诊断或监测肾功能或者诊断肾功能异常的方法

摘要

用于(a)诊断或监测对象的肾功能、或者(b)诊断对象的肾功能异常、或者(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风险、或者(d)预测或监测治疗或干预的成功的方法，其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，所述方法包括：·测定获自所述对象的体液中的脑啡肽原(PENK)或其具有至少5个氨基酸的片段的水平；以及(a)将所述脑啡肽原或其片段的水平与对象的肾功能相关联，或者(b)将所述脑啡肽原或其片段的水平与肾功能异常相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测或诊断所述对象的肾功能异常，或者将所述脑啡肽原或其片段的水平与所述患病对象的不良事件的风险相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测所述不良事件的风险增加，或者(d)将所述脑啡肽原或其片段的水平与患病对象的治疗干预的成功相关联，其中低于某个阈值的水平预测治疗或干预的成功。

说明书

本发明的主题为方法，其被用于(a)诊断或监测对象的肾功能，或(b) 诊断对象的肾功能异常，或(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风险， 其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末 期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失和终末 期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，或(d)预测或监测治疗或干预的成 功，所述方法包括：

·测定获自所述对象的体液中的脑啡肽原(PEN)或其具有至少5个氨 基酸的片段的水平；以及

(a)将所述脑啡肽原或其片段的水平与对象的肾功能相关联，或

(b)将所述脑啡肽原或其片段的水平与肾功能异常相关联，其中升高 的大于某个阈值的水平预测或诊断所述对象的肾功能异常，或

(c)将所述脑啡肽原或其片段的水平与所述患病对象中的不良事件 的风险相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测所述不良事件的风 险增加，或

(d)将所述脑啡肽原或其片段的水平与患病对象的治疗或干预的成 功相关联，其中低于某个阈值的水平预测治疗或干预的成功。

Met-脑啡肽为来源于脑啡肽前体(前脑啡肽原)的具有5个氨基酸的 肽，也称为“阿片生长因子”(OGF)，其与脑啡肽原片段一起释放。成熟肽 结合不同的阿片受体(Koneru et al,2009)。已发现脑啡肽(OGF)具有多种生 理功能。在CNS中，其下调P物质相关的疼痛信号，作为细胞因子起作 用(Plotnikoff et al,1997)。脑啡肽原相关的肽展现抗菌作用(Goumon et al, 1998)。脑啡肽原和脑啡肽展现抗肿瘤作用，并用作促细胞凋亡剂(Tavish  et al,2007,Donahue et al,2011,Zagon et al,2009)。据报道，肾功能异常中 脑啡肽升高(Smith et al,1985,Zoccali et al.,1987,Smith et al,1981)。脑啡 肽产生为较大的脑啡肽原，并通过蛋白水解转化为成熟五肽。在成熟过 程中，生成了多种脑啡肽原片段，其与脑啡肽一起释放(Ernst et al.,2006)。

本发明的主题为脑啡肽原(PENK)或其片段作为肾功能和肾功能异常 的标志物的用途，以及其在健康和患病对象中的临床应用。本发明的主 题为用于诊断或监测对象的肾功能或者诊断对象的肾功能异常或预测患 病对象的死亡或不良事件的风险的方法。

本发明的主题还为提供PENK或其片段对诊断患病对象的肾功能、 肾功能异常的预后和诊断力以及预后价值。

令人吃惊地，显示出PENK或片段为用于肾、其功能、功能异常、 死亡或不良事件的风险以及预后和监测治疗或干预的成功的有力和高度 显著的生物标记。

本发明的主题为方法，其被用于(a)诊断或监测对象的肾功能，或(b) 诊断对象的肾功能异常，或(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风险， 其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末 期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失和终末 期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，或(d)预测或监测治疗或干预的成 功，所述方法包括：

·测定获自所述对象的体液中的脑啡肽原(PENK)或其具有至少5个 氨基酸长的片段的水平；以及

(a)将所述脑啡肽原或其片段的水平与对象的肾功能相关联，或

(b)将所述脑啡肽原或其片段的水平与肾功能异常相关联，其中升高 的大于某个阈值的水平预测或诊断所述对象的肾功能异常，或

(c)将所述脑啡肽原或其片段的水平与所述患病对象中的不良事件 的风险相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测所述不良事件的风 险增加，或

(d)将所述脑啡肽原或其片段的水平与患病对象治疗或干预的成功 相关联，其中小于某个阈值的水平预测治疗或干预的成功。

根据本发明，在一个具体的实施方案中，所述脑啡肽原或其片段不 为leu-脑啡肽，且不为met-脑啡肽。在另一具体的实施方案中，所述脑 啡肽原片段为MR-脑啡肽原(MRPENK)或其具有至少5个氨基酸的片段。

换句话说：本发明的主题为方法，其被用于：(a)诊断或监测对象的 肾功能，或(b)诊断对象的肾功能异常，或(c)预测或监测患病对象中的不 良事件的风险，其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾 功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾 功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，或(d)预测或监测 治疗或干预的成功，所述方法包括：

·通过使用与获自所述对象的体液中的脑啡肽原(PENK)的氨基酸序 列中的区域结合的至少一种结合剂来测定免疫反应性分析物的水平；以 及

(a)将所述免疫反应性分析物的水平与对象的肾功能相关联，或

(b)将所述免疫反应性分析物的水平与肾功能异常相关联，其中升高 的大于某个阈值的水平预测或诊断所述对象的肾功能异常，或

(c)将所述免疫反应性分析物的水平与所述患病对象中的不良事件 的风险相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测所述不良事件的风 险增加，或

(d)将所述免疫反应性分析物的水平与患病对象治疗或干预的成功 相关联，其中小于某个阈值的水平预测治疗或干预的成功。

根据本发明，在具体的实施方案中，所述免疫反应性分析物不为leu- 脑啡肽，并且不为met-脑啡肽。在另一具体的实施方案中，所述免疫反 应性分析物为MR-脑啡肽原(MR ENK)或其具有至少5个氨基酸的片段。

这意味着在将与体液中的脑啡肽原(PENK)的氨基酸序列中的区域结 合的结合剂用于本发明的方法的情况下，则术语“测定获自所述对象的体 液中的脑啡肽原(PENK)或其具有至少5个氨基酸的片段的水平”等价于 “通过使用与获自所述对象的体液中的脑啡肽原(PENK)的氨基酸序列中 的区域结合的至少一种结合剂测定免疫反应性分析物的水平”。在具体的 实施方案中，在本发明的方法中使用了与体液中的脑啡肽原(PENK)的氨 基酸序列中的区域结合的结合剂。在具体的实施方案中，用于本发明的 方法的所述结合剂不结合体液中的leu-脑啡肽或met-脑啡肽的氨基酸序 列中的区域。在本发明的另一具体的实施方案中，所述至少一种结合剂 结合MR-脑啡肽原(MRPENK)或其具有至少5个氨基酸的片段。

如本文所使用，术语“对象”是指活的人或非人的生物。优选地，在 本文中，所述对象为人对象。如果在其他地方没有叙述，对象可为健康 的或患病的。在本发明的一个实施方案中，所述对象未患中风。在另一 实施方案中，所述对象不为急性中风患者。

术语“升高的水平”是指大于某个阈值水平的水平。术语“升高的”水平 可指大于被当做参照水平的值的水平。

预测或监测治疗或干预的成功可为，例如使用脑啡肽原(PENK)或其 具有至少5个氨基酸的片段的测量，来预测或监测肾脏替代疗法的成功。

预测或监测治疗或干预的成功可为，例如使用脑啡肽原(PENK)或其 具有至少5个氨基酸的片段的测量，利用已接受肾脏替代疗法的患者中 的透明质酸来预测或监测治疗的成功。

