小檗碱用于制备治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病的药物的用途

摘要

本发明涉及一种小檗碱用于制备治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病的药物的用途。采用本发明所述药物治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病，具有抗CVB3作用，抑制促炎因子和趋化因子的表达效果明显，可用于制备治疗病毒性心肌炎的药物，该药物副作用小，疗效高，在目前临床上治疗CVB3所致病毒性心肌炎尤其是在感染后期，治疗的疗效不够满意的情况下，其应用前景良好。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，特别涉及一种小檗碱用于制备治疗柯萨奇病毒B3所 致病毒性心肌炎疾病的药物的用途。

背景技术

病毒性心肌炎(viral myocarditis)是指嗜心性病毒感染引起的以心肌炎性 病变为主的疾病，可引起急性心功能不全，且约有1/3的患者进一步发展为慢 性心肌炎和扩张型心肌病，是引发心力衰竭的常见病因之一。近年来该病发病 率呈上升趋势,已成为危害人类健康的常见疾病之一。但迄今尚无特异性治疗方 法。因此，寻找新的有确切疗效的药物来预防及治疗病毒性心肌炎是当前临床 迫切需求的。

多种病毒感染均可引发病毒性心肌炎，目前所知的相关病毒主要为肠道病 毒，包括柯萨奇病毒、埃可病毒、脊髓灰质炎病毒等，此外还有巨细胞病毒、 疱疹病毒、腺病毒、肝炎病毒等也可能引发心肌炎。在这些病毒中，柯萨奇病 毒B组(coxsackievirus B)具有高度亲心肌性和流行性，共包括6种血清型 (CVB1-CVB6)，其中柯萨奇病毒B3被认为是引起心肌炎和扩张型心肌病最为 常见的病原体，回顾性研究表明50％以上的病毒性心肌炎和25％的心肌病与之 有关。

柯萨奇病毒B3(CVB3)属于小RNA病毒科，肠道病毒属。病毒颗粒为二 十面体，立方对称呈球形，无包膜，直径约25-30nm，病毒衣壳包绕着一条单 股正链RNA，基因组长度为7.4kb。

目前对于病毒性心肌炎的临床治疗，还存在诸多不足。现临床主要采用抗 病毒和调节细胞免疫功能疗法。其中临床抗病毒药物包括阿昔洛韦、病毒唑和 更昔洛韦等，在感染早期，这些抗病毒药物能有效抑制病毒复制，减轻心肌损 伤，提高生存率，但是，在感染后期，其疗效有限，因此，目前临床应用的抗 病毒药物的疗效均不够满意。在细胞免疫功能调节方面，目前临床上使用的药 物包括：丙种球蛋白、人白细胞干扰素等，虽然这些药物能减弱免疫反应，清 除病毒，改善左心室功能，提高生存率，但仍存在个体疗效差异大，有一定副 作用，成本过高等问题。因而，筛选和研制治疗病毒性心肌炎的新药具有重要 意义。

我国有着悠久的中医药传统文化和丰富的药用动植物资源，从中药中筛选 出新的抗病毒药物不仅是可行的解决途径，而且还具有筛选时间短、节省人力、 物力和财力等优势。与此同时，中药普遍存在毒性低、副作用小等优势。

小檗碱(Berberine,BBR)又名黄连素，是清热解毒中药黄连、黄柏、三颗 针等植物中提取的异喹啉生物碱，分子式为C20H18NO4，其药理作用广泛， 毒性和副作用较小，临床广泛用于治疗细菌性痢疾和肠炎等。除了传统的抗肠 道细菌感染的作用外，小檗碱还具有抑制肿瘤转移、降低血糖和改善心脑血管 功能等药效。近年来有关研究表明小檗碱具有抗流感病毒的活性，但其具体的 抗病毒机制还未完全阐明。而小檗碱抗其它病毒的研究还很鲜见。尤其对于抗 柯萨奇病毒B3活性还尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种檗碱用于制备治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌 炎疾病的药物的用途。采用本发明所述药物，治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心 肌炎疾病，具有抗CVB3作用，抑制促炎因子和趋化因子的表达效果明显，可 用于制备治疗病毒性心肌炎的药物，该副作用小，疗效高，在目前临床上治疗 CVB3所致病毒性心肌炎尤其是在感染后期，治疗的疗效不够满意的情况下，应 用前景良好。

