。在进一步的实施方式中，所述癌症是 黑色素瘤。

在又另一实施方式中，本公开内容提供了确定患有癌症的受试对象的存活 率的方法。该方法包括步骤：在多个时间点测量取自患有癌症的患者的生物学 样品中miR-18b的表达水平，从而来自不同时间点的样品间miR-18b表达水平 的变化指示受试对象降低的或增加的存活率。一具体实施方式中，如果在较早 和较晚时间点之间miR-18b的低表达水平在增加，指示受试对象的存活率在下 降。在另一实施方式中，如果在较早和较晚时间点之间miR-18b的低表达水平 在下降，指示受试对象的存活率在改善。在进一步的实施方式中，所述癌症是 黑色素瘤。

另一实施方式中，本公开内容提供了用于确定受试对象患有癌症和/或癌症 进展的可能性的试剂盒，所述试剂盒包括：a)与miR-18b互补的寡核苷酸；和 b)任选地，用于在所述寡核苷酸和miR-18b之间形成杂交的试剂。另一实施方 式中，所述试剂盒任选地包括对于监测来自受试对象的生物学样品中的标记物 核酸分子水平的指导。另一实施方式中，试剂盒包含无菌容器，所述无菌容器 装有引物、探针、或其他检测试剂；此类容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、试 管、袋子、小袋，泡罩包装、或本领域所知的其它合适的容器形式。此类容器 可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔、或其他适于承纳核酸的材料构成。说明 书一般包括关于本文所述的引物或探针的使用及它们用于诊断癌症的信息。优 选地，试剂盒还包括本文所述的诊断试验中描述的任何一种或多种试剂。其他 实施方式中，说明书包括以下的至少一个：对引物或探针的描述；使用所附的 材料来诊断癌症的方法；注意事项；警告；适应症；临床或研究性研究；和/或 参考文献。这些说明可直接印刷在容器(如果有)上，或作为标签应用到容器 上，或作为容器中提供的或与容器一起提供的独立页、小册子、卡片、或文件 夹。

另一实施方式中，本公开内容提供了用于确定miR-18b表达水平的设备， 所述设备包含固体支持物，其中所述固体支持物的表面和与miR-18b互补的寡 核苷酸连接。一个实施方式中，所述设备是微阵列。固体支持物的例子包括但 不限于用于结合核酸的玻璃片或硝酸纤维素片。

以下实施例意在阐释而非限制本公开内容。虽然这些实施例是典型的可以 使用的，但也可以使用本领域技术人员所知的其他程序。

实施例

细胞培养物、质粒和转染.如Dar et al.,J Biol Chem 286:16606-14(2011)所 述获得并增殖DO4、WM3211、1205-Lu、C8161.9、WM278和Lox黑色素瘤细 胞系。从Lifeline细胞技术(Lifeline cell technology)购得正常人黑色素细胞(HEM) 并生长在LL-0027培养基(Lifeline cell technology,Walkersville MD)中。购得质 粒miRNASelect^TM pEP-miR空对照载体(pEP Null)、miRNASelect^TM  pEP-hsa-mir-18b表达载体(pEP miR-18b)(Cell Biolabs Inc,San Diego CA)。从 Applied Biosystems(Foster City,CA)购得针对hsa-miR-18b和阴性对照pre-miR (对照miR)的TaqMan探针。用溶解在二甲亚砜中的5-氮杂-2`-脱氧胞苷(5AZA) (Sigma Aldrich,St.Louis MO)处理亚汇合的细胞(60–70％汇合)。用载体处理的 细胞作为对照。根据生产商的程序用Lipofectamine-2000(Invitrogen Life  Technologies,Carlsbad,CA)进行瞬时转染。

从组织样品和细胞系中提取RNA、DNA和miRNA.用经机构审查委员会 批准的程序从黑色素瘤患者(n＝92)和良性痣(n＝48)获得样品。如先前在Dar et al., J Biol Chem 286:16606-14(2011)中所述提取RNA和miRNA。