预测或监测治疗或干预的成功可为，例如使用PENK或其具有至少5 个氨基酸的片段的测量，预测或监测肾脏替代疗法和/或药物干预之前和 之后肾功能受损患者的肾功能恢复。

体液可选自包含以下的组：血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(csf) 和唾液。

脑啡肽原或其片段的测定显示对象的肾功能。增加的脑啡肽原或其 片段的浓度指示降低的肾功能。在随访测量中，脑啡肽原或其片段的相 对改变与对象肾功能的改善(降低的脑啡肽原或其片段)和恶化(增加的脑 啡肽原或其片段)相关。

脑啡肽原或其片段可用于诊断肾功能异常，其中升高的大于某个阈 值的水平预测或诊断所述对象中的肾功能异常。在随访测试中，脑啡肽 原或其片段的相对改变与对象肾功能异常的改善(降低的脑啡肽原或其片 段)和恶化(增加的脑啡肽原或其片段)相关。

脑啡肽原或其片段比用于肾功能/功能异常诊断和随访的其他标记 (NGAL、血液肌酸酐、肌酐清除率、胱抑素C、尿素)更优异。优异性是 指更高的特异性、更高的灵敏度和与临床终点的更好的相关性。

将所述脑啡肽原或其片段的水平与患病对象的不良事件或死亡风险 相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测死亡或不良事件的风险增 加。同样在该方面，脑啡肽原或其片段优于上述临床标记。

根据本发明的风险与如RIFLE标准(Venkatamaran and Kellum,2006) 所定义的风险相关。

病人可患有选自下述的疾病：对炎症的免疫反应引起的慢性肾衰竭、 由减少的血流引起的急性肾衰竭(其可与由创伤引起的极低血压一起发 生)、创伤患者、手术、中风、急性和慢性肾衰竭、SIRS患者、败血症、 败血性休克、中风、急性心肌梗死和心肌梗死后、急性和慢性心力衰竭、 局部和系统性细菌和病毒感染、自身免疫性疾病、烧伤患者、癌症、肝 病、肺病、接受肾毒素如环孢霉素、抗生素(包括氨基糖苷类和抗癌药物 如顺铂)的患者。

支持或替代肾功能的治疗或干预可包括各种肾替代疗法的方法，包 括但不限于：血液透析、腹膜透析、血液滤过和肾移植。

不良事件可选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期 肾病在内的肾功能异常的恶化(根据RIFLE标准，Venkatamaran and  Kellum,2006)。

在本发明的一个实施方案中，应理解，术语脑啡肽原的片段也包含 Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽。

根据本发明的主题为方法，其中通过使用与脑啡肽原或其具有至少5 个氨基酸的片段结合的结合剂、至少一种结合剂，测定了脑啡肽原或其 具有至少5个氨基酸的片段的水平。在本发明的一个实施方案中，所述 结合剂选自包含以下的组：与脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段 结合的抗体、抗体片段或非Ig支架。在具体的实施方案中，所述至少一 种结合剂与具有选自包含SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10 的组的序列的区域结合。在具体的实施方案中，所述结合剂不结合脑啡 肽——[Met]脑啡肽SEQ ID No:3和[Leu]脑啡肽SEQ ID No:4。在具体的 实施方案中，所述至少一种结合剂与具有选自包含SEQ ID No.1、2、5、 6、7、8、9和10的组的序列的区域结合。在另一具体的实施方案中，所 述至少一种结合剂与具有选自包含SEQ ID No.2、5、6和10的组的序列 的区域结合。在另一非常具体的实施方案中，所述结合剂与脑啡肽原 119-159、中间区脑啡肽原-片段、MRPENK结合。

脑啡肽原具有以下序列：

SEQ ID NO.1(脑啡肽原(1-243)

ECSQDCATCSYRLVRPAD1NFLACVMECEGKLPSLKIWETCKELLQLSKPELPQDGTSTL RENSKPEESHLLAKRYGGFMKRYGGFMKKMDELYPMEPEEEANGSEILAKRYGGFMK KDAEEDDSLANSSDLLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVSKRYGGFMRGLKRSPQL EDEAKELQKRYGGFMRRVGRPEWWMDYQKRYGGFLKRFAEALPSDEEGESYSKEVPE MEKRYGGF MRF

体液中可测定的脑啡肽原的片段，例如可为选自如下片段：

SEQ ID NO.2(合成脑啡肽，脑啡肽原1-73)

ECSQDCATCSYRLVRPADINFLACVMECEGKLPSLKIWETCKELLQLSKPELPQDGTSTL RENSKPEESHLLA

SEQ ID NO.3(Met-脑啡肽)

YGGFM

SEQ ID NO.4(Leu-脑啡肽)

YGGFL

SEQ ID NO.5(脑啡肽原90-109)

MDELYPMEPEEEANGSEILA

SEQ ID NO 6：(脑啡肽原119-159，中间区脑啡肽原-片段，MPENK)

DAEEDDSLANSSDLLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVS

SEQ ID NO.7(Met-脑啡肽-Arg-Gly-Leu)

YGGFMRGL

SEQ ID NO.8(脑啡肽原172-183)

SPQLEDEAKELQ

SEQ ID NO.9(脑啡肽原193-203)

VGRPEWWMDYQ

SEQ ID NO.10(脑啡肽原213-234)

FAEALPSDEEGESYSKEVPEME

SEQ ID NO.11(脑啡肽原213-241)

FAEALPSDEEGESYSKEVPEMEKRYGGF M

SEQ ID NO.12(Met-脑啡肽-Arg-Phe)

YGGFMRF

测定包含Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽的脑啡肽原或其片段的水平，可 指测定对包含Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽的脑啡肽原或其片段的免疫反应 性。用于基于结合区来测定包含Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽的脑啡肽原或 其片段的结合剂，可结合多于一种上述分子。这对本领域技术人员来说 是清楚的。

因此，根据本发明，通过使用与任何上述肽和肽片段(即，序列1-12 中任一个所示的脑啡肽原(PENK)和片段)的氨基酸序列中的区域结合的 至少一种结合剂，测定了获自所述对象的体液中的免疫反应性分析物的 水平；并与临床相关的特定实施方案相关联。

在根据本发明的方法的更具体的实施方案中，测定了MRPENK(SEQ  ID NO.6:脑啡肽原119-159,中间区脑啡肽原-片段,MRPENK)的水平。 在更具体的实施方案中，通过使用与MR-PENK结合的至少一种结合剂， 测定了免疫反应性分析物的水平，并将其与根据本发明的上述实施方案 和临床相关的特定实施方案相关联，例如

·将所述免疫反应性分析物的水平与对象的肾功能相关联，或

(b)将所述免疫反应性分析物的水平与肾功能异常相关联，其中升高 的大于某个阈值的水平预测或诊断所述对象的肾功能异常，或

(c)将所述免疫反应性分析物的水平与所述患病对象中的不良事件 的风险相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测所述不良事件的风 险增加，或

(d)将所述免疫反应性分析物的水平与患病对象治疗或干预的成功 相关联，其中小于某个阈值的水平预测治疗或干预的成功。

可选地，可通过其他分析方法如质谱测定上述分析物中的任一种的 水平。

因此，本发明的主题为方法，其被用于(a)诊断或监测对象的肾功能， 或(b)诊断对象的肾功能异常，或(c)预测或监测患病对象中的不良事件的 风险，其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失 和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失 和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，或(d)预测或监测治疗或干 预的成功，所述方法包括

·通过使用与获自所述对象的体液中的选自包含SEQ ID No.1-12所 示的肽和片段的组的肽氨基酸序列中的区域结合的至少一种结合剂，测 定免疫反应性分析物的水平；以及