本发明的技术方案是：

小檗碱用于制备治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病的药物的用途。

我们是灌胃小鼠，对于人来说是口服给药量对成人而言为每公斤每天 4.5-8mg。

本发明的有益效果是：

(1)药理活性方面

申请人的动物实验证明，小檗碱显著改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠生存 率，心脏组织实验方面，小檗碱能明显的抑制炎症细胞浸润和组织坏死，具有 抗CVB3作用和抑制其复制的作用以及明显的抑制促炎因子和趋化因子的表达， 血清样本用全自动生物分析仪进行检测，结果表明，小檗碱具有抑制心肌酶活 性的作用、保护心肌功能的作用，体外抗CVB3活性作用表明小檗碱具有显著 的抑制VP1蛋白表达水平的作用。

(2)药学方面

小檗碱是清热解毒中药黄连、黄柏、三颗针等植物中提取的异喹啉生物碱， 其本身理化性质稳定，药理作用广泛，毒性和副作用较小。

附图说明

图1为小檗碱改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠生存率的曲线；

图2为小檗碱抑制炎症细胞浸润和组织坏死结果，图中，A为正常对照组，B 为小檗碱组，C为CVB3感染组，D为CVB3+小檗碱治疗组；

图3为小鼠心肌组织切片H&E染色评分结果，图中，1：正常对照组，2： 小檗碱组，3：CVB3感染组，4：CVB3+小檗碱治疗组(注：*P<0.05，CVB3 感染组与正常对照组比较；#P<0.05，CVB3+小檗碱治疗组与CVB3感染组比 较)；

图4为小檗碱抗CVB3作用，图中，A为dsRNA染色结果，B为CVB3染 色结果。(1：正常对照组，2：小檗碱组，3：CVB3感染组，4：CVB3+小檗碱 治疗组)；

图5为小檗碱抑制小鼠心肌组织中CVB3衣壳蛋白VP1mRNA表达量，图 中，1：正常对照组，2：CVB3感染组，3：CVB3+小檗碱治疗组(注：*P<0.001， CVB3感染组与正常对照组比较；#P<0.001，CVB3+小檗碱治疗组与CVB3感 染组比较)；

图6为ELISA检测小檗碱抗炎作用，图中，1：正常对照组，2：小檗碱组， 3：CVB3感染组，4：CVB3+小檗碱治疗组；(注：*P<0.05，CVB3感染组与 正常对照组比较；#P<0.05，CVB3+小檗碱治疗组与CVB3感染组比较)；

图7为qRT-PCR检测小檗碱抗炎作用，图中1：正常对照组，2：小檗碱组， 3：CVB3感染组，4：CVB3+小檗碱治疗组；(注：*P<0.05，CVB3感染组与 正常对照组比较；#P<0.05，CVB3+小檗碱治疗组与CVB3感染组比较)；

图8为qRT-PCR检测小檗碱体外抗CVB3作用，图中，1：正常对照组，2： CVB3感染组，3：CVB3+小檗碱治疗组；(注：*P<0.05，CVB3感染组与正常 对照组比较；#P<0.05，CVB3+小檗碱治疗组与CVB3感染组比较)

图9为Western blot检测小檗碱体外抗CVB3作用。

具体实施方式

一.材料和试剂

1.动物、病毒株

BALB/c小鼠，雄性，4-6周龄，购买于第三军医大学大坪医院动物中心；

柯萨奇病毒B3(Nancy)购买于中国科学院武汉病毒研究所；

HeLa细胞株购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

2.主要试剂

PBS液(0.01mol/L，pH 7.4)：NaCl 8.00g，KCl 0.20g，KH₂PO₄0.20g， NaH₂PO₄·H₂O 1.56g，1000ml ddH₂O溶解，高温高压灭菌，4℃保存。