定量实时PCR.如先前在Dar et al.,J Biol Chem 286:16606-14(2011)中所述 分别用TaqMan MicroRNA Assays和Gene Expression Assays(Applied Biosystems) 分析成熟miRNA和其他mRNA。

亚硫酸氢钠修饰和测序。在miR-18b基因上游的2.5kb区域内分析甲基化 状态。根据生产商的程序以及如先前在Majid et al.,Carcinogenesis 30:662-70 (2009)中所述用Epi-Tect Bisulfite试剂盒(Qiagen,Valencia CA)进行DNA的亚硫 酸氢盐修饰。用线上程序Meth Primer(Li et al.,Bioinformatics 18:1427-31(2002)) 设计引物。此处所用的甲基化和非甲基化的特异性引物示于表1：

名称 序列(SEQ ID NO) MSP-F GAGGCGTGGGTTTGGCGC(SEQ ID NO:4 MSP-R CACCACGCGCTCCAATCCTC(SEQ ID NO:5) USP-F TCGTTTTTAATTGGTTTTTATTAGC(SEQ ID NO:6) USP-R TCAAAATTTCTTAACAAATATCGTT(SEQ ID NO:7)

表1.

细胞活力、集落形成和流式细胞术.

如先前在Dar et al.,J Biol Chem 286:16606-14(2011)和Dar et al.,J Invest  Dermatol 130:2071-9(2010))中所述进行细胞活力、集落形成和流式细胞术分析。

免疫印迹分析.

细胞裂解物在含有1x Halt蛋白酶抑制剂混合物和1x Halt磷酸酶抑制剂混 合物(Pierce,Rockford,IL)的PBS中制备并在4℃于3500r.p.m离心10分钟。将 来自各样品的蛋白(10–15ug)进行SDS/聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)并转移到硝 酸纤维素膜上。用抗MDM2、p53、p21、BCL-2和GAPDH(Santa Cruz  Biotechnology,Santa Cruz,CA)、以及PUMA、BCL-XL(Cell Signaling Technology, Danvers,MA)的特异性抗体检测靶蛋白。

萤光素酶试验.将含有与miR-18b的种子序列互补的靶位点序列的MDM2 的3’-UTR区克隆到pMIR-REPORT萤光素酶载体(Ambion,Cambridge MA)中萤 光素酶基因的下游，产生的载体命名为MDM2-3’UTR。将与miR-18b互补的突 变的MDM23’UTR克隆到相同的载体中，产生的载体命名为MDM2-Mut 3’UTR。对于报告子试验，用野生型或突变型报告子质粒和miR-18b瞬时转染细 胞。转染后48小时用Dual Luciferase Assay(Promega,Madison,WI)测量萤火虫 萤光素酶活性，结果用海肾萤光素酶归一化。每个报告子质粒转染至少三次(在 不同天)，各样品一式三份进行试验。

侵袭和迁移试验.对于1205-Lu细胞，用15μl基质胶在6mg/ml蛋白涂覆博 伊登室插入物。对于迁移试验，没有涂覆博伊登室插入物，将细胞直接加入。

稳定的细胞产生和体内研究.用pEP Null或pEP miR-18b载体(Cellbiolabs, San Diego CA)转染1205-Lu细胞并用嘌呤霉素(1μg/mL)选择。对于体内研究， 如先前在Dar et al.,J Invest Dermatol 130:2071-9(2010)中所述，将1x 10⁶细胞皮 下注射到裸鼠中，观察肿瘤生长24天。所有的动物护理均按照机构准则。

免疫荧光试验.将1205-Lu细胞接种到8-孔板的小室中。如先前在Dar et al., Oncogene 28:866-75(2009)中所述进行免疫荧光试验。试验中使用了N-钙粘蛋 白、波形蛋白、slug和E-钙粘蛋白的抗体(Cell signaling)。