(a)将所述脑啡肽原或其片段的水平与对象的肾功能相关联，或

(b)将所述脑啡肽原或其片段的水平与肾功能异常相关联，其中升高 的大于某个阈值的水平预测或诊断所述对象的肾功能异常，或

(c)将所述脑啡肽原或其片段的水皮与所述患病对象中的不良事件 的风险相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测所述不良事件的风 险增加，或

(d)将所述脑啡肽原或其片段的水平与患病对象治疗或干预的成功 相关联，其中小于某个阈值的水平预测治疗或干预的成功。

在具体的实施方案中，通过使用与选自包含脑啡肽原或其具有至少5 个氨基酸的片段的组的肽氨基酸序列中的区域结合的至少一种结合剂， 测定了免疫反应性分析物的水平。在具体的实施方案中，所述至少一种 结合剂与具有选自包含SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的 组的序列的区域结合。在具体的实施方案中，所述结合剂不结合脑啡肽 ——[Met]脑啡肽SEQ ID No:3和[Leu]脑啡肽SEQ ID No:4。在具体的实 施方案中，所述至少一种结合剂与具有选自包含SEQ ID No.1、2、5、6、 7、8、9和10的组的序列的区域结合。在另一具体的实施方案中，所述 至少一种结合剂与具有选自包含SEQ ID No.2、5、6和10的组的序列的 区域结合。在另一非常具体的实施方案中，所述结合剂与脑啡肽原 119-159、中间区脑啡肽原-片段、MRPENK结合。上述结合剂与所述获 自所述对象的体液中的肽结合。

在本发明的一个实施方案中，所述结合剂选自包含以下的组：与脑 啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段结合的抗体、抗体片段或非Ig-支 架。

在更具体的实施方案中，通过使用与获自所述对象的体液中的脑啡 肽原119-159、中间区脑啡肽原-片段、MRPEN(SEQ ID No.6)的氨基酸 序列中的区域结合的至少一种结合剂，测定了免疫反应性分析物的水平。

在具体的实施方案中，通过使用与脑啡肽原或其片段结合的抗体或 抗体片段的免疫分析，测量了脑啡肽原或其片段的水平。可用于测定脑 啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平的免疫分析，可包括实施 例1中所示的步骤。所有阈值和值都必须理解为与根据实施例1所使用 的测试和校准相关。本领域技术人员可了解阈值的绝对值可能受到所用 校准影响。这意味着应当在本文(实施例1)中所用校准的上下文中理解本 文给出的所有值和阈值。

根据本发明，针对脑啡肽原的诊断性结合剂选自：抗体如IgG(一种 典型的全长免疫球蛋白)，或至少包含重链和/或轻链的F-可变域的抗体片 段如化学偶联的抗体(结合抗原的片段)，包括但不限于Fab-片段，包括具 有表位标签如Fab-V5Sx2的Fab小抗体、单链Fab抗体、单价Fab抗体； 与CH3结构域二聚化的二价Fab(小抗体)；二价Fab或多价Fab，例如在 异源结构域的帮助下通过多聚化形成的，例如通过dHLX结构域的二聚 化形成的如Fab-dHLX-FSx2；F(ab')2-片段、scFv-片段、多聚化的多价或 /和多特异性scFv-片段、二价和/或双特异性双体、(双特异性T细 胞连接物)、三功能抗体、多价抗体，例如来自不同于G的类型；单结构 域抗体如来源于骆驼或鱼免疫球蛋白的纳米抗体。

在具体的实施方案中，通过利用与脑啡肽原或其片段结合的、选自 包含在下文有更详细描述的适配子、非Ig支架的组的结合剂的分析来测 量脑啡肽原或其片段的水平。

可用于测定脑啡肽原或其片段水平的结合剂展现的对脑啡肽原的亲 和常数为至少10⁷M^-1，优选10⁸M^-1，优选的亲和常数大于10⁹M^-1，最优 选大于10¹⁰M^-1。本领域技术人员了解，可考虑通过施用较高剂量的化合 物来补偿较低的亲和力，并且这一措施不会导致本发明超范围。可使用 Biacore法测定结合亲和力，所述方法在例如Biaffin,assel,Germany (http://www.biaffin.com/de/)处被提供为服务分析。

人脑啡肽原对照样品购自ICI-Diagnostics,Berlin,Germany  http://www.ici-diagnostics.com/。还可通过合成(对于我们的实验，我们使 用了合成的MRPENK,SEQ ID NO.6)或重组的脑啡肽原或其片段来校准 该分析。

除了抗体，其他生物聚合物支架是本领域熟知的用于复合靶标分子 的物质，并且已被用于生成高靶标特异性的生物聚合物。实例为适配子、 Spiegelmer、抗运载蛋白(anticalin)和芋螺毒素。非Ig支架可为蛋白支架， 并且可用作抗体模拟物，因为它们能够结合配体或抗原。非Ig支架可选 自包含以下的组：基于四连接素的非Ig支架(例如，描述于US  2010/0028995中的)、纤连蛋白支架(例如，描述于EP 1266 025中的；基 于脂运载蛋白的支架(例如，描述于WO 2011/154420中的)；泛素支架(例 如，描述于WO 2011/073214中的)、转运支架(例如，描述于US  2004/0023334中的)、蛋白A支架(例如，描述于EP 2231860中的)、基于 锚蛋白重复的支架(例如，描述于WO 2010/060748中的)、微量蛋白，优 选形成胱氨酸结的微量蛋白)支架(例如，描述于EP 2314308中的)、基于 Fyn SH3结构域的支架(例如，描述于WO 2011/023685中的)、基于 EGFR-A-结构域的支架(例如，描述于WO 2005/040229中的)和基于 Kunitz结构域的支架(例如，描述于EP 194 867中的)。

用于诊断肾病/肾功能异常或测定死亡或不良事件的风险的阈值可为 正常范围上限(99百分位数,80pmol MRPENK/L,更优选100pmol/L，更 优选120pmol/L)。75-130pmol MRPENK/L的阈值范围是可用的。

在一个具体的实施方案中，通过免疫分析来测量脑啡肽原的水平， 并且所述结合剂为与脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段结合的抗 体或抗体片段。

在一个具体的实施方案中，所述分析使用了包含与脑啡肽原区中的 两个不同区域即氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID No.13)和氨基酸 152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO.14)结合的两种结合剂，其中每个所述 区域包含至少4或5个氨基酸。

在根据本发明的用于测定样品中的脑啡肽原或脑啡肽原片段的分析 的一个实施方案中，所述分析的分析灵敏度能够定量健康对象的脑啡肽 原或脑啡肽原片段，并且<15pmol/L，优选<10pmol/L，并且更优选L< 6pmol/L。

本发明的主题为在下述方法中将与获自所述对象的体液中的选自包 含SEQ ID No.1-12所示的肽和片段的组的肽氨基酸序列中的区域结合的 至少一种结合剂应用于：(a)诊断或监测对象的肾功能，或(b)诊断对象的 肾功能异常，或(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风险，其中所述 不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在 内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在 内的肾功能异常导致的死亡，或(d)预测或监测治疗或干预的成功。在本 发明的一个实施方案中，所述结合剂选自包含以下的组：与脑啡肽原或 其具有至少5个氨基酸的片段结合的抗体、抗体片段或非Ig支架。在具 体的实施方案中，所述至少一种结合剂与具有选自包含SEQ ID No.1、2、 3、4、5、6、7、8、9和10的组的序列的区域结合。在具体的实施方案 中，所述结合剂不结合脑啡肽——[Met]脑啡肽SEQ ID No:3和[Leu]脑啡 肽SEQ ID No:4。在具体的实施方案中，所述至少一种结合剂与具有选自 包含SEQ ID No.1、2、5、6、7、8、9和10的组的序列的区域结合。在 另一具体的实施方案中，所述至少一种结合剂与具有选自包含SEQ ID No. 2、5、6和10的组的序列的区域结合。在另一非常具体的实施方案中， 所述结合剂与脑啡肽原119-159、中间区脑啡肽原-片段、MRPENK结合。

