miR-346在内质网应激诱导的细胞自噬中的作用及作用机制研究

摘要

目的：内质网是真核细胞内重要的细胞器，内质网腔内未折叠或者错误折叠蛋白的累积将导致内质网应激（Edoplasmic Reticulum Stress, ERS）。内质网应激将导致未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response, UPR），尝试恢复正常的内质网功能。ERS引起的UPR参与多种人类疾病的病理生理过程，包括神经退行性疾病、糖尿病以及肿瘤等。已有研究表明细胞自噬和微小 RNA（microRNA， miRNA）参与内质网应激过程中细胞命运的调节，但是在内质网应激过程中miRNA是否参与细胞自噬的调节还不是很清楚。我们发现在内质网应激的条件下 miR-346的表达显著增加，并且 miR-346可以显著提高内质网应激条件下细胞的活性。在此基础上我们探讨 miR-346在内质网应激条件下促进细胞存活的机制，及内质网应激条件下 miR-346在细胞自噬和线粒体自噬过程中的作用及其分子机制。
　　方法：首先，我们建立了毒胡萝卜素（Thapsigargin, Tg）诱导的HeLa细胞内质网应激模型，并通过western blot或者RT-qPCR的方法检测内质网伴侣蛋白GRP78或者XBP-1(U)与XBP-1(S) mRNA的表达情况来判断内质网应激是否诱导成功；通过RT-qPCR的方法检测内质网应激条件下miR-346的表达情况；通过MTT和Annexin V-FITC/PI法分别检测内质网应激条件下miR-346对细胞活性以及凋亡的影响。其次，我们通过GFP-LC3示踪实验、western blot检测LC3-I以及LC3-II表达等探讨了miR-346对内质网应激条件下细胞自噬的调节；通过GFP-LC3联合MitoTracker? Red CMXRos染色探讨miR-346对线粒体自噬的调节；通过活性氧敏感探针 DCFH-DA研究 miR-346对内质网应激条件下活性氧的调节。而后，我们通过生物信息学预测，并通过western blot、RT-qPCR以及荧光报告载体实验验证内质网应激条件下 miR-346靶基因，并进一步研究了靶基因的功能。最后我们通过蛋白质免疫共沉淀、蛋白质泛素化分析的方法探讨miR-346促进细胞自噬的可能机制。
　　结果：在内质网应激的条件下 miR-346的表达水平显著增加，XBP-1参与了内质网应激条件下 miR-346的表达调节，并且miR-346可以显著降低内质网应激条件下细胞的凋亡水平从而提高细胞的活性。miR-346可以显著增强内质网应激条件下细胞的自噬和线粒体自噬水平，降低细胞内的活性氧水平；miR-346通过自噬依赖的方式提高内质网应激条件下细胞的活性。miR-346直接靶定并上调GSK3B的表达；过表达 GSK3B可以显著增强内质网应激条件下细胞的自噬，导致细胞内活性氧水平降低以及细胞活性增强，而敲降GSK3B则相反；功能挽救实验证实GSK3B是miR-346的直接功能靶基因。miR-346和GSK3B可以显著增加BCL2的泛素化水平，导致细胞内的BCL2蛋白水平显著降低，促进BCL2与BECN1的解离。
　　结论：在内质网应激条件下 miR-346的表达水平显著增强；通过增强内质网应激条件下细胞自噬和线粒体自噬水平，miR-346可降低细胞内的活性氧，进而降低内质网应激条件下细胞的凋亡，提高细胞活性；同时在内质网应激条件下， miR-346可直接靶定并上调GSK3B的表达，通过促进BCL2的泛素化导致细胞内的BCL2水平显著降低，继而导致BECN1与BCL2的解离以及细胞自噬活性的增强。

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缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、在内质网应激条件下miR-346的表达调节以及miR-346的功能

1.1 材料和方法

1.2 结果

1.3 讨论

1.4 小结

二、内质网应激条件下miR-346促进细胞存活的机制

2.1 材料和方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

三、内质网应激条件下miR-346靶基因的确定

3.1 材料和方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

四、靶基因的功能研究以及功能挽救实验

4.1 材料和方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 小结

五、miR-346/GSK3B促进细胞自噬的机制研究

5.1 材料和方法

5.2 结果

5.3 讨论

5.4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:细胞自噬以及miRNA与内质网应激的相互调节概述

致谢

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