染色质免疫沉淀分析.根据生产商的指导和如在Majid et al., Carcinogenesis 30:662-70(2009)所述用EZ-ChIP试剂盒(Upstate Biotechnology, Charlottesville,VA)进行染色质免疫沉淀分析。从Upstate Biotechnology和Ambion (Austin,TX)购得免疫沉淀中所用的抗体，这些抗体对乙酰组氨酸H3(06–599)、 乙酰组氨酸H4(06–866)、二甲基组氨酸H3赖氨酸4(07–030)、三甲基组氨酸 H3赖氨酸4(07–473)、二甲基组氨酸H3赖氨酸9(07–441)和三甲基组氨酸H3 赖氨酸9(ab8898)具有特异性。将免疫沉淀的DNA洗脱在总体积50μl中，2μl 用于PCR。用于PCR的引物序列适于表2：

方向 5’至3’的序列(SEQ ID NO) 正向 GCTTGAATGGAGAACTCCG(SEQ ID NO:8)

反向 CTTACCTAATGCTCCCGTTGA(SEQ ID NO:9)

表2

统计学分析.所有定量数据均代表至少一式三份样品的平均值或如文中指 出的平均值。误差棒代表平均值的标准误差。通过学生t检验确定统计学显著性， 双尾P值<0.05被认为是显著的。用Prism 5软件(Graphpad Software Inc.,CA)进 行Kaplan-Meier分析(log-rank检验)。

黑色素细胞和黑色素瘤细胞中的miR-18b表达.通过用Agilent平台在少 数几个痣(n＝5)和黑色素瘤样品(n＝10)上进行miRNA微阵列来确定黑色素瘤中 miRNA的表达模式。发现与痣相比，miR-18b在黑色素瘤样品中被显著下调。 为了验证微阵列的结果，在独立的一群痣和黑色素瘤组织上进行miRNA-定量 RT-PCR(miR qRT-PCR)分析。痣(n＝48)和黑色素瘤(n＝92)样品的miR qRT-PCR表 明，当与痣比较时，miR-18b表达在黑色素瘤中被显著下调。(参见图.1A)。

通过进行Kaplan-Meier分析，发现原发性皮肤黑色素瘤样本中的低miR-18b 水平与显著降低的总体存活率相关(参见图.1B,p<0.04)。然后测定了一组人黑 色素瘤细胞系和正常黑色素细胞中的miR-18b表达水平。结果显示，与正常黑 色素细胞相比，黑色素瘤细胞中miR-18b的表达被显著下调(参见图.1C)。因 此，数据说明，miR-18b在含有黑色素瘤细胞的样本和细胞系中被下调，也说明 通过测量受试对象的miR-18b表达水平将使医务工作者能够评价受试对象中黑 色素瘤的进展或阶段。

在黑色素瘤中miR-18b通过CpG超甲基化被沉默.为了理解miR-18b表达 在黑色素瘤中被抑制的机制，进行了在miR-18b上游的2.5kb序列的甲基化分 析。通过使用methprimer软件，观察到了若干个富含CpG的区域(参见图.2A)。 并且，用去甲基化剂5-氮杂-脱氧胞苷(5AZA,5μM)处理五个黑色素瘤细胞系导 致miR-18b表达的显著上调，说明甲基化可能在其抑制中有作用(图.2B)。为了 研究黑色素瘤细胞系和肿瘤样品的甲基化状态，设计了靶向甲基化和非甲基化 的miR-18b的引物。如图.2C所示，在五个黑色素瘤细胞系和三十个肿瘤样品 中观察到了明显的甲基化条带。相反，在黑色素瘤细胞系和肿瘤样品中没有非 甲基化条带或者非甲基化条带很弱。为了确定miR-18b过表达后是否有共价染 色质修饰，进行了染色质免疫沉淀分析。miR-18b过表达导致乙酰化组氨酸H3、 H4和H3二乙酰化赖氨酸4的富集(参见图.2C-D)，指示基因活化。相反，观 察到了miR-18b过表达后对阻抑性染色质修饰(2H3K9和3H3K9)的抑制(参见 图.2C-D)。这些发现表明，miR-18b在黑色素瘤细胞系和肿瘤样品中被超甲基化 沉默，也说明其过表达与活性组氨酸修饰相关。因此数据显示，通过阻止、抑 制、或逆转黑色素瘤细胞中miR-18b的超甲基化能够在黑色素瘤患者中提供有 益的治疗效果。