3.主要仪器设备

二.实验方法

1.病毒性心肌炎模型的建立

BALB/c小鼠，雄性，4-6周龄，适应性喂养3天。实验分为正常对照组、 病毒性心肌炎模型组、小檗碱治疗组。小鼠腹腔注射0.1ml CVB3病毒液 (3×10⁵PFU/ml)，次日分别给予灌胃PBS(正常对照组、病毒性心肌炎模型组)、 小檗碱(100mg/kg)(转算成人每日适应剂量是：450mg-900mg)。连续灌胃 7天和21天(7天后每周灌胃3次)，心功能检测，处死小鼠，收集心肌组织 和血液标本。

2.病毒感染滴度测定

TCID50实验步骤：

1)将病毒液作连续10倍稀释，从10^-1-10^-10；

2)将稀释好的病毒接种到96孔板中，每一稀释度接种8孔，每孔接种100μl；

3)在每孔加入细胞悬液100μl，接种HeLa细胞2×10⁵/ml；

4)逐日观察并记录结果，观察5天；

5)结果按Reed-Muench方法计算。

3.H&E染色方法

小鼠心脏组织用4％多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5μm， 苏木素伊红染色(hematoxylin-eosine,H&E)后镜检。光学显微镜下观察组织切 片心肌组织炎性细胞浸润、细胞损伤程度，参照Rezkalla方法计算心肌病理组 织学积分：每张切片取5个视野，计算每个视野中炎性细胞浸润及坏死区域与 整个视野面积之比：无病变计0分，病变面积<25％计1分，26-50％计2分，51-75％ 计3分，>76％计4分。

4.ELISA方法检测小鼠血清炎症因子

小鼠血清中炎症因子水平用酶联免疫吸附测定试剂盒测定(购自上海西唐生 物科技有限公司)。

具体步骤如下:

(1)标准品液配置：使用前加入0.5ml蒸馏水混匀，配成20ng/ml的溶液。 取8个1.5ml离心管，第1管加标本稀释液900μl，第2-8管加入标本稀释液 500μl。在第1管中加入20ng/ml的标准品溶液100μl置于漩涡混合器上混匀后 用加样器吸出500μl，移至第2管。如此反复作对倍稀释，从第7管中吸出500 μl弃去。第8管为空白对照。

(2)检测程序：

1)加样：每孔各加入标准品或待测样品100μl，将反应板充分混匀后置37 ℃40分钟。

2)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3)每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50μl(空白除外)。将反应板充分 混匀后置37℃20分钟。

4)洗板：同前。

5)每孔加酶标抗体工作液100μl。将反应板置37℃10分钟。

6)洗板：同前。

7)每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗处反应15分钟。

8)每孔加入100μl终止液混匀。

9)30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

(3)结果计算

1)所有OD值减除空白值后再行计算。

2)以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标， OD值为纵坐标，使用软件作图，画出标准曲线。

3)根据样品OD值计算出相应炎症因子含量。

5.免疫组化染色方法

小鼠心脏组织用4％多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5μm， 组织切片经脱蜡水化，抗原修复，封闭内源性过氧化氢酶，抗体杂交(dsRNA 和CVB3抗体)，DAB显色，复染，脱水、透明和封片后镜检。

6.免疫荧光染色方法

细胞经过药物处理后，PBS洗涤三次，用4％多聚甲醛固定20min；孵育病 毒dsRNA一抗(4℃，过夜)；PBS洗涤三次，孵育带荧光的相应二抗(室温2h)； 封片；共聚焦进行图片采集。

7.qRT-PCR检测方法

具体步骤包括：设计并合成VP1和GAPDH引物；细胞经药物处理后，Trizol 试剂提取RNA，核酸仪检测RNA浓度和纯度，逆转录试剂盒合成cDNA；以 cDNA为模板，采用SYBR进行RT-PCR。

8.Western blot检测

药物处理后的细胞进行总蛋白提取；BCA法进行蛋白浓度测定；然后进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，一抗稀释液孵育过夜，相应二抗孵育2 h(室温)，化学发光显影。应用Image J软件测定灰度值。

