使用SMAD3抑制剂对癌症的治疗

摘要

本发明基于发现TGF-β信号传导的一种重要的下游介质Smad3，在癌症的发生和发展中起到至关重要的作用。因此，本申请提供了通过抑制Smad3信号传导，例如通过给予Smad3抑制剂SIS3，来治疗癌症的新方法。还提供了通过抑制Smad3信号传导来治疗癌症的组合物和试剂盒。

说明书

相关申请

本申请要求2012年10月26日提交的美国临时专利申请第 61/719,114号的权益，其内容通过引用全文并入用于所有目的。

发明背景

癌症是一大类能够影响身体任何部位的疾病的通用术语。癌症的一 个典型特征是生长超过其通常界限的异常细胞的快速增殖。然后，癌细 胞能够侵入身体的邻近部位，并以被称为转移的程序扩散其它器官。转 移是癌症致死的主要原因，并且还能由癌症周围被称为癌症基质细胞的 细胞或癌症微环境促进。

根据世界卫生组织(WHO)，癌症是世界范围内死亡的主要原因，在 2008年导致760万人死亡(占所有死亡的约13％)。肺癌、胃癌、肝癌、 结肠癌和乳腺癌造成每年最多的癌症死亡。尽管在生物医学中进行了深 入研究工作并取得了技术进展，但是在世界范围内的癌症致死预计将持 续增加，估计2030年有1310万人死亡。

由于癌症的普遍及其对人类的重大影响，迫切需要开发出用于癌症 治疗的新的且更有效的策略。本发明通过使用Smad3抑制剂来抑制癌细 胞生长和癌症微环境的支持功能而提供了新的抗癌治疗，解决了该需求 和它相关的需求。

发明概述

本发明基于发现Smad3介导的细胞信号传导在癌症的发生和发展中 起到至关重要的作用，涉及用于抑制细胞增殖的方法和组合物，尤其是 响应于TGF-β刺激的类型包括癌细胞和癌症基质细胞，如血管内皮细胞、 成纤维细胞、中性粒细胞、酸性粒细胞、肥大细胞、T细胞和子集、B细 胞、巨噬细胞和NK细胞。

因此，在第一方面，本发明提供了抑制细胞增殖的方法，包括但不 限于抑制癌细胞增殖、肿瘤生长、侵入和转移。所述方法包括将细胞与 有效量的Smad3抑制剂接触的步骤，所述Smad3抑制剂可以是小分子抑 制剂(如SIS3或合成的或天然存在的另一种化学物质，例如来自草药的天 然提取物)或大分子(如针对Smad3的灭活抗体、多肽、siRNA、microRNA、 miniRNA、incRNA或反义寡核苷酸)。在一些实施方案中，所述细胞是癌 细胞，其可以位于人体内。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌或黑素 瘤，包括原发癌和转移癌。还由Smad3抑制剂所靶向的是癌症组织或癌 症基质细胞周围的多种细胞，即人体内原发癌或转移癌的癌症微环境内 的细胞，包括癌症微环境内的血管内皮细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、 酸性粒细胞、肥大细胞、T细胞和子集、B细胞、巨噬细胞和NK细胞。 在一些实施方案中，所靶向的细胞是人体内的转移癌细胞，诸如淋巴结、 肝脏、肺脏、骨骼、肾脏、脑、胃或结肠组织内的细胞。在一些实施方 案中，接触步骤可以包括皮下、肌肉内、静脉内、腹膜内或经口给予。 例如，Smad3抑制剂可以以溶液、粉剂、糊剂/膏剂、片剂或胶囊剂的形 式给予。

在第二方面，本发明提供了用于抑制细胞增殖的组合物，例如用于 通过阻抑癌细胞生长和通过阻断癌症微环境内的癌症支持细胞来治疗癌 症，从而预防癌症侵入和转移。所述组合物包含有效量的Smad3抑制剂 和药学可接受的赋形剂。在某些情况下，所述组合物经配制用于皮下、 肌肉内、静脉内、腹膜内、局部或经口给予。例如，所述组合物可以处 于溶液、粉剂、糊剂/膏剂、片剂或胶囊剂的形式。

在第三方面，本发明提供了用于抑制细胞增殖的试剂盒，例如用于 通过阻抑癌细胞生长来治疗癌症。所述试剂盒含有容器，其包含上文所 述的组合物。在一些实施方案中，所述组合物经配制用于皮下、肌肉内、 静脉内、腹膜内、局部或经口给予，例如，所述组合物可以处于溶液、 粉剂、糊剂/膏剂、片剂或胶囊剂的形式。任选地，所述试剂盒还将包含 用于给予第一和第二组合物的说明书手册。

在第四方面，本发明提供了鉴定Smad3抑制剂的方法。这种方法中 的一种基于Smad3蛋白和抑制剂之间的物理相互作用，因此包括以下步 骤：(1)在允许Smad3和潜在抑制剂结合的条件下，将Smad3蛋白与测试 化合物接触；和(2)检测Smad3-测试化合物结合的水平，其中结合升高的 水平超过非特异性背景水平或阴性对照水平表明所测试化合物为可能的 Smad3抑制剂。

另一种筛选方法基于测试化合物对Smad3信号传导的直接抑制作用 的检测。可以使用体外和体内测定。例如，可以将表达Smad3和TGF-β 受体并因而响应于TGF-β刺激的细胞与测试化合物接触，然后监测细胞 的增殖/存活率，并将其与没有接触测试化合物的对照细胞相比较。阻抑 的细胞生长率或增加的细胞死亡是化合物为Smad3抑制剂的指征。可选 择地，还可以监测由于TGF-β信号传导而引起的下游改变，例如Smad3 蛋白磷酸化的增加、ERK1/2激活、细胞周期蛋白D1表达、AKT和mTor 激活，从而提供特定候选化合物是否可以为Smad3抑制剂的指征。无论 何时观察到经由Smad3的信号传导阻抑，测试化合物都被鉴定为潜在的 Smad3抑制剂。