MDM2作为miR-18b的靶标.为了鉴定miR-18b的潜在效应子，我们使 用了预测mRNA靶标的多种算法，并鉴定MDM2为推定的靶标，因为miR-18b 的种子序列与MDM2的3’UTR互补(参见图.3A)。为了研究miR-18b表达和 MDM2表达之间的关联，测定了同一组细胞系中mRNA和蛋白水平的MDM2 表达。当与正常黑色素细胞系比较时，MDM2表达水平在黑色素瘤细胞中更高 (参见图.3B)，虽然在不同的黑色素瘤细胞系中绝对表达水平有变化。这些数据 表明了miR-18b表达和MDM2表达之间的负相关，暗示MDM2是miR-18b的 靶标。

接着，将带有与miR-18b种子序列互补的序列的MDM23’UTR克隆到报告 子质粒载体中。平行地，将突变的3’UTR序列克隆在相同的报告子质粒中。与 对照载体相比，MDM2-3’UTR构建体和miR-18b瞬时共转染到人1205-Lu和 LOX黑色素瘤细胞中导致报告子表达的显著下降(参见图.3C-D)。这些结果表 明，MDM23’UTR的保守核苷酸负责体外靶向miR-18b。瞬时miR-18b过表达(参 见图.3E)在蛋白水平显著抑制了MDM2，同时促凋亡基因p53和PUMA上调， 抗-凋亡基因BCL2和BCL-XL下调(参见图.3F)。有趣的是，与具有野生型p53 的1205-Lu和LOX相反，miR-18b过表达对带有突变型p53的C8161.9黑色素 瘤细胞系的细胞存活、MDM2和p53表达水平没有影响。顺铂诱导了miR-18b 表达，用miR-18b处理黑色素瘤细胞显示出对顺铂的细胞毒性增强的敏感性。 综合考虑，这些结果表明MDM2(以及p53途径)是黑色素瘤中miR-18b作用的 靶标。

miR-18b调控黑色素瘤细胞增殖、集落形成和凋亡.然后分析了miR-18b- 驱动的MDM2下调和其后的促凋亡基因诱导的功能性影响。与表达对照miR序 列(对照miR)的细胞相比，用miR-18b瞬时转染1205-Lu细胞导致细胞增殖随 时间显著下降(参见图.4A)。然后利用集落形成试验检测了miR-18b对黑色素 瘤细胞活力的影响。miR-18b-转染的1205-Lu细胞显示出低集落形成能力，因为 与表达对照miR的细胞相比时，表达miR-18b的细胞中病灶的大小和数目均被 抑制了(参见图.4B)。细胞周期分析显示，与表达对照miR的细胞相比，过表 达miR-18b的1205-Lu细胞的S-期显著减少(15.5％至8.05％,p<0.02)(参见图. 4C)。与对照miR比较，miR-18b过表达在1205-Lu细胞中诱导了凋亡(2.87％至 11.30％,p<0.01)(参见图.4D)。为了证实miR-18b对黑色素瘤细胞增殖和凋亡的 作用，将miR-18b转染到LOX人黑色素瘤细胞中。如图.5A-D所示，在miR-18b 转染的LOX细胞中，细胞增殖、集落形成和S-期均显著下降，同时凋亡增加。 这些结果证实了miR-18b过表达在人黑色素瘤细胞中的表型效应。

miR-18b过表达对黑色素瘤细胞的作用是通过对MDM2表达的调控来介导 的。为了进一步探索MDM2作为miR-18b靶标的作用，用miR-18b和MDM2 共转染1205-Lu细胞，检测其对基因表达和黑色素瘤细胞存活的影响。与对照 miR和空载体共转染相比，miR-18b和空载体对照的共转染导致对MDM2的抑 制，p53途径的活化，并抑制了黑色素瘤细胞存活率。在共转染表达miR-18b 和MDM2的载体后，很大程度上逆转了这些效果。这些结果表明，miR-18b对 下游基因表达和黑色素瘤细胞增殖的影响很大程度上是通过其对MDM2表达的 抑制来介导的。

