内质网应激在柯萨奇病毒B3诱导的急性病毒性心肌炎中的作用及机制研究

摘要

背景:
　　急性病毒性心肌炎(Acute viral myocarditis，AVMC)为病毒感染引起的心肌局灶性或弥散性免疫性炎症病变。临床上以肠道病毒柯萨奇病毒B3(coxsackievirusB3，CVB3)感染引起的心肌炎最为多见。临床观察发现柯萨奇病毒B3的病毒量、复制速率和存在时间与心肌损伤和疾病进展直接相关，但具体机制尚未阐明。研究表明内质网应激(Endoplasmic reticulum stress， ER stress)及其下游促凋亡分子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)在许多病毒感染性疾病中发挥重要作用，其与病毒感染引起的宿主细胞凋亡有关，但内质网应激是否参与了急性病毒性心肌炎的发生和发展及其相关作用机制尚未明确。
　　方法:
　　本研究应用柯萨奇病毒B3腹腔接种法建立急性病毒性心肌炎小鼠模型，并使用内质网应激保护剂熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)灌胃来研究内质网应激在急性病毒性心肌炎中的作用，通过心脏超声和血流动力学检测评价心功能改变，接种病毒7天后收集小鼠心脏组织和血标本。应用免疫组织化学染色（Immunological Histological Chemistry，IHC），western blot蛋白印记法，酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA），TUNEL染色等方法检测心脏炎症反应、内质网应激水平、心肌损伤和心肌细胞凋亡（apoptosis）等情况。
　　结果:
　　生存分析提示急性病毒性心肌炎组小鼠存活率显著低于对照组（P＜0.05）。心脏超声和血流动力学检测结果提示，急性病毒性心肌炎组左室射血分数、短轴缩短率、dP/dt最大值、dP/dt最小值和左室收缩末压等心功能参数均显著低于对照组（P值均＜0.01），而左室舒张末压显著高于对照组(P＜0.01)。Western blot检测进一步提示急性病毒性心肌炎组小鼠心功能显著降低，其心衰标志物心房钠尿肽的蛋白表达水平显著高于对照组(P＜0.01)。ELISA检测提示急性病毒性心肌炎组存在心肌损伤，其血清心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponinⅠ，cTnⅠ)水平显著高于对照组(P＜0.01)。组织学染色显示急性病毒性心肌炎组小鼠心肌组织可见明显的心肌细胞变性坏死和间质炎症细胞浸润，而对照组未见异常改变;急性病毒性心肌炎组心脏组织病理学评分和巨噬细胞浸润程度（表面标记F4/80）均显著高于对照组（P值均＜0.01）。急性病毒性心肌炎组心脏内质网应激水平显著提高，免疫组化染色结果提示急性病毒性心肌炎组内质网应激标志物KDEL的蛋白表达水平显著高于对照组(P＜0.01)，western blot检测进一步提示急性病毒性心肌炎组内质网应激感受蛋白p-PERK、p-IRE1α和ATF6的蛋白表达水平均显著高于对照组(P值均＜0.01)。TUNEL染色提示急性病毒性心肌炎组心肌细胞凋亡比例显著高于对照组(P＜0.01)。Western blot检测提示急性病毒性心肌炎组心脏CHOP的蛋白表达水平显著高于对照组（P＜0.01），并且CHOP蛋白的上调与抗凋亡蛋白Bcl-2的降低以及促凋亡蛋白Bax和caspase3的上调存在相关性。而内质网应激保护剂TUDCA的应用显著降低CVB3感染后心肌组织的内质网应激水平和炎症反应水平、减轻心肌损伤、改善心脏功能并增加存活率;同时，TUDCA的应用显著降低心脏CHOP、caspase3和Bax蛋白表达、提高Bcl-2蛋白表达并减少心肌细胞凋亡。
　　结论:
　　在柯萨奇病毒B3诱导的急性病毒性心肌炎小鼠模型中，内质网应激及其下游转录因子CHOP所介导的促凋亡信号通路通过促进心肌细胞凋亡在疾病发生和进展中发挥作用，为急性病毒性心肌炎的治疗提供了新的思路。