9.小鼠心肌功能检测

小鼠给药21天(感染CVB3后连续给药7天，后每周给药3次)，小鼠用 7％水合氯醛按3ml/kg经腹腔注射麻醉，固定，用Vevo2100高分辨率超声系统 经小鼠胸廓进行超声心动图(30MHz，100帧/秒)，得到参数：左心室舒张末 期容积(LVEDV)、左心室收缩末期容积(LVESV)和心率。 EF＝[(LVEDV-LVESV)/LVEDV]×100％，SV＝LVEDV-LVESV，CO＝SV-HR。(EF: 射血分数，SV：每搏输出量，CO:心输出量)

10.心肌酶谱检测方法

将小鼠血清用自动生物化学分析仪(公司：日立，型号：7170S)进行检测， 乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转氨酶(AST)和肌酸激酶(CK-MB)的活性。 11.HeLa细胞感染及药物处理

以含10％FBS的高糖DMEM培养基调整HeLa细胞密度，以5×10⁵/孔接种于六 孔板中，37℃、5％CO₂的条件培养24小时。用CVB3(MOI＝3)感染1小时，弃去 病毒液，PBS洗涤两次，加药处理。提取RNA和总蛋白。

三.结果

1.小檗碱显著改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠生存率

在小鼠感染CVB3后，灌胃小檗碱(100mg/kg)，连续灌胃7天后，小檗 碱干预组小鼠生存率明显得到提高。结果显示小檗碱显著改善CVB3所致病毒性 心肌炎小鼠生存率(参见图1)。

2.小檗碱抑制炎症细胞浸润和组织损伤

小鼠心肌组织用4％多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5μm， 苏木素伊红染色(hematoxylin-eosine,H&E)后镜下观察。结果表明小檗碱治疗 组明显的抑制炎症细胞浸润和组织坏死(见图2)，参照Rezkalla方法计算心肌 病理组织学积分：每张切片取5个视野(见图3)。

3.小檗碱具有抗CVB3作用

小鼠心脏组织用4％多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5μm， 组织切片经脱蜡水化，抗原修复，封闭内源性过氧化氢酶，抗体杂交(dsRNA 和CVB3抗体)，DAB显色，复染，脱水、透明和封片后镜检。结果表明小檗 碱治疗组具有明显的抗CVB3作用和抑制其复制的作用(见图4)。

qRT-PCR方法检测小鼠心肌组织中CVB3衣壳蛋白VP1的mRNA水平， 结果表明小檗碱治疗组明显降低其mRNA表达水平(见图5)。

4.小檗碱具有抗炎作用

将小鼠血清用ELISA试剂盒进行检测IL-1β、IL-6、TNF-α、CCL2、CCL5和 CXCL10促炎因子和趋化因子。结果表明，小檗碱治疗组具有明显的抑制促炎因 子和趋化因子的表达(见图6)。

用qRT‐PCR方法检测心肌组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、CCL2、CCL5和CXCL10 促炎因子和趋化因子mRNA表达水平，结果表明，小檗碱治疗组具有明显的抑 制促炎因子和趋化因子的表达(见图7)。

5.小檗碱具有抑制心肌酶活性的作用

小鼠血清样本进行心肌酶活性检测，结果表明小檗碱治疗组LDH、AST和 CK-MB活性明显被抑制，见表1。

表1 小檗碱抑制心肌酶谱作用结果

(注：*P<0.05，CVB3感染组与正常对照组比较；#P<0.05，CVB3+小檗碱治 疗组与CVB3感染组比较)。

6.小檗碱具有保护心肌功能的作用

将小檗碱治疗21天的小鼠进行心功能检测，结果表明小檗碱治疗组具有保 护心肌功能的作用，见表2。

表2 小檗碱保护心肌功能作用结果

(注：*P<0.05，CVB3感染组与正常对照组比较；#P<0.05，CVB3+小檗碱治 疗组与CVB3感染组比较)

7.小檗碱体外抗CVB3活性作用

将HeLa细胞经药物处理20小时后，提取总RNA，qRT-PCR检测CVB3衣 壳蛋白VP1的mRNA水平，结果表明，小檗碱具有显著的抑制VP1mRNA表 达水平的作用(见图8)。提取总蛋白，western blot检测CVB3衣壳蛋白VP1的 表达水平，结果表明，小檗碱具有显著的抑制VP1蛋白表达水平的作用(见图 9)。