当在上述筛选测定系统中使用时，Smad3蛋白可以重组产生或在细 胞内内源表达，并且测定可以在基于无细胞或全细胞的环境下进行。已 经鉴定为Smad3抑制剂的化合物可以进行进一步的测试以确认其抑制作 用。

附图说明

图1.缺失Smad3的小鼠从第14天开始防止了肺癌(LLC)生长。注 意，与Smad3WT小鼠相比，通过皮下植入LLC癌细胞(300万个细胞/ 小鼠)之后，第14-21天通过活体成像(A,B)以及定量肿瘤体积(C)和肿瘤重 量(D)，在Smad3KO小鼠中没有检测到癌症，表明Smad3依赖的微环境 决定了癌症生长，N＝6。

图2.缺失Smad3的小鼠防止了黑素瘤(B16F10)生长、侵入、转移 和死亡。注意，与Smad3WT小鼠相比，Smad3KO小鼠防止了皮下B16F10 细胞(300万个细胞/小鼠)生长(A-C)、侵入(未显示)、转移和死亡(C)。这 通过静脉内注射B16F10细胞(300万个细胞/小鼠)进一步证实，表明 Smad3KO小鼠在很大程度上防止了肺转移瘤的形成(E和F)。来自该研 究的结果证实，Smad3依赖的微环境促进了癌症生长、侵入、转移和死 亡，N＝6。

图3.活体成像分析表明，Smad3抑制剂(SIS3)在同类系小鼠模型中 以剂量依赖的方式抑制黑素瘤(B16F10)生长，N＝5。

图4.Smad3抑制剂(SIS3)在同类系小鼠模型中以剂量依赖的方式抑 制癌症生长，如通过皮下黑素瘤(B16F10,300万个细胞/小鼠)中显著降低 的癌症重量所证实的，N＝5。

图5.Smad3抑制剂(SIS3)在同类系小鼠模型中以剂量依赖的方式 抑制癌症生长(A)，并防止皮下黑素瘤(B16F10,300万个细胞/小鼠)诱导的 癌症侵入和转移以及死亡(B)。注意，通过SIS3处理使癌症侵入皮下组织 或身体肌肉(*)，并转移至淋巴结(LN)、肺脏和结肠减弱，N＝5。

图6.SIS3防止了LLC肺癌生长。(A)活体成像分析，(B)肿瘤体积 的定量分析。结果表明，Smad3抑制剂(SIS3)在同类系小鼠模型中以剂量 依赖的方式抑制肺癌(LLC)生长。注意，大多数癌症在用5-10μg/g体重 剂量的SIS3处理10天以后均变得不可检测，N＝5。

图7.Smad3抑制剂(SIS3)在同类系小鼠模型中以剂量依赖的方式 防止癌症生长，如通过皮下肺癌(LLC,200万个细胞/小鼠)诱导的肿瘤重 量(A)和死亡(B)所证实的，N＝5。

定义

本文使用的术语“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”指对目标生物 学过程如细胞信号传导、细胞增殖、致瘤性和转移潜能的任何可检测的 副作用。通常，抑制反映为与对照相比时，目标过程(例如Smad3介导的 信号传导或癌症增殖)或上文提到的任一个下游参数降低至少10％、20％、 30％、40％或50％。

术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA) 或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，所述术语包括含有天然核 苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参照核酸相似的结合特性 且以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另外指出，具体的 核酸序列还隐含地包括其保守型修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等 位基因、直系同源物、单核苷酸多态性(SNP)和互补序列，以及明确指明 的序列。具体地，可以通过产生一个或多个所选的(或全部)密码子的第三 位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基所取代的序列来实现简并密码子取代 (Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem. 260:2605-2608(1985)；以及Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98 (1994))。术语核酸与基因、cDNA以及基因编码的mRNA可交换使用。

术语“基因”表示参与产生多肽链的DNA区段。其可以包括编码区之 前和之后的区域(前导区和尾区)，以及单独的编码区段(外显子)之间的间 插序列(内含子)。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸以及以与天然存在的 氨基酸相似的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在 的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸以及随后经修饰的那些氨基酸，例 如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与 天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即，与氢、羧基、 氨基和R基相连的α碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋 氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R基(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主 链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物” 是指这样的化合物，所述化合物具有与氨基酸的通常化学结构不同的结 构，但是以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥功能。

本领域内有多种已知的方法，允许以位点特异的方式将非天然氨基 酸衍生物或类似物并入多肽链中，参见例如WO 02/086075。

在本文中，可以通过公知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学 命名委员会推荐的单字母符号来提及氨基酸。同样，可以通过核苷酸的 公认的单字母代码来提及核苷酸。

“多肽”、“肽”以及“蛋白”在本文可互换使用，是指氨基酸残基的聚合 物。所有三个术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的 氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合 物和非天然存在的氨基酸聚合物。本文所用的这些术语包括任何长度的 氨基酸链，包括全长蛋白，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。

本文所使用的术语“有效量”是指所给予的物质产生疗效的量。效果 包括疾病/病症及相关并发症的症状发展至任何可检测的程度的预防、矫 正或抑制。确切的量将取决于治疗剂的性质、给予方式和治疗目的，并 且本领域技术人员利用已知技术即可确定(参见，例如Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3,1992)；Lloyd,The Art,Science and  Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；以及Pickar,Dosage  Calculations(1999))。