在更具体的实施方案中，至少一种结合剂与获自所述对象的体液中 的脑啡肽原119-159、中间区脑啡肽原-片段、MRPEN(SEQ ID No.6)的 氨基酸序列中的区域结合，更具体地，与氨基酸133-140(LKELLETG, SEQ ID No.13)和/或氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO.14)结合， 其中每个所述区域包含至少4或5个氨基酸。

因此，根据本方法，测定了获自所述对象的体液中的上述结合剂的 免疫反应的水平。免疫反应性的水平是指通过结合剂与这类分析物的结 合反应来定量、半定量或定性测定的分析物的浓度，其中优选地，所述 结合剂具有的结合所述分析物的亲和常数为至少10⁸M^-1，并且所述结合 剂可为抗体或抗体片段或非IgG支架，并且结合反应为免疫分析。

本发明方法使用PENK及其片段，特别是MRPENK，其在下述用途 中远优于现有技术中使用的方法和生物标记：(a)诊断或监测对象的肾功 能，或(b)诊断对象的肾功能异常，或(c)预测或监测患病对象中的不良事 件的风险，其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能 丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能 丧失和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，或(d)预测或监测治疗 或干预的成功。首先，作为用于上述应用的生物标记的所有PENK及其 片段是炎症非依赖性标记。这是重要的特征，因为大多数已知的肾生物 标记如NGAL和KIM是炎症依赖性的，意味着如果对象具有炎症，例如 在败血症中，NGAL或KIM的升高可能是由于炎症或由于肾功能/功能异 常。因此，不可进行差别诊断，至少通过使用独立于研究的特定患者群 体的简单的阈值(意指一个(1)阈值)不行。对于NGAL和KIM，根据所述 对象的炎症状态，每名患者具有针对肾功能/功能异常的“单个的”阈值， 这使得这些肾标记难以在临床上应用于一些疾病，并且不能应用于其他 疾病。与之相反，独立于对象的炎症状态的单个阈值可根据本方法用于 所有对象。这使得本方法适于临床途径，这与上述标记相反。

与NGAL和KIM相反(它们反映了肾损伤和炎症)，在本发明的方法 中作为生物标记的PENK及其片段，特别是MRPENK，反映了“真实的” 肾功能。

因此，本发明的主题为方法，其被用于：(a)诊断或监测对象的肾功 能，或(b)诊断对象的肾功能异常，或(c)预测或监测患病对象中的不良事 件的风险，其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能 丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能 丧失和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，或(d)预测或监测具有 上述步骤和特征的治疗或干预的成功，其中使用了炎症状态非依赖性阈 值。

上述方法以及PENK及片段在用于如下方法中用作生物标记的另一 优势在于PENK及片段作为生物标记为肾功能、肾功能异常、不良事件 的风险、治疗或干预的成功的非常早期的生物标记：所述方法用于：(a) 诊断或监测对象的肾功能，或(b)诊断对象的肾功能异常，或(c)预测或监 测患病对象中的不良事件的风险，其中所述不良事件选自包含以下的组： 包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由 包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡， 或(d)预测或监测治疗或干预的成功。非常早期意味着例如，比肌酸酐早、 比NGAL早。

PENK相比肌酸酐的优势的一个明显指征来源于，承认他们的7天死 亡率当天在危重患者中测定的各自浓度的相关性分析：存活者的PENK 浓度明显不同于未存活者，然而对于肌酐清除率来说却并非如此。此类 患者群体的死亡主要起因于肾功能丧失。因此，相比与肌酐清除率的相 关性，PENK与死亡的相关性更显著和更强，这支持了PENK作为肾功 能异常标记相比肌酐清除率的优势。

本发明的主题还为方法，其被用于(a)诊断或监测对象的肾功能，或 (b)诊断对象的肾功能异常，或(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风 险，其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和 终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失和 终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，或(d)预测或监测支持或替代 肾功能的治疗或干预的成功，所述治疗或干预包括肾替代疗法的各种方 法，包括但不限于根据任何前述实施方案的血液透析、腹膜透析、血液 滤过和肾移植，其中单独使用或结合其他可用于诊断的实验或临床参数 使用了获自所述对象的体液中的脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片 段的水平，所述方法可选自如下的替代性选择：

·与获自所述对象的体液中的脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的 片段的水平的中值比较，所述对象位于“健康的”或“表面上健康的”对象群 体的预定样品的整体中，

·与获自所述对象的体液中的脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的 片段的水平的分位数比较，所述样品位于“健康的”或“表面上健康的”对象 群体的预定样品的整体中，

·基于Cox比例风险分析或通过使用风险指数计算如NR1(净重新分 类指数)或IDI(整合鉴别指数)进行计算。

可确定所述其他至少一个临床参数，其选自包含以下的组：年龄、 NGAL、胱抑素C、肌酐清除率、肌酸酐、尿素和Apache评分。

在本发明的一个实施方案中，为了监测所述对象的功能或功能异常 或风险，或为了监测肾和/或疾病治疗的过程，所述方法进行了多于一次。 在一个具体的实施方案中，为了评估所述对象对采取的预防性和/或治疗 性措施的反应而进行所述监测。

在本发明的一个实施方案中，使用了所述方法以将所述对象分级为 风险组。

本发明的主题还为用于测定样品中的脑啡肽原和脑啡肽原片段的分 析，其包含与脑啡肽原区中的两个不同区域即氨基酸133-140 (LKELLETG,SEQ ID NO.13)和氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO. 14)结合的两种结合剂，其中所述区域中的每个包含至少4或5个氨基酸。

在根据本发明的用于测定样品中的脑啡肽原或脑啡肽原片段的分析 的一个实施方案中，所述分析的分析灵敏度能够定量健康对象的脑啡肽 原或脑啡肽原片段，并且<15pmol/，优选<10pmol/L，并且更优选L< 6pmol/L。

在根据本发明的用于测定样品中的脑啡肽原或脑啡肽原片段的分析 的一个实施方案中，所述结合剂展现的与脑啡肽原的结合亲和力为至少 10⁷M^-1，优选10⁸M^-1，优选亲和常数小于10⁹M^-1，最优选小于10¹⁰M^-1。 本领域技术人员了解，可考虑通过施用较高剂量的化合物来补偿较低的 亲和力，并且这一措施不会导致本发明超范围，可按如上所述测定结合 亲和力。

在本发明的一个实施方案中，其可为所谓的POC-检测(现场护理， point-of-care)，即允许在少于1小时内在患者附近实施测试而不需要全自 动测试系统的测试技术。该技术的一个实例为免疫层析测试技术。

在本发明的一个实施方案中，这样的分析为三明治型免疫分析，其 使用任何类型的检测技术，包括但不限于：酶标记、化学发光标记、电 化学发光标记，优选全自动的分析。在本发明的一个实施方案中，这样 的分析为酶标记的三明治型分析。自动化或全自动化分析的实例包括可 用于下述体系中一种的分析：RocheAbbottSiemens BrahmsBiomerieuxAlere

多种免疫分析是已知的，并且可用于本发明的分析和方法，这些包 括：放射免疫分析(“RIA”)、均质酶放大免疫分析(“EMIT”)、酶联免疫吸 附分析(“ELISA”)、脱辅酶再活化免疫分析(“ARIS”)、量尺免疫分析和免 疫-色谱分析。