miR-18b稳定表达抑制细胞存活、集落形成、和体内肿瘤细胞生长.然后 研究了黑色素瘤中miR-18b稳定表达的影响。产生了稳定表达miR-18b的 1205-Lu细胞，通过miR qRT-PCR分析确证了miR-18b的过表达(参见图.6A)。 与表达对照载体的细胞相比，表达miR-18b的1205-Lu细胞的细胞增殖被显著 抑制(参见图.6B)。与表达对照载体的细胞相比，过表达miR-18b的细胞的集落 形成(参见图.6C)和S-期细胞(参见图.6D)显著下降。miR-18b过表达导致 1205-Lu细胞的凋亡指数显著增加(参见图.6E)。此外，在miR-18b过表达细胞 中，MDM2被显著下调，同时p53和PUMA的表达增加(参见图.6F)。皮下接 种到裸鼠后，比表达对照载体的细胞相比，miR-18b的稳定的过表达显著抑制了 体内肿瘤生长(参见图.6G)。与对照肿瘤相比，miR-18b过表达的肿瘤中MDM2 在蛋白水平被抑制(参见图.6H)。这些结果证实了miR-18b是肿瘤抑制剂，对 MDM2-p53轴具有有益作用。并且，这些结果表明，包含含有miR-18b的多核 苷酸和/或增强miR-18b表达的物质的疗法能够有效治疗癌症。

顺铂诱导miR-18b表达.黑色素瘤细胞对传统的化疗剂有高度抗性。考虑 到miR-18b通过MDM2上调了p53表达，且考虑到p53在介导化疗诱导的凋亡 中已知的作用(Li et al.,Melanoma Res 8:17-23(1998))，研究了化疗剂和miR-18b 表达之间可能的相互作用。与载体处理的细胞相比，用2nM顺铂处理1205-Lu 细胞48小时导致对miR-18b表达的显著上调(参见图.7A)。此外，miR-18b过 表达和顺铂处理导致对黑色素瘤细胞增殖的显著抑制(参见图.7B)。而且，结果 表明可通过将基于提高受试对象miR-18b水平的疗法与其他已知抗癌剂组合来 实现治疗癌症的协同效果。

miR-18b抑制黑色素瘤细胞迁移和侵袭，并逆转上皮-至-间充质-转变 (EMT).研究了miR-18b对1205-Lu黑色素瘤细胞(一种高度侵袭性的细胞类型) 的迁移和侵袭行为的影响。miR-18b过表达显著抑制了1205-Lu黑色素瘤细胞的 迁移能力和侵袭性(参见图.8A-B)。考虑到miR-18b在肿瘤细胞的侵袭和转移 行为中的作用，接下来分析了miR-18b对EMT的潜在影响(Alonso et al.,Cancer  Res 67:3450-60(2007))。miR-18b在1205-Lu黑色素瘤细胞中的过表达导致了上 皮生物标记物E-钙粘蛋白的显著上调(参见图.8E)。相反，间充质标记物波形 蛋白、N-钙粘蛋白和slug的水平在miR-18b过表达的黑色素瘤细胞中被降低(参 见图.8C-D-E)。这些发现表明，miR-18b表达的缺失增强黑色素瘤细胞系的迁 移和侵袭行为，促进上皮至间充质的转变。

为了确定组合疗法是否可提供额外的益处，用Neg-miR(即,作为阴性对照 的随机序列)或miR-18b转染1205-Lu黑色素瘤细胞并用达拉非尼处理，处理后 48小时观察细胞增殖。miR-18b过表达使黑色素瘤细胞系对BRAF特异性抑制 剂敏感(参见，例如，图9)。这些发现表明，miR-18b与BRAF抑制剂有叠加作 用，其表达可用作评价黑色素瘤中对BRAF特异性药物的敏感性的指标。

本文已描述了多个实施方式。然而，应理解可进行多种改动而不脱离本公 开内容的精神和范围。因此，其他实施方式在以下权利要求书的范围内。