“表达盒”是重组或合成产生的核酸构建体，其具有允许特定多核苷 酸序列在宿主细胞中转录的一系列特定的核酸元件。表达盒可以是质粒、 病毒基因组或核酸片段的一部分。通常，表达盒包括与启动子可操作地 连接的待转录的多核苷酸。

“抗体”是指基本上由一种或多种免疫球蛋白基因编码的多肽或其片 段，其能特异性结合并识别抗原，如Smad3蛋白。公认的免疫球蛋白基 因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变 区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，其依次限定了免疫 球蛋白类别，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由两对 相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70 kD)。每条链的N-端限定约100至110或更多氨基酸的可变区，其主要负 责抗原识别。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别指这些轻链和重链。

抗体可以多种形式存在。例如，作为完整的免疫球蛋白或作为通过 多种肽酶消化而产生的多种表征良好的片段。因此，例如，胃蛋白酶在 铰链区的二硫键以下消化抗体，从而产生Fab二聚体F(ab)'₂，所述Fab 自身是通过二硫键与V_H-C_H1连接的轻链。F(ab)'₂可以在温和的条件下被 还原，从而破坏铰链区的二硫键，进而将(Fab')₂二聚体转化为Fab'单体。 Fab'单体在本质上是具有一部分铰链区的Fab(参见，Paul(Ed.) Fundamental Immunology,第三版,Raven出版社,NY(1993))。尽管根据完 整抗体的消化来定义不同的抗体片段，但本领域技术人员应当理解的是， 可以通过化学方法从头合成或通过利用重组DNA技术合成这样的片段。

通过重组技术对抗体进行进一步的修饰也是本领域内熟知的。例如， 嵌合抗体将来自一种动物的抗体的抗原结合区(可变区)与来自另一种动 物的抗体的恒定区组合。通常，抗原结合区来自非人动物，而恒定区则 来自人抗体。人恒定区的存在降低了抗体被人接受者排斥为外来物的可 能性。另一方面，“人源化”抗体将甚至更小部分的非人抗体与人成分组 合。通常，人源化抗体包含被移植至人抗体合适的框架区上的非人抗体 的高变区或互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的或经一个或 多个氨基酸取代而修饰的，例如修饰成与人免疫球蛋白更加类似。嵌合 和人源化抗体都利用重组技术产生，这些技术是本领域内熟知的(参见例 如Jones et al.(1986)Nature 321:522-525)。

因此，本文使用的术语“抗体”还包括抗体片段，其通过对全抗体的 修饰或利用重组DNA方法从头合成的抗体而产生(例如，单链Fv、嵌合 或人源化抗体)。

本文使用的术语“SIS3”是指TGF-β1依赖的Smad3磷酸化和Smad3 介导的细胞信号传导的能穿透细胞的选择性抑制剂。其为分子量为453.5， 化学名称为(6,7-二甲氧基-2-((2E)-3-(1-甲基-2-苯基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶 -3-丙基-2-烯酰))-1,2,3,4-四氢异喹啉)且具有以下所示的化学结构的化学 物质：

SIS可以按照公开的2-(N-甲基吲哚基)丙烯酸方法，随后与对应的胺缩合， 由吲哚衍生物合成。参见，例如，Jinnin et al.2006Mol.Pharmacol.69:597。 仅为了基本的生物学研究目的，SIS3还可从多个销售商处商购获得，如 Santa Cruz、Sigma和Millipore。

发明详述

I.引言

癌症仍然是人类死亡的主要原因之一。但是，用细胞毒性药物治疗 癌症通常无效，且会呈现出较高的细胞毒性以及重度的全身副作用。越 来越多的证据表明，转化生长因子-β(TGF-β)在已建立的癌症中充当有效 的肿瘤促进剂。癌症产生的TGF-β通过组成型诱导上皮细胞至间叶细胞 的转换和肿瘤相关的血管生成，以及通过阻抑癌症微环境中的抗肿瘤免 疫来驱动恶性发展。基于该信息，研究人员和药物公司已开发了通过利 用可溶的TGF-β受体II、小分子ALK5激酶抑制剂、以及中和抗体来靶 向TGF-β受体的多种治疗方法。它们当中的一些被证明在早期临床前研 究中是有前景的，包括SD-093、SD-208和SM16。但是，TGF-β是基本 的抗炎细胞因子，而一般在TGF-β受体水平上的TGF-β阻滞由于可能造 成自身免疫疾病也是有疑问的。因此，对TGF-β信号传导的下游的研究 以鉴定与癌症进程相关的更多的特异性治疗靶标，可在临床上提供更好 的抗癌治疗。

发明人小组从最近的研究中得到的新发现是，无Smad3(TGF-β信号 传导的关键的下游介质)的小鼠防止癌症生长、侵入、转移(例如至淋巴结、 肝脏、肺脏、胃和结肠组织)以及在两个高侵入性癌症模型(包括肺癌(LLC) 和黑素瘤(B16F10))中的死亡。该发现表明，宿主中Smad3依赖的癌症 微环境决定了癌症发展或消退。这还表明，靶向癌症微环境(以及癌症) 上的Smad3可提供更好的抗癌治疗。进行研究以测试通过在小鼠建立的 黑素瘤(B16F10)中用Smad3抑制剂(SIS3)靶向Smad3的这一新的治疗策 略。与在Smad3KO小鼠中所见的结果相似，用SIS3治疗几乎阻抑癌症 生长、侵入和转移，以及阻止癌症死亡。因此，SIS3是靶向TGF-β/Smad3 的新的抗癌药物，其在临床上是高度相关的，并可能产生新的、更安全 且更有效的抗癌疗法。