在本发明的一个实施方案中，所述两种结合剂中的至少一种被标记 以被检测。

优选的分析方法包括各种形式的免疫分析，如放射免疫分析(RIA)、 化学发光和荧光免疫分析、酶联免疫分析(ELISA)、基于Luminex的珠子 分析、蛋白微阵列分析和快速测试形式如免疫层析试纸条测试。

在优选的实施方案中，所述标记选自包含以下的组：化学发光标记、 酶标记、荧光标记、放射碘标记。

所述分析可为同源或异源的分析、竞争性的和非竞争性的分析。在 一个实施方案中，分析为三明治型分析形式，其为非竞争性的免疫分析， 其中待检测和/或定量的分子与第一抗体和第二抗体结合。第一抗体可与 固相如珠子、孔或其他容器的表面、芯片或试纸条(strip)结合，并且第二 抗体为例如以染料、放射性同位素或者反应性或催化反应性部分标记的 抗体。然后通过合适的方法测量与分析物结合的标记抗体的量。与“三明 治型分析”相关的一般组成和程序已确定并且为技术人员所知(23)。

在另一实施方案中，所述分析包括两种捕获分子，优选均为在液体 反应混合物中作为分散体存在的抗体，其中第一标记组分与第一捕获分 子连接，其中所述第一标记组分为基于荧光或化学冷光淬灭或放大的标 记系统的一部分，并且所述标记系统的第二标记组分与第二捕获分子连 接，使得在两种捕获分子与所述分析物结合后，产生能够检测在包含样 品的溶液中形成的三明治复合物的可测量的信号。

在另一实施方案中，所述标记系统包含与荧光染料或化学发光染料 特别是花青类型染料结合的稀土穴状化合物或稀土螯合物。

在本发明的上下文中，基于荧光的分析包括使用染料，例如其可选 自包含以下的组：FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、异硫 氰酸荧光素(FITC)、IRD-700/800、花青染料如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、 Cy7、占吨(Xanthen)、6-羧基-2’4’7’4,7-六氯代荧光素(HEX)、TET、6-羧 基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基若丹 明(TAMRA)、6-羧基-X-若丹明(ROX)、5-羧基若丹明-6G(R6G5)、6-羧基 若丹明-6G(RG6)、若丹明、若丹明绿、若丹明红、若丹明110、BODIPY 染料如BODIPY TMR、俄勒冈绿、香豆素如伞形酮、苯甲亚胺如Hoechst  33258；菲啶如德克萨斯红、亚基马黄(Yakima Yellow)、Alexa Fluor、PET、 溴化乙锭、吖啶染料、咔唑染料、吩恶嗪染料、紫菜碱染料、聚甲炔染 料等。

在本发明的上下文中，基于化学发光的分析包括基于(24)中描述的化 学发光物质的物理原理使用染料。优选的化学发光染料为吖啶酯。

如本文所提及，“分析”或“诊断分析”可为诊断领域中应用的任何类 型。这样的分析可基于待检测的分析物与具有某种亲和力的一种或多种 捕获探针的结合。考虑到捕获分子与靶标分子或目的分子之间的相互作 用，亲和常数优选大于10⁸M^-1。

在本发明的上下文中，“结合剂分子”为可用于结合来自样品的靶标 分子或目的分子即分析物(即，在本发明的上下文中，PENK及其片段)的 分子。因此，结合剂分子必须在空间上和表面特征如表面电荷、疏水性、 亲水性、有无Lewis供体和/或受体形式上充分成形，以特异性结合所述 靶标分子或目的分子。因此，所述结合可，例如通过离子、范德瓦尔斯、 π-π、σ-π、疏水或氢键相互作用，或者捕获分子与靶标分子或目的分子之 间的两种或更多种上述相互作用的组合来介导。在本发明的上下文中， 结合剂分子可，例如选自包含以下的组：核酸分子、糖类分子、PNA分 子、蛋白、抗体、肽或糖蛋白。优选地，所述结合剂分子为抗体，包括 其与靶标或目的分子具有足够亲和力的片段，并且包括重组抗体或重组 抗体片段，以及所述抗体的化学和/或生物改良的衍生物，或来源于其变 体链的至少12个氨基酸长度的片段。

化学发光标记可为吖啶酯标记、类固醇标记，包括异鲁米诺标记等。

酶标记可为乳酸盐脱氢酶(LDH)、肌磷酸酶(CPK)、碱性磷酸酶、天 冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、酸性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸 脱氢酶等。

在本发明的一个实施方案中，所述两种结合剂中的至少一种与作为 磁性粒子和聚苯乙烯表面的固相结合。

在根据本发明的用于测定样品中的脑啡肽原或脑啡肽原片段的分析 的一个实施方案中，该分析为三明治型分析，优选为全自动的分析。其 可为ELISA全自动的或手动的。其可为所谓的POC检测(现场护理)。自 动或全自动分析的实例包括可用于下述体系中一种的分析：Roche AbbottSiemensBrahmsBiomerieuxAlere测试形式的实例在上文有提供。

在根据本发明的用于测定样品中的脑啡肽原或脑啡肽原片段的分析 的一个实施方案中，所述两种结合剂中的至少一种被标记以被检测。标 记的实例在上文有提供。

在根据本发明的用于测定样品中的脑啡肽原或脑啡肽原片段的分析 的一个实施方案中，所述两种结合剂中的至少一种与固相结合。固相的 实例在上文有提供。

在根据本发明的用于测定样品中的脑啡肽原或脑啡肽原片段的分析 的一个实施方案中，所述标记选自包含以下的组：化学发光标记、酶标 记、荧光标记、放射碘标记。本发明的其他主题为包含根据本发明的分 析的试剂盒，其中所述分析的组分可包含在一个或多个容器中。

在一个实施方案中，本发明的主题为用于实施根据本发明的方法的 现场护理装置(point-of-care device)，其中所述现场护理装置包含针对氨基 酸133-140(LKELLETG,SEQ ID No.13)或氨基酸152-159(SDNEEEVS, SEQ ID NO.14)的至少一种抗体或抗体片段，其中每个所述区域包含至少 4或5个氨基酸。

在一个实施方案中，本发明的主题为用于实施根据本发明的方法的 现场护理装置，其中所述现场护理装置包含针对氨基酸133-140 (LKELLETG,SEQ ID No.13)和氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO. 14)的至少两种抗体或抗体片段，其中每个所述区域包含至少4或5个氨 基酸。

在一个实施方案中，本发明的主题为实施根据本发明的方法的试剂 盒，其中所述现场护理装置包含针对氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID  No.13)或氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO.14)的至少一种抗体 或抗体片段，其中每个所述区域包含至少4或5个氨基酸。

在一个实施方案中，本发明的主题为用于实施根据本发明的方法的 试剂盒，其中所述现场护理装置包含针对氨基酸133-140(LKELLETG, SEQ ID No.13)和氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO.14)的至少两 种抗体或抗体片段，其中每个所述区域包含至少4或5个氨基酸。

实施例

实施例1

抗体的开发

肽

合成了肽(JPT Technologies,Berlin,Germany)。

用于免疫的肽/缀合物：

合成了用于免疫的、具有另外的用于连接所述肽与牛血清白蛋白 (BSA)的N-端半胱氨酸残基的肽(JPT Technologies,Berlin,Germany)。通 过使用硫代-SMCC(Perbio-science,Bonn,Germany)将所述肽与BSA共价 连接。根据Perbio手册实施连接方案。

表1：

用于免疫的肽 脑啡肽原序列 (C)DAEEDD 119-125 (C)EEDDSLANSSDLLK 121-134 (C)LKELLETG 133-140 (C)TGDNRERSHHQDGSDNE 139-155 (C)SDNEEEVS 152-159

