一种聚合物/角蛋白复合抗凝血血管组织工程支架的制备方法

摘要

本发明公开了一种利用角蛋白构建抗凝血血管组织工程支架的方法，包括角蛋白的提取并稳定化；将提取的角蛋白与生物可降解聚合物共混纺丝制备复合纤维膜片。本发明方法制备的复合纤维膜片作为血管组织工程支架，利用角蛋白在血液环境中的原位催化或诱导内源性NO供体释放NO的能力，从而实现NO释放；进而提高支架的血液相容性和细胞相容性，抑制平滑肌生长，最终原位形成血管。本发明方法，不仅用于制备血管组织工程支架，还可用于与血液接触的其它医疗器械。

说明书

技术领域

本发明涉及一种血管组织工程支架材料的制备，具体是涉及一种聚合物/角蛋白抗凝血 血管组织工程支架的制备方法。

背景技术

人工合成血管和自体血管是目前临床上小直径(<6mm)血管移植物的主要来源。在实践 中人工合成血管存在植入后容易造成血栓形成、内膜增生、远期通畅率不高等问题；自体 血管受到供体来源、直径及长度等限制，还无法满足小直径血管移植物的供给需求。组织 工程血管为解决小直径血管移植物来源提供了有效的途径，制备可供细胞进行生命活动的 支架并对支架材料进行生物学方面的评价是组织工程血管研究的重要领域。

快速内皮细胞化策略可长效解决血管组织工程支架的血栓形成问题。原位血管组织工 程支架策略能够短期内行使血液输送功能，长期随着支架细胞内生长、自身降解，从而最 终形成血管，这种策略是目前最理想的策略。

原位血管组织工程支架材料要求有一定的机械强度、良好的细胞相容性、良好的抗凝 血性。支架表面内皮化既可以促进细胞生长，也可以改善血液相容性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种聚合物/角蛋白复合抗凝血血管组织工程支架的制备方法， 将提取的角蛋白与生物可降解聚合物共混纺丝制备复合纤维膜片，所制备的复合纤维膜片 作为血管组织工程支架，利用角蛋白在血液环境中的原位催化或诱导内源性NO供体释放 NO的能力，从而实现NO释放；进而提高支架的血液相容性和细胞相容性，抑制平滑肌生 长，最终原位形成血管。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种聚合物/角蛋白复合抗凝血血管组织工程支架的制备方法，其特征在于，提取角蛋 白并进行稳定化改性；将改性后的角蛋白与生物可降解聚合物混合，采用静电纺丝法制备 所述的聚合物/角蛋白复合血管组织工程支架。

本发明所用的角蛋白来源为人或动物的毛发。

本发明中的生物可降解聚合物包括PCL(聚己内酯)、PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)、 PLA(聚乳酸)、PHA(聚羟基脂肪酸酯)、PHBV(3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的共聚物)、 生物可降解PU(聚氨酯)中的一种或者几种。

具体地，本发明方法包括如下步骤：

步骤1)角蛋白的提取和改性：将人或动物的毛发洗净后烘干，剪成小段，在pH值为 8.0-9.0的还原液中溶胀1～2小时，然后在45～60℃搅拌反应至少12小时，过滤得到角蛋 白溶液，透析2-3天；所得的角蛋白溶液中，加入过量的改性剂封端活泼的巯基，反应0.5-2 天后，再次透析2-3天，冻干后得到棉花状角蛋白；

步骤2)血管组织工程支架的制备：将步骤1)得到的改性后的角蛋白和可生物降解聚 合物的混合物溶解在有机溶剂中形成混合溶液，采用转筒接收器，静电纺丝法制备管状样 品，制得所述的聚合物/角蛋白复合血管组织工程支架。

上述步骤1)中，所述的还原液优选为巯基乙醇或巯基乙酸、十二烷基硫酸钠和尿素的 混合液，所用毛发与还原液的质量体积比为1:50～1:100克/毫升。

上述步骤1)中，所述的改性剂选自碘代乙酸或(甲基)丙烯酸单体。

上述步骤2)中，所述的可生物降解聚合物包括PCL、PLGA、PLA、PHA、PHBV、 生物可降解PU中的一种或者几种。

上述步骤2)中，角蛋白和可生物降解聚合物的混合物中，所述的角蛋白所占质量百分 比为5％～50％。

本发明的利用角蛋白构建血管组织工程支架的方法，制得的血管支架为有机高分子血 管组织工程支架，主要用于原位法血管组织工程构建血管。角蛋白材料本身具有大量的双 硫键，在血液环境中双硫键可以被部分还原，最终催化或诱导内源性NO供体释放NO。 角蛋白本身的蛋白质特性，注定其自身具有良好的细胞相容性。从人头发提取的角蛋白， 用于人体，还有抗免疫原性。NO是生物体内的一种信息分子，NO能够有效防止血小板在 正常血管壁上的粘附和活化，具有显著的抗凝血效果。更加重要的是，NO还能够抑制平滑 肌细胞的增殖，有助于减少血管再狭窄。