II.通用重组技术

重组遗传学领域中公开通用方法和技术的基础教科书包括Sambrook  and Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版，2001)； Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；以及 Ausubel et al.,eds.,Current Protocols in Molecular Biology(1994)。

对于核酸，以千碱基(kb)或碱基对(bp)提供大小。这些是由琼脂糖或 丙烯酰胺凝胶电泳、测序的核酸或公开的DNA序列估算。对于蛋白，以 千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数提供大小。蛋白大小由凝胶电泳、测序的 蛋白、衍生的氨基酸序列或公开的蛋白序列估算。

无法商购的寡核苷酸可以化学合成，例如根据由Beaucage& Caruthers(Tetrahedron Lett.22:1859-1862,1981)首次描述的固相亚磷酰胺 三酯法、使用Van Devanter等(.,Nucleic Acids Res.12:6159-6168(1984)) 所描述的自动合成仪。利用任何本领域内公知的策略，例如天然丙烯酰 胺凝胶电泳或Pearson&Reanier(J.Chrom.255:137-149,1983)所描述的 阴离子交换HPLC进行寡核苷酸的纯化。

目的基因、编码目的多肽的多核苷酸和合成的寡核苷酸的序列可以 在克隆或亚克隆后利用例如Wallace等(Gene 16:21-26,1981)的用于测序 双链模板的链终止法来证实。

III.Smad3介导的信号传导的抑制剂的鉴定

Smad3活性的抑制剂几乎可以具有任何化学和结构性质：它们可以 是多肽、多核苷酸和小分子。只要它们具有确认的针对Smad3(作为TGF-β 的下游信号转导介质)的抑制作用，这类抑制剂就可以用于抑制癌细胞增 殖，因而可用于治疗癌症。

A.Smad3结合测定

基于Smad3和候选化合物之间的结合，体外测定可用于筛选Smad3 信号传导的潜在抑制剂。一旦在结合测定中鉴定出化合物，则可以进行 进一步的测试以确认和验证化合物抑制Smad3介导的信号传导的能力。 通常，此类测定可以在存在Smad3蛋白或其片段(例如，重组产生的Smad3 蛋白或片段)的情况下，在允许其与潜在的结合伴侣结合的条件下进行。 为方便起见，Smad3蛋白或候选化合物可被固定化至固相支持物上和/或 用可检测部分标记。还可以使用第三分子如针对Smad3蛋白的抗体(其可 以包括可检测标记物)以便于检测。

在某些情况下，结合测定可以在无细胞环境中进行，而在其它情况 下，结合测定可以例如利用重组或内源表达合适的Smad3多肽的细胞， 在细胞内或在细胞表面上进行。

B.Smad3磷酸化测定

Smad3介导的细胞信号传导的抑制剂由于其抑制TGF-β信号传导的 能力是有用的，尤其是作为患有被TGF-β信号传导加重的癌症的患者的 抗癌疗法。可以在体外或体内进行验证抑制剂的此类抑制作用的测定。 体外测定通常包括将培养的细胞暴露于抑制剂并监测细胞中随后的生物 学和生物化学变化。例如，在暴露于0.1-20μg/ml的抑制剂0.5-48小时之 后，利用诸如直接细胞数计数、BrdU或H³-胸苷并入、四唑盐3,[4,5-二 甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)细胞增殖测定、3-(4,5-二甲基 噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(MTS)细胞增殖 测定、鸡胚尿囊膜(CAM)测定、TUNNEL测定、膜联蛋白V结合测定等 的方法，检测合适的细胞(诸如表达Smad3、TGF-β受体、并响应于TGF-β 刺激的细胞)的增殖/存活状态。还可以监测由于TGF-β信号传导而引起的 其它下游改变，例如Smad3蛋白磷酸化、ERK1/2激活、细胞周期蛋白 D1表达和AKT激活，以提供通过Smad3阻抑信号传导的指征。此外， 癌细胞的致瘤性和/或转移潜能也是监测的有用参数，并且可以通过诸如 集落形成测定或软琼脂测定的方法来测试。当观察到Smad3介导的信号 传导下降至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或 更多(如通过前述的任一个参数所指示的)，则检测到抑制作用。

还可以在体内测定中验证本发明的Smad3信号传导抑制剂的抗癌作 用。例如，可以将Smad3抑制剂注射入免疫系统受损并进而允许移植肿 瘤的动物(例如，裸鼠、SCID小鼠或NOD/SCID小鼠)中。注射方法本质 上可以是皮下、肌肉内、静脉内、腹膜内或肿瘤内。随后通过多种方式 来监测肿瘤发展，如与具有相似肿瘤但未给予抑制剂的对照动物组相比 较，测量肿瘤体积和评分由于转移引起的次级损伤，。本公开的实施例 部分提供了一些示例性体内测定的详细描述。当在测试组中建立对肿瘤 生长或转移的负效应则检测到抑制作用。优选地，负效应是降低至少 10％，更优选地，降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％ 或90％。

如上文所述，Smad3抑制剂可以具有不同的化学和结构特征。例如， 抑制剂可以是保留Smad3与其上游或下游信号传导分子的结合能力的非 功能性Smad3突变体、干扰Smad3介导的信号传导的针对Smad3的抗 体、或简单阻碍Smad3与其上游或下游信号传导分子之间的相互作用的 任何小分子或大分子。本质上，任何化合物都可以作为Smad3信号传导 的潜在抑制剂来测试。通常最优选的是能在水溶液或有机(尤其是基于 DMSO的)溶液中溶解的化合物。可以通过筛选含有大量可能有效的化合 物的组合文库来鉴定抑制剂。可以在本文所述的一种或多种测定中筛选 此类组合的化学文库，以鉴定展现出需要的特征活性的那些文库成员(具 体的化学种类或亚类)。因而鉴定的化合物可以作为常规“重要化合物” 或其自身可以用作潜在的或真正的治疗剂。