根据下述方法产生了抗体：

在第0天和14天以100μg肽-BSA缀合物(在100μl完全弗氏佐剂中 乳化)免疫BALB/c小鼠，并在第21和28天以50μg(在100μl不完全弗 氏佐剂中)免疫。在进行融合实验前3天，动物接受了溶解于100μl盐水 中的50μg缀合物，给出为一次腹膜内和一次静脉内注射。

37℃下将来自免疫的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞与 1ml 50％聚乙二醇融合30s。洗涤后，将细胞接种在96-孔细胞培养平板 中。通过在HAT培养基[RPMI 1640培养基，补充有20％胎牛血清和HAT- 补充物]中培养来挑选杂合子克隆。2周后，将HAT培养基替换为HT培 养基，传代3代，然后回复至正常细胞培养基。

在融合后3周，首先筛选细胞培养上清液的抗原特异性IgG抗体。 将阳性测试微量培养物转移至24-孔板用于繁殖。再次测试后，使用有限 稀释技术来克隆和再克隆所挑选的培养物，并测定了同种型。

(Lane,R.D.“A short-duration polyethylene glycol fusiontechnique for  increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas”,J. Immunol.Meth.81:223-228；(1985),Ziegler,B.et al.“Glutamate  decarboxylase(GAD)is not detectable on the surface of rat islet cells  examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated  cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies”,Horm.Metab.Res.28:11-15, (1996))。

单克隆抗体制备

通过标准抗体制备方法(Marx et al.,Monoclonal Antibody Production (1997),ATLA 25,121)制备抗体，并通过蛋白A-色谱法纯化。基于SDS 凝胶电泳分析的抗体纯度>95％。

抗体的标记和包被。

根据以下方案用吖啶酯标记所有抗体：

标记的化合物(示踪物)：j2100μg(100μl)抗体(1mg/ml,于PBS中,pH  7.4)与10μl吖啶NHS-酯(1mg/ml,于乙腈中,InVent GmbH,Germany)(EP  0353971)混合，并在室温下孵育20min。在Bio-Sil SEC 400-5(Bio-Rad  Laboratories,Inc.,USA)上通过凝胶过滤HPLC来纯化标记的抗体。将纯 化的标记抗体稀释在(300mmol/l磷酸钾、100mmol/l NaCl、10mmol/l  Na-EDTA、5g/l牛血清白蛋白，pH 7.0)中。终浓度为每200μl约800.000 相对光单位(RLU)的标记的化合物(约20ng标记的抗体)。

通过使用AutoLumat LB 953(Berthold Technologies GmbH&Co.KG) 来测量吖啶酯化学发光。

固相抗体(包被的抗体)：

固相：用抗体(1.5μg抗体/0.3ml 100mmol/l NaCl,50mmol/l Tris/HCl, pH 7.8)包被聚苯乙烯管(Greiner Bio-One International AG,Austria)(18h， 室温)。在用5％牛血清白蛋白封闭后，用PBS,pH 7.4洗涤管子，并真空 干燥。

抗体特异性

表2：

用于免疫的肽 前脑啡肽原序列 抗体名称 (C)DAEEDD 119-125 NT-MRPENK (C)EEDDSLANSSDLLK 121-134 NM-MRPENK (C)LKELLETG 133-140 MR-MRPENK (C)TGDNRERSHHQDGSDNE 139-155 MC-MRPENK (C)SDNEEEVS 152-159 CT-MRPENK

按如下所述测定抗体交叉反应：

将于300μl PBS,pH 7,4中的1μg肽移取至聚苯乙烯管中，并在室温 下孵育1h。孵育后，使用于PBS,pH 7,4中的5％BSA将管子洗涤5次(每 次1ml)。添加每种标记的抗体(300μl于PBS中,pH 7.4,800.000RLU/300 μl)，并在室温下孵育2h。在洗涤5次(每次1ml的洗涤溶液(20mmol/l PBS, pH 7.4,0.1％Triton X 100)后，使用AutoLumat LB 953定量剩余的冷光(标 记的抗体)。将MRPENK-肽用作参照物质(100％)。

不同抗体的交叉反应性列出在表3中。

表3：

所有抗体均结合MRPENK肽，这与用于免疫的肽相当。除了NT-MRP  ENK-抗体(与EEDDSLANSSDLLK的10％的交叉反应)外，没有抗体显示 与不用于单个抗体免疫的MR-PENK片段的交叉反应。

脑啡肽原免疫分析：

将50μl的样品(或校准物)吸入至包被的管中，在添加标记的抗体(200 μl)后，将管子在18-25℃下孵育2h。通过用洗涤溶液(20mmol/l PBS,pH  7.4,0.1％Triton X-100)洗涤5次(每次1ml)来去除未结合的示踪物。通过 使用Luminumeter 953和固定浓度的1000pmol/l的MRPENK测量与管子 结合的标记的抗体。不同抗体组合的信号(RLU,1000pmol MRPENK/l)与 噪声(RLU，无MRPENK)比给出在表4中。所有抗体均能够与任何其他 抗体产生三明治复合物。令人吃惊地，通过将MR-MRPENK和 CT-MRPENK抗体组合产生了最强的信噪比(最佳灵敏度)。随后，我们使 用该抗体组合进行MRPENK-免疫分析，用于进一步研究。将 MR-MRPENK抗体用作管子包被抗体，并将CT-MRPENK抗体用作标记 的抗体。

表4：

校准：

使用稀释于20mM K₂PO₄、6mM EDTA、0.5％BSA、50μΜ氨肽酶 抑制剂、100μΜ亮抑酶肽,pH 8.0中的合成的MRPENK的溶液来校准所 述分析。脑啡肽原对照血浆购自ICI-diagnostics,Berlin,Germany。

图1显示了典型的脑啡肽原剂量/信号曲线。

分析灵敏度为20次测定0-校准物(未添加MRPENK)+2SD)5.5 pmol/L。

肌酐清除率

使用MDRD公式(参见Levey et al,2009)测定肌酐清除率。

实施例2：

健康对象的PENK

使用MRPENK分析测量了健康对象(n＝4211,平均年龄为56岁)。均 值为44.7pmol MRPENK/L，最小值为9pmol/L，并且第99百分位数为 80pmol/L。由于分析灵敏度为5.5pmol/L，使用所描述的MRPENK分析， 可检测100％的所有健康对象(参见图2)。

脑啡肽原与具有正常肾功能的健康对象中的肌酐清除率相关。

令人吃惊地，脑啡肽原与健康对象中的肌酐清除率成负相关(r＝-0.33, p<0.0001)，参见图3。男性比女性中的相关系数略高(r＝-0.34相对-0.29, 均为p<0.0001)。这些数据指示了PENK与肾功能之间的强相关性。

图3：健康对象中肌酐清除率相对于PENK的相关性。Y轴：肌酐清 除率的四分位数，x轴：PENK的四分位数。

实施例3：

慢性和急性疾病患者中的PENK与肾功能(肌酐清除率)的相关性。

表5：

在急性疾病中PENK总是与肌酐清除率显著相关，该相关性比慢性疾病 或健康对象中的强。

实施例4：重症患者中的PENK

为了研究急性临床环境中PENK对诊断肾衰竭的诊断性能，我们进 行了以下临床研究：

临床研究

随后将符合败血症定义(Crit Care Med.2008Jan；36(1):296-327)的 101名ED患者安排住院(平均住院5天)，并接受标准的5天护理治疗。 从第1天(ED表现)起产生EDTA-血浆，并在住院期间每天取样一次。用 于后面的分析物测量的样品的冷冻时间少于4h。