本发明所述的方法，不仅用于原位血管组织工程支架制备，还可用于与血液接触的其 它医疗器械。

本发明的优点在于：(1)角蛋白来源丰富，尤其是人发角蛋白；(2)角蛋白本身具有 良好的细胞相容性；(3)角蛋白在血液环境中的原位催化或诱导内源性NO供体释放NO， 促进内皮细胞生长同时，抑制平滑肌细胞生长；(4)抗血栓形成；(5)生物可降解；(6) 排异反应小。根据本发明方法制备抗血栓形成、生物可降解、组织和细胞相容性好、无免 疫原性、具有一定的强度和生长性的支架，为小口径血管组织工程支架的制备提供理论与 实验依据。

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。本发明的保护范围并不以具体实施方式 为限，而是由权利要求加以限定。

附图说明

图1本发明制备的聚合物/角蛋白复合膜片的SEM形貌图；A)PCL，B)PCL/角蛋白。

图2本发明制备的聚合物/角蛋白复合膜片的ATR-FTIR图谱。

图3本发明制备的聚合物/角蛋白复合膜片的细胞相容性。

图4本发明制备的聚合物/角蛋白复合膜片的NO释放能力。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出 以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。

实施例1

聚合物/角蛋白复合抗凝血血管组织工程支架的制备方法，依次包括以下步骤：

①角蛋白还原并稳定化

人发经过碱和甲醇依次洗涤，除去油污。剪碎人发粗品(1g)，放入烧瓶中，加入巯基 乙醇(3g)，尿素(20g)，十二烷基磺酸钠(1.5g)，溶胀1～2小时，加热到50℃，反应12h。 透析2天后，过滤得到角蛋白溶液。测定透析后角蛋白的巯基含量，根据体积计算得到巯 基的总量，并加入过量的改性剂(碘代乙酸)稳定巯基，避光常温反应12小时，再次透析 3天，冻干得到改性后的角蛋白。

②静电纺丝构建血管组织工程支架

取聚合物PCL和角蛋白共混，其中角蛋白质量比例为10％，溶解于有机溶剂六氟异丙 醇中形成聚合物溶液。优化条件下，纺丝浓度为10％，纺丝电压为10kV，接收板距离15cm， 静电纺丝制备纳米纤维支架。采用转筒接收器，制备管状样品。

③考察支架的抗凝血性和细胞相容性

选用成纤维细胞，血管内皮细胞培养，采用MTT等方法测试细胞相容性(图3)；模拟 血液环境，测定NO释放能力(图4)；采用常规凝血测试方法测定抗凝血性能。

结果表明，所制备的支架具有良好的细胞相容性、抗凝血性，且能原位催化或诱导内 源性NO供体释放NO。

实施例2～3

按照与实施例1基本相同的方法制备聚合物/角蛋白复合抗凝血血管组织工程支架，在 步骤②“静电纺丝构建血管组织工程支架”中，聚合物PCL和角蛋白共混物中，角蛋白的 质量百分比分别为20％、30％，其它条件相同。

选用成纤维细胞，血管内皮细胞培养，采用MTT等方法测试细胞相容性；模拟血液环 境，测定NO释放能力，结果见图3和图4(图中9/1等表示PCL/角蛋白质量比)；采用常 规凝血测试方法测定抗凝血性能。

结果表明，所制备的支架具有良好的细胞相容性、抗凝血性，且能原位催化或诱导内 源性NO供体释放NO。

实施例4

聚合物/角蛋白复合抗凝血血管组织工程支架的制备方法，依次包括以下步骤：

①角蛋白还原并稳定化

人发经过碱和甲醇依次洗涤，除去油污。剪碎粗品(1g)，放入烧瓶中，加入巯基乙醇 (4g)，尿素(15g)，十二烷基磺酸钠(1.5g)，加热到60℃，反应24h。透析1天后，过滤得 到角蛋白溶液。测定透析后角蛋白的巯基含量，根据体积计算得到巯基的总量，并加入过 量的改性剂碘代乙酸来稳定巯基，避光常温反应12小时，再次透析2天，冻干得到改性后 的角蛋白。

②静电纺丝构建血管组织工程支架

取聚合物聚氨酯和角蛋白共混，其中角蛋白质量比例为15％，溶解于有机溶剂六氟异 丙醇中形成聚合物溶液。优化条件下，纺丝浓度为15％，纺丝电压为15kV，接收板距离10 cm，静电纺丝制备纳米纤维支架。采用转筒接收器，制备管状样品。

③考察支架的抗凝血性和细胞相容性

选用成纤维细胞，血管内皮细胞培养，采用MTT等方法测试细胞相容性；模拟血液环 境，测定NO释放能力；采用常规凝血测试方法测定抗凝血性能。

结果与实施例1相似，表明本发明所制备的支架具有良好的细胞相容性、抗凝血性， 且能原位催化或诱导内源性NO供体释放NO。

实施例5～8

按照与实施例4基本相同的方法制备聚合物/角蛋白复合抗凝血血管组织工程支架，在 步骤②“静电纺丝构建血管组织工程支架”中，聚合物PU分别替换为PLGA、PLA、PHA、 PHBV，其它条件相同。

选用成纤维细胞，血管内皮细胞培养，采用MTT等方法测试细胞相容性；模拟血液环 境，测定NO释放能力；采用常规凝血测试方法测定抗凝血性能。

结果与实施例1相似，表明本发明所制备的支架具有良好的细胞相容性、抗凝血性， 且能原位催化或诱导内源性NO供体释放NO。