组合化学文库的制备和筛选是本领域技术人员公知的。这样的组合 化学文库包括但不限于肽文库(参见例如，美国专利5,010,175,Furka,Int.J. Pept.Prot.Res.37:487-493(1991)和Houghton et al.,Nature 354:84-88 (1991))以及碳水化合物文库(参见例如，Liang et al.,Science, 274:1520-1522(1996)和美国专利5,593,853)。还可以使用用于产生化学多 样性文库的其它化学物质。这样的化学物质包括但不限于：类肽(PCT公 开号WO 91/19735)、编码的肽(PCT公开号WO 93/20242)、随机生物寡 聚物(PCT公开号WO 92/00091)、苯二氮卓类(美国专利号5,288,514)、诸 如乙内酰脲、苯二氮卓类和二肽的反向聚体(diversomer)(Hobbs et al., Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90:6909-6913(1993))、插烯多肽(Hagihara et al.,J. Amer.Chem.Soc.114:6568(1992))、具有β-D-葡萄糖基架的非肽类模拟肽 (Hirschmann et al.,J.Amer.Chem.Soc.114:9217-9218(1992))、类似的有机 合成的小化合物文库(Chen et al.,J.Amer.Chem.Soc.116:2661(1994))、寡 氨基甲酸酯(Cho et al.,Science 261:1303(1993))、和/或肽磷酸酯(Campbell  et al.,J.Org.Chem.59:658(1994))、核酸文库(参见，Ausubel,Berger and  Sambrook,均同上)、肽核酸文库(参见，例如美国专利5,539,083)、抗体 文库(参见，例如Vaughn et al.,Nature Biotechnology,14(3):309-314(1996) 和PCT/US96/10287)、小有机分子文库(参见，例如苯二氮卓类 (benzodiazepines),Baum C&EN,Jan 18,page 33(1993)；类异戊二烯，美国 专利5,569,588；噻唑啉酮和间噻唑酮(metathiazanones),美国专利 5,549,974；吡咯烷，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉基化合物,美 国专利5,506,337；以及苯二氮卓类,美国专利5,288,514)。

IV.药物组合物以及给予

本发明还提供了预防性或治疗性应用的药物组合物或生理组合物， 其包含有效量的抑制Smad3介导的信号传导并因而抑制癌症发展的化合 物，诸如显性负性Smad3突变体或其编码核酸、编码反义或miRNA的 核酸、miniRNA、靶向Smad3的长非编码RNA、失活抗Smad3抗体、小 化学物质、肽、蛋白、草药的天然提取化合物或SIS3。此类药物组合物 或生理组合物还包含一种或多种药学或生理可接受的赋形剂或载体。本 发明的药物组合物适用于多种药物递送系统。用于本发明中的合适制剂 参见Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack出版公司,Philadelphia, PA,第17版(1985)。药物递送方法的简要综述，参见Langer,Science 249: 1527-1533(1990)。

本发明的药物组合物可以通过多种途径给予，例如经口、皮下、经 皮、肌肉内、静脉内或腹膜内。给予药物组合物的优选途径是对于70kg 的成年人，以每天约0.01-2500mg、优选2.5-500mg的Smad3抑制剂的 日剂量，局部递送至患有被TGF-β/Smad3介导的信号传导加重的病症的 器官或组织(例如，经肿瘤内注射如肿瘤)。合适的剂量可以单日剂量或作 为以适当间隔提供的分剂量，例如每天2次、3次、4次或更多次子剂量 来给予。

为了制备含有Smad3抑制剂如SIS3的药物组合物，使用惰性且药学 可接受的载体。药物载体可以为固体或液体。固体形式的制剂包括例如 粉剂、片剂、可分散的颗粒剂、胶囊剂、扁囊剂和栓剂。固体载体可以 是还可以充当填充剂、增味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、片 剂崩解剂的一种或多种物质。其还可以是包膜材料。

在粉剂中，载体通常是细碎的固体，其处于与细碎的活性成分如SIS3 的混合物中。在片剂中，活性组分(TGF-β/Smad3信号传导的抑制剂)与具 有必要的结合性质的载体以合适的比例混合，并压缩成所需的形状和尺 寸。

为了制备栓剂形式的药物组合物，首先熔化低熔点的蜡如脂肪酸甘 油酯和可可油的混合物，并通过例如搅拌，将活性组分分散于其中。然 后将熔化均匀的混合物倒入尺寸方便的模具中让其冷却和固化。

粉剂和片剂优选含有约5％至约70％重量的Smad3介导的信号传导 的抑制剂的活性组分。合适的载体包括例如，碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、 乳糖、糖、果胶、葡聚糖、淀粉、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素 钠、低熔点蜡、可可油等。

药物组合物可以包括Smad3抑制剂的活性化合物和作为提供胶囊剂 的载体的包膜材料的制剂，其中抑制剂(有或没有其它载体)被载体包围, 因而使得载体与化合物结合。以相似的方式，还可以包括扁囊剂。片剂、 粉剂、扁囊剂和胶囊剂可以用作适于经口给予的固体剂型。

液体药物组合物包括例如，适于经口或肠胃外给予的溶液、悬浮剂 和适于经口给予的乳剂。活性成分(例如Smad3抑制剂如SIS3)的无菌水 溶液、或活性成分在包括水、缓冲水、盐水、PBS、乙醇或丙二醇的溶剂 中的无菌溶液是适于肠胃外给予的液体组合物的实例。组合物按需要可 以含有药学可接受的辅助物质以接近生理条件，例如pH调节和缓冲剂、 张力调节剂、润湿剂、洗涤剂等。