患者特征概述在表6中：

表6：

所有患者中的26.7％在住院期间死亡，并被视为治疗未响应者，所有 患者中的73.3％从败血症存活，并被视为治疗响应者。

患败血症的所有患者中的53％具有异常的PENK值>80pmol/L(99 百分位数)，表明PENK不是感染的标记物。

临床研究的结果：

PENK与肌酐清除率高度相关(r＝-0.74,p<0.0001,图4)。

PENK诊断肾功能异常：

基于RIFLE标准(Venkatamaran and Kellum,2007)定义肾功能异常。 如果符合任何RIFLE分类因子，则患者被视为肾功能异常。在研究群体 中，我们在第1天(ED表现)测定了90名对象的RIFLE，39名患者符合 RIFLE分类(具有肾病、肾损伤、肾衰竭、肾功能丧失或终末期肾病的风 险)，并且51名患者无肾功能异常。增加的PENK与肾功能异常显著相 关(p＝<0.0001)(AUC:0.868)(图5和6)。

为了比较肾功能异常的诊断价值，我们使用NGAL作为参照标记 (Soni et al,2010)。使用商购ELISA(NGAL Elisa试剂盒,Bioporto,Gentofte, Denmark)测量了NGAL。

如同PENK，肾功能异常患者中NGAL显著增加(p<0.0001)，诊断肾 功能异常的AUC为0.809(图7和8)。

比较PENK和NGAL显示出，PENK相对于NGAL对诊断肾功能异 常的较强优势：相对于NGAL的32.21，PENK的Chi2值为45.32，显示 PENK诊断品质的40％改善(特异性和灵敏度)(表7)。

表7：

初始PENK具有高度预测性。

我们将初始PENK值与院内死亡率相关联，并比较PENK与APACHE  2败血症评分(参见Knaus et al,1985,2001)和肌酐清除率。PENK对败血 症结果具有高度预后性(参见图9)，且与APACHE 2评分相当(AUC/C指 数0.744(PENK)和0.783(Apache)。如果组合PENK和APACHE 2，则将 具有显著增加的信息(组合的AUC:0.794图10)。相比肌酐清除率，PENK 预后要强得多(AUC 0.638)。令人吃惊地，PENK的预后价值在第一天的 ICU治疗后更强(AUC 0.79)。

在1天的ICU治疗后使用基线样品和1个样品院内死亡预后的阈值分析。

由于PENK的预后能力在开始ICU治疗后一天得到进一步改善，我 们分析了在ICU治疗前当天和开始ICU治疗后1天的系列测量的PENK。 为了说明临床性能，我们使用了100pmol/L阈值的简单阈值分析。

如果患者在住院时小于阈值且在开始ICU治疗后保持小于该阈值， 则死亡率为11％(住院之前和期间得到良好治疗)。如果PENK在两个时 间点大于该阈值，则死亡率为约5倍高(52.5％)(不响应治疗)，并且如果 患者出现的PENK值大于100pmol/l且在ICU治疗期间其PENK水平降 至小于100pmol/l，则死亡率为0(治疗响应者)。这些数据显示PENK与 治疗成功的强相关性，支持其可用于持续治疗(系列测试)。

表8：

图11a-d:患者持续测量的实例。

a)初始PENK<100pmol/L且在住院期间保持<100pmol/L的患者(存 活者)。

b)初始PENK>100pmol/L且未降至值<100pmol/L的患者(住院期 间死亡)。

c)初始PENK>100pmol/L且未降至值<100pmol/L的患者(住院期间 死亡)。

d)初始PENK>100pmol/L、在一天的ICU治疗内PENK值降至值< 100pmol/L的患者(存活者)。

实施例5:使用PENK的系列测量

在实施例4中描述的患者(患败血症、重症败血症或败血性休克的患 者)群体中，在确认当天和随后一天(第1天)测量了血浆PENK。使用100 pmol/L的简单阈值(其接近正常范围的第99百分位数)，将群体分成两组 (大于和小于100pmol/L)，并且相应的7天存活率如Kaplan-Meier图(图 16a和b))所示。在确认当天具有小于100pmol/L的PENK浓度的患者， 其PENK浓度在第1天保持小于100pmol/L，其具有87％的高存活率， 然而，当其PENK浓度在第1天增加超过100pmol/L时，存活率降至67％。 相反，PENK浓度在确认当天大于100pmol/L的患者，其PENK浓度在 第1天保持大于100pmol/L，其具有仅50％的较差存活率，然而，当其 PENK浓度在第1天下降为小于100pmol/L时，存活率为100％。

实施例6：

使用在确认当天测定的实施例4中描述的患者群体(患败血症、重症 败血症或败血性休克的患者)的血浆PENK浓度，通过多元线性回归分析 对其进行分析，所述参数/变量确定PENK浓度的程度。在图17中示出 了偏R²。该分析表明肾功能的测量(在显示肌酐清除率的情况下)为PENK 浓度的最强决定因素。

表9：

表9:在确认7天死亡率当天测定的实施例4中所述的患者群体的变量组 合。

男性中的PENK

使用PENK作为预后标记，在男性群体的医院内死亡预后中，在第 一天(ED表现)的PENK甚至要更强(AUC 0.849,图12)，相对于仅Apache 的0.837，PENK与Apache的组合产生0.89的AUC(图13)。相对于仅肌 酐清除率的0.721，PENK与肌酐清除率的组合产生更优的AUC 0.91的 预后值(图14)。对于整个患者群体，在第一天的ICU治疗后，PENK的 预后值更强(第2天,AUC 0.872)。

附图说明

图1:显示了典型的脑啡肽原剂量/信号曲线。标准曲线脑啡肽原

图2:健康群体中脑啡肽原的频率分布(n＝4211)

PENK的均值为44.7pmol/L，标准偏差＝1.27,该99百分位数(正常 范围上限)为80pmol PENK/L。图2显示了PENK的LN值。

图3:健康对象中肌酐清除率相对于PENK的相关性。Y轴:肌酐清 除率的四分位数,x轴:PENK的四分位数。

图4:PENK与肌酐清除率高度相关(r＝-0.74,p<0.0001)。

图5:增加的PENK与肾功能异常显著相关。

图6:脑啡肽原的受试者/操作者曲线(ROC)，以及根据RIFLE标准(参 见上文)诊断肾功能异常。曲线下的面积(AUC)为0.868，显示了脑啡肽原 对肾功能异常的强诊断能力。

图7:增加的NGAL在具有肾功能异常的患者显著增加。NGAL的正 常范围(范围0.037-0.106μg/mL； http://www.bioporto.com/products/bioporto_diagnostics/ngal_elisa_kits/ngal_ rapid_elisa_kit_ce_ivd)如图中的阴影区域所示。

图8:NGAL的受试者/操作者曲线(ROC)，以及根据RIFLE标准(参 见上文)诊断肾功能异常。我们使用NGAL作为肾功能异常的参照标记。 AUC为0.809，显著小于脑啡肽原的值(AUC 0.868,图6)，指示了脑啡肽 原的增值。