无菌溶液可以通过将活性成分(例如Smad3信号传导抑制剂)溶解在 所需的溶剂系统中，然后使得到的溶液通过膜过滤器以对其进行灭菌， 或者可选择地，通过在无菌条件下将无菌化合物溶解在之前已灭菌的溶 剂中来制备无菌溶液。所得到的水溶液可以包装待用，或冻干，将冻干 的制剂在给予前与无菌水性载体组合。制剂的pH通常为3至11、更优 选地为5至9，最优选地为7至8。

可给予含有Smad3抑制剂的药物组合物，用于预防性和/或治疗性治 疗。在治疗应用中，以足以预防、治愈、逆转、或至少部分减缓或阻止 病症及其并发症的症状(如某些类型的癌症的发作、发展和转移)的量，将 组合物给予已患可被TGF-β/Smad3介导的细胞信号传导加重的病症的患 者。足以实现这一目的的量被定义为“治疗有效剂量”。用于该用途的有 效量将取决于疾病或病症的严重程度以及患者的体重和一般状态，但是 对于70kg的患者，通常范围为每天约0.1mg至约2,500mg的抑制剂， 对于70kg的患者，更常用的为每天约2.5mg至约500mg的抑制剂。

在预防性应用中，以足以延迟或预防症状发作的量，将含有Smad3 抑制剂的药物组合物给予易受疾病或病症影响或处于发展疾病或病症风 险中的患者，在所述疾病或病症中，过量的TGF-β/Smad3介导的信号传 导是不利的。这样的量被定义为“预防有效剂量”。在该用途中，抑制剂 的精确量还取决于患者的健康状态或体重，但是对于70kg的患者，通常 范围为每天约0.1mg至约2,500mg的抑制剂，对于70kg的患者，更通 常为每天约2.5mg至约500mg。

可以进行组合物的单次或多次给予，剂量水平和模式由治疗医师选 择。在任何事件中，无论是预防性或治疗性，药物制剂应当提供足以在 患者体内有效抑制Smad3介导的细胞信号传导的Smad3抑制剂的量。

V.使用核酸的治疗应用

多种癌症可以通过包括以下的治疗方法来治疗：将编码Smad3信号 传导的多肽抑制剂或小寡核苷酸序列(例如反义或miRNA)的核酸引入细 胞中，使得编码序列被转录，并在细胞中产生所述多肽或寡核苷酸抑制 剂。适于通过该方法治疗的癌症类型包括广谱的实体瘤，其存活和生长 在某种程度上依赖持续的TGF-β/Smad3信号传导。关于针对遗传性疾病 以及获得性疾病的基因疗法的应用的论述，参见Miller Nature 357:455-460(1992)；和Mulligan Science 260:926-932(1993)。

A.基因递送的载体

为了递送至细胞或有机体，可以将编码抑制Smad3信号传导(例如 Smad3的显性负性突变体或Smad3失活抗体)的多肽或编码抑制性寡核苷 酸(例如反义或miRNA)的多核苷酸并入载体中。用于该目的的载体的实 例包括能够指导核酸在靶细胞中表达的表达质粒。在其它实例下，载体 是病毒载体系统，其中将多核苷酸并入能够转染靶细胞的病毒基因组中。 在一实施方案中，编码多核苷酸可被可操作地连接至能够指导多肽或寡 核苷酸在期望的靶宿主细胞中表达的表达和控制序列。因此，在合适的 条件下，能够实现多肽或寡核苷酸抑制剂在靶细胞中的表达。

B.基因递送系统

用于表达Smad3介导的细胞信号传导的多肽或寡核苷酸抑制剂的病 毒载体系统包括，例如天然存在的或重组的病毒载体系统。取决于具体 的应用，合适的病毒载体包括可复制型病毒载体、复制缺陷型病毒载体 和条件复制型病毒载体。例如，病毒载体可以来源于人或牛腺病毒、牛 痘病毒、疱疹病毒、腺相关病毒、小鼠微小病毒(MVM)、HIV、辛德毕 斯病毒和逆转录病毒(包括但不限于劳氏肉瘤病毒)以及MoMLV基因组。 通常，将目的编码序列(例如，编码本发明的多肽或寡核苷酸抑制剂的序 列)插入此类载体中，以允许包装基因构建体，通常伴有病毒DNA，随后 感染敏感的宿主细胞，并表达目的编码序列。

如本文所用的“基因递送系统”，是指用于将本发明的多核苷酸序列 递送至靶细胞的任何手段。在本发明的一些实施方案中，通过合适的连 接部分如DNA连接部分(Wu et al.,J.Biol.Chem.263:14621-14624(1988)； WO 92/06180)，或通过超声微泡递送系统(Lan HY et al.,J.Am Soc. Nephrol.14:1535-1548)，将核酸与用于促进摄取的细胞受体配体缀合(例 如，被膜小窝的内陷和核内体的内化)。例如，核酸可以通过多聚赖氨酸 部分连接至脱唾液酸基(asialo)-oromucocid，其是肝细胞的脱唾液酸糖蛋 白受体的配体。

类似地，用于包装包含本发明的核酸的基因构建体的病毒包膜可以 通过添加受体配体或受体特异性抗体以允许受体介导的内吞入特定细胞 而进行修饰(参见例如，WO 93/20221、WO 93/14188和WO 94/06923)。 在本发明的一些实施方案中，将本发明的DNA构建体连接至诸如腺病毒 颗粒的病毒蛋白以促进内吞作用(Curiel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88:8850-8854(1991))。在其它实施方案中，本发明的分子缀合物可以包含 微管抑制剂(WO/9406922)、模拟流感病毒血凝素的合成肽(Plank et al.,J. Biol.Chem.269:12918-12924(1994))，以及核定位信号如SV40T抗原 (WO93/19768)。