图9:PENK高度预后败血症结果。

图10:如果PENK与APACHE 2组合，将存在明显增加的信息。

图11a):患者(存活者)初始PENK<100pmol/L，且在住院期间保持< 100pmol/L。

图11b):患者(在住院期间死亡)初始PENK>100pmol/L，且未降至 值<100pmol/L。

图11c):患者(在住院期间死亡)初始PENK>100pmol/L，且未降至 值<100pmol/L。

图11d):患者(存活者)初始PENK>100pmol/L，PENK值在一天的 ICU治疗内降至值<100pmol/L。

图12:在男性群体的医院内死亡预后中，在第1天(ED表现)的PENK 甚至要更强。

图13:相对于仅Apache的0.837，PENK和Apache的组合产生了0.89 的AUC。

图14:相对于仅肌酐清除率的0.721，PENK和肌酐清除率的组合产 生了AUC 0.91的更优的预后值。

图15:图15A/B:分别为通过急性肾功能异常等级分类的败血症患 者中的血浆PENK(A)和NGAL(B)的浓度。0＝无肾功能异常；R＝风 险；I＝损伤；F＝衰竭；L＝丧失。分类定义如下： (http://en.wikipedia.org/wiki/Acute_kidney_injury):风险:6小时的GFR下 降>25％,血清肌酸酐增加1.5倍或尿素产生<0.5ml/kg/hr；损伤:12小时 的GFR下降>50％,肌酸酐翻倍或尿素产生<0.5ml/kg/hr；衰竭:24小时的 GFR下降>75％,肌酸酐为3倍或肌酸>355μmol/l(增加>44)(>4mg/dl) 或者尿素输出小于0.3ml/kg/hr；丧失:多于4周的持续性AKI或肾功能 完全丧失。PENK(参见图2)和NGAL的正常范围(范围0.037-0.106μg/mL； http://www.bioporto.com/products/bioporto_diagnostics/ngal_elisa_kits/ngal_ rapid_elisa_kits_ce_ivd)浓度如图中的阴影区域所示。该图说明甚至在他们 无肾功能异常时，败血症患者中的NGAL浓度仍大幅上升，而对于PENK 来说却并非如此。

图16:基于确认当天和接下来一天(第1天)其血浆PENK浓度的危重 患者的存活率。图A:在左侧，示出了分别在确认时具有大于和小于100 pmol/L的PENK浓度的那些患者亚群的Kaplan-Meier图。在右侧，示出 了在第1天分别具有大于和小于100pmol/L的PENK浓度的那些患者亚 群的Kaplan-Meier图，所述患者在确认当天具有小于100pmol/L的PENK 浓度。图B:在左侧，示出了分别在确认时具有大于和小于100pmol/L 的PENK浓度的那些患者亚群的Kaplan-Meier图。在右侧，示出了在第 1天分别具有大于和小于100pmol/L的PENK浓度的那些患者亚群的 Kaplan-Meier图，所述患者在确认当天具有大于100pmol/L的PENK浓 度。

图17:预测PENK的多元线性回归。注意：由于与MAP或肌酐清除 率的高相关性而剔除了BP、肌酸酐和尿素。使用如下列出的变量计算线 性回归：Log(PENK)＝a*肌酸酐清除+b*心血管+c*MAP+等。偏R²给出了每个变量贡献至PENK所达到的程度，即肌酸酐清除率最强，并 具有稍大于0.15的偏R²，即肌酸酐清除率占PENK中观察到的变异性的 约15％。重要的是，年龄、性别等对PENK浓度无显著影响。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.用于(a)诊断或监测对象的肾功能、或者(b)诊断对象的肾功能异 常、或者(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风险、或者(d)预测或 监测治疗或干预的成功的方法，其中所述不良事件选自包含以下的组： 包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或 由包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死 亡，所述方法包括：

·测定获自所述对象的体液中的脑啡肽原或其具有至少5个氨基 酸的片段的水平；和

(a)将所述脑啡肽原或其片段的水平与对象的肾功能相关联，或 者

(b)将所述脑啡肽原或其片段的水平与肾功能异常相关联，其中 升高的大于某个阈值的水平预测或诊断所述对象的肾功能异常，或者

(c)将所述脑啡肽原或其片段的水平与所述患病对象中的不良事 件的风险相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测所述不良事件 的风险增加，或者

(d)将所述脑啡肽原或其片段的水平与患病对象的治疗或干预的 成功相关联，其中小于某个阈值的水平预测治疗或干预的成功,

其中所述脑啡肽原或片段选自包含以下的组：SEQ ID No.1、SEQ  ID No.2、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、 SEQ ID No.10和SEQ ID No.11。

2.如权利要求1所述的方法，其中通过使用脑啡肽原或其具有至 少5个氨基酸的片段的结合剂来测定脑啡肽原或其具有至少5个氨基 酸的片段的水平。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述结合剂选自包含以下 的组：与脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段结合的抗体、抗体 片段或非Ig支架。

4.用于(a)诊断或监测对象的肾功能、或者(b)诊断对象的肾功能异 常、或者(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风险、或者(d)预测或 监测权利要求1-3中任一项所述的治疗或干预的成功的方法，其中所 述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾 病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期 肾病在内的肾功能异常导致的死亡，所述方法包括：

·通过使用与获自所述对象的体液中的脑啡肽原(PENK)或其片 段的氨基酸序列中的区域结合的至少一种结合剂，测定免疫反应性分 析物的水平；以及

(a)将所述免疫反应性分析物的水平与对象的肾功能相关联，或 者

(b)将所述免疫反应性分析物的水平与肾功能异常相关联，其中 升高的大于某个阈值的水平预测或诊断所述对象的肾功能异常，或者

(c)将所述免疫反应性分析物的水平与所述患病对象中的不良事 件的风险相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测所述不良事件 的风险增加，或者

(d)将所述免疫反应性分析物的水平与患病对象的治疗或干预的 成功相关联，其中低于某个阈值的水平预测治疗或干预的成功，

其中所述脑啡肽原或片段选自包含以下的组：SEQ ID No.1、SEQ  ID No.2、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、 SEQ ID No.10和SEQ ID No.11。

5.如权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述至少一种结合 剂与选自包含SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的组的 氨基酸序列中的区域结合，优选不与脑啡肽—[Met]脑啡肽SEQ ID  No:3和[Leu]脑啡肽SEQ ID No:4结合，优选与选自包含SEQ ID No.1、 2、5、6、7、8、9和10的组的序列中的区域结合，优选与选自包含 SEQ ID No.2、5、6和10的组的序列中的区域结合，优选与SEQ ID No. 6结合。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阈值为80 pmol/L。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中利用免疫分析测量 了脑啡肽原的水平，并且所述结合剂为与脑啡肽原或其具有至少5个 氨基酸的片段结合的抗体或抗体片段。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中使用了分析，其包 含与脑啡肽原区中的两个不同区域即氨基酸133-140(LKELLETG, SEQ ID NO.13)和氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID No.14)结合的 两种结合剂，其中所述区域中的每个包含至少4或5个氨基酸。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中使用了用于测定脑 啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平的分析，并且其中所述 测定的测定灵敏度能够定量健康对象的脑啡肽原或脑啡肽原片段，并 且<15pmol/L。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述体液可选自 包含以下的组：血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(csf)和唾液。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中另外测定了选自 包含以下的组的至少一项临床参数：年龄、BUN、NGAL、肌酐清除 率、肌酸酐和Apache评分。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中在一名患者中实 施脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的所述测定多于一次。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中为了评估所述对 象对采用的预防性和/或治疗性措施的反应而进行所述监测。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其用于将所述对象分 级为风险组。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述脑啡肽原或 其片段的水平与患病对象的死亡或不良事件的风险相关，其中升高的 大于某个阈值的水平预测死亡或不良事件的风险增加，并且其中所述 患病对象为男性。

16.用于进行权利要求1-15中任一项所述的方法的现场护理装 置，其中所述现场护理装置包含至少两种针对氨基酸133-140 (LKELLETG,SEQ ID No.13)和氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID  NO.14)的抗体或抗体片段。

17.用于进行权利要求1-15中任一项所述的方法的试剂盒，其中 所述现场护理装置包含至少两种针对氨基酸133-140(LKELLETG, SEQ ID No.13)或氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO.14)的抗体 或抗体片段。