逆转录病毒载体也可以用于将本发明的多肽或寡核苷酸抑制剂的编 码序列导入靶细胞或有机体中。逆转录病毒载体通过遗传操纵逆转录病 毒而产生。逆转录病毒的病毒基因组是RNA。在感染时，该基因组RNA 被逆转录成DNA拷贝，其以高度的稳定性和效率被整合入转导细胞的染 色体DNA。整合的DNA拷贝被称为前病毒，并且同任何其它基因一样 被子细胞遗传。野生型逆转录病毒基因组和前病毒DNA具有三个基因： gag、pol和env基因，其侧翼为两段长末端重复(LTR)序列。Gag基因编 码内部结构(核衣壳)蛋白；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录 酶)；env基因编码病毒包膜糖蛋白。5’和3’LTRs用于促进病毒体RNA 的转录和聚腺苷酸化。邻近5’LTR的是基因组逆转录(tRNA引物结合位 点)和将病毒RNA有效封装入颗粒所需的序列(Psi位点)(参见，Mulligan, In:Experimental Manipulation of Gene Expression,Inouye(ed),155-173 (1983)；Mann et al.,Cell 33:153-159(1983)；Cone and Mulligan, Proceedings of the National Academy of Sciences,U.S.A.,81:6349-6353 (1984))。

逆转录病毒载体的设计是本领域技术人员公知的。简而言之，如果 封装(或将逆转录病毒RNA包装入传染性病毒体)所需的序列从病毒基因 组缺失，结果是顺式作用缺陷，其阻止了基因组RNA的封装。然而，产 生的突变体仍然能够指导所有病毒体蛋白的合成。缺失这些序列的逆转 录病毒基因组，以及含有稳定整合入染色体中的突变体基因组的细胞系 是本领域内公知的，且用于构建逆转录病毒载体。逆转录病毒载体的制 备及其应用在很多出版物中有描述，包括例如，欧洲专利申请EPA 0178 220；美国专利4,405,712,Gilboa Biotechniques 4:504-512(1986)；Mann et  al.,Cell 33:153-159(1983)；Cone and Mulligan Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6349-6353(1984)；Eglitis et al.Biotechniques 6:608-614(1988)；Miller et  al.Biotechniques 7:981-990(1989)；Miller(1992)同上；Mulligan(1993),同 上；以及WO 92/07943。

逆转录病毒载体颗粒通过将所需的核苷酸序列重组插入逆转录病毒 载体，并通过使用包装细胞系用逆转录病毒衣壳蛋白包装载体来制备。 得到的逆转录病毒载体颗粒不能在宿主细胞中复制，但能够整合入宿主 细胞基因组中作为含有所需核苷酸序列的前病毒序列。因此，患者能够 产生例如本发明的多肽或多核苷酸，因而能够将细胞恢复至正常表型。

用于制备逆转录病毒载体颗粒的包装细胞系通常是产生包装所需的 必需病毒结构蛋白，但不能产生感染性病毒体的重组哺乳动物组织培养 细胞系。另一方面，所用的缺陷型逆转录病毒载体缺少这些结构基因， 但是编码包装所需的其余蛋白。为了制备包装细胞系，可以构建所需逆 转录病毒的感染性克隆，其中使包装位点缺失。包含该构建体的细胞将 表达所有结构病毒蛋白，但是所导入的DNA将无法被包装。可选择地， 包装细胞系可以通过用一种或多种编码合适的核心蛋白和包膜蛋白的表 达质粒转化细胞系而产生。在这些细胞中，gag、pol和env基因可以来 自相同或不同的逆转录病毒。

适于本发明的多种包装细胞系在本领域内也是可获得的。这些细胞 系的实例包括Crip、GPE86、PA317和PG13(参见Miller et al.,J.Virol. 65:2220-2224(1991))。其它包装细胞系的实例描述于Cone and Mulligan  Proceedings of the National Academy of Sciences,USA,81:6349-6353(1984)； Danos and Mulligan Proceedings of the National Academy of Sciences,USA, 85:6460-6464(1988)；Eglitis et al.(1988),同上；和Miller(1990)同上中。

可以使用能够产生具有嵌合包膜蛋白的逆转录病毒载体颗粒的包装 细胞系。可选择地，诸如PA317和GPX包装细胞系所产生的那些双嗜 性或嗜异性包膜蛋白可以用于包装逆转录病毒载体。

C.药物制剂

当用于制药目的时，通常将编码多肽或寡核苷酸Smad3抑制剂的核 酸配制在合适的缓冲液中，其可以是任何药学可接受的缓冲液，如磷酸 盐缓冲盐水或磷酸钠/硫酸钠、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、无菌水和本 领域技术人员已知的其它缓冲液，如Good et al.Biochemistry 5:467(1966) 中所描述的那些缓冲液。

组合物还可以包含稳定剂、增强剂或其它药学可接受的载体或介质。 药学可接受的载体可以包含生理可接受的化合物，其例如用于稳定本发 明的核酸和任何相关的载体。生理可接受的化合物可以包括例如，碳水 化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化剂如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯 合剂；低分子量蛋白或其它稳定剂或赋形剂。其它生理可接受的化合物 包括润湿剂、乳化剂、分散剂或防腐剂，其对于预防微生物的生长或功 能是特别有用的。多种防腐剂是公知的，且包括例如，苯酚和抗坏血酸。 载体、稳定剂或佐剂的实例可以参见Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack出版公司,Philadelphia,PA,第17版(1985)。

D.制剂的给予

可以利用本领域技术人员已知的任何递送方法将含有编码多肽或寡 核苷酸Smad3抑制剂的多核苷酸序列的制剂递送至任何组织或器官。在 本发明的一些实施方案中，编码多核苷酸序列经配制用于皮下、肌肉内、 静脉内、腹膜内或肿瘤内注射，或用于口服或局部应用。

通常将含有本发明核酸的制剂给予细胞。细胞可以作为组织如上皮 膜的一部分或作为例如在组织培养物中的分离细胞而提供。细胞可以体 内、离体或体外提供。

可以通过多种方法将制剂引入体内或离体的目的组织中。在本发明 的一些实施方案中，通过诸如显微注射、磷酸钙沉淀、脂质体融合、超 声、电穿孔或基因枪这样的方法，将本发明的核酸导入细胞中。在其它 实施方案中，核酸被目的组织直接摄取，例如当所靶向的组织是皮肤时。

在本发明的一些实施方案中，将本发明的核酸离体给予从患者移植 的细胞或组织，然后将细胞或组织返回患者。离体给予治疗性基因构建 体的实例包括Nolta et al.,Proc Natl.Acad.Sci.USA 93(6):2414-9(1996)； Koc et al.,Seminars in Oncology 23(1):46-65(1996)；Raper et al.,Annals of  Surgery 223(2):116-26(1996)；Dalesandro et al.,J.Thorac.Cardi.Surg., 11(2):416-22(1996)；和Makarov et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1):402-6(1996)。

制剂的有效剂量将随多种不同的因素而不同，包括给予方式、靶位 点、患者的生理状态和所给予的其它药物。因此，治疗剂量需要被滴定 以优化安全性和效力。在确定待给予的载体的有效量时，医生应当评价 所用的具体核酸；被诊断的疾病状态；患者的年龄、体重和总体状况； 循环血浆水平；载体毒性；疾病进展；以及抗载体抗体的产生。剂量的 大小还由伴随具体载体给予的任何不利副作用的存在、性质和程度决定。 为了实施本发明，SIS3的剂量范围通常为约0.1μg至100mg/患者。剂量 范围通常为约0.01至约100μg/千克体重，优选约0.1至约50μg/kg体 重或约10⁸-10¹⁰或10¹²颗粒/注射。通常，对于一般70kg的患者，来自 载体的裸核酸的剂量当量为约1μg-100μg，包括逆转录病毒颗粒的载体 剂量经计算，产生等量的编码抑制Smad3介导的信号转导的多肽或寡核 苷酸的核酸。

VI.试剂盒

本发明还提供了用于抑制Smad3信号传导，并因而用于根据本发明 的方法治疗癌症的试剂盒。所述试剂盒通常包含含有以下的容器：(1)具 有有效量的Smad3介导的信号传导的抑制剂的药物组合物(例如，显性负 性Smad3突变体、编码突变体多肽的多核苷酸序列、编码针对Smad3的 反义或miRNA的多核苷酸、Smad3的灭活抗体、或Smad3的小分子抑 制剂如SIS3)和(2)含有关于如何分散药物组合物的说明的信息材料，包 括可被治疗的患者类型(例如，具有过量的TGF-β/Smad3信号传导的癌症 患者)、安排(例如，剂量和频率)以及给予途径等的描述。

实施例

以下实施例仅以说明性而非限制性的方式提供。本领域技术人员将 容易地认识到能被改变或修改多个非关键性的参数以产生基本相同或相 似结果。

实施例1:肺癌和黑素瘤的SIS3治疗

在皮下侵入肺癌和黑素瘤的小鼠模型中测试SIS3的治疗作用。将荧 光素酶标记的高侵入性小鼠肺癌细胞(LLC-luc)和黑素瘤细胞 (B16F10-luc)，以每只小鼠200μl PBS中200万个细胞的剂量，经皮下注 射入遗传相同的C57/BL6小鼠中。通过每周测量肿瘤大小、体重和生物 光学成像来监测癌症生长、侵入和转移。在移植后一周建立癌症之后， 荷瘤小鼠经腹膜内接受日剂量为2.5、5和10μg/Kg体重的SIS3，持续2 周。对照动物每天接受盐水而不是SIS3，还监测了一组没有任何处理(用 作未处理对照)的荷瘤小鼠。在本项研究中使用每组5只小鼠。对小鼠称 重并通过每周的活体生物光学成像检查肿瘤大小或转移。记录存活率。 将所有小鼠在处理后2周处死，通过组织学以及肿瘤体积和重量、侵入 和转移的进一步检查。

本研究提供的证据支持了通过使用Smad3抑制剂(SIS3)而靶向 TGF-β/Smad3的新的抗癌疗法。如图1和图2所示，Smad3无效的小鼠 防止癌症生长、侵入、转移和两个高侵入性癌症模型(包括肺癌(LLC)和 黑素瘤(B16F10))的死亡。这些研究的结果明确表明，Smad3依赖的微环 境决定并促进了癌症生长、侵入、转移和死亡，为利用Smad3抑制剂的 新抗癌疗法的开发提供了有力证据。本发明开发出了，用Smad3抑制剂 (SIS3)处理，在肺癌(LLC)和黑素瘤(B16F10)中以剂量依赖的方式阻抑了 癌症生长和侵入癌症周围的组织，以及转移至淋巴结、肺脏、肝脏、胃 和结肠组织，并因此防止了癌症死亡(图3-7)。因此，本发明表明，SIS3 通过调节由TGF-β/Smad3介导的细胞信号转导的方式作为一种新的且有 效的抗癌剂。

本申请中所引用的所有专利、专利申请和其它出版物，包括GenBank 登录号通过引用整体并入，用于所有目的。