一种从人参茎叶中获取黄酮苷元的方法

摘要

本发明涉及一种从人参茎叶中制备黄酮苷元的方法，该方法包括以下步骤：通过超声技术提取人参茎叶总黄酮粗提物的步骤、配制人参茎叶总黄酮粗提物溶液的步骤、将所述人参茎叶总黄酮粗提物溶液中的黄酮糖苷转化为黄酮苷元的转化步骤、干燥步骤。通过本发明的从人参茎叶中制备黄酮苷元的方法，其操作工艺简单、时间短、成本低、转化率高，适合工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种人参茎叶黄酮苷元的制备方法，具体而言，即利用盐酸水解方法从人参茎叶中获取黄酮苷元的方法。本发明是关于中药有效成分的制备方法，具体涉及从人参茎叶中制备黄酮苷元的方法。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)为五加科(Araliaceae)人参属(Panax)植物人参的根，为名贵中药。用于体虚俗脱、肢冷脉微、肺虚喘咳、惊悸失眠、神经衰弱、精神倦怠及各种气血津液不足症。古代医药学书籍《神农本草经》记载的人参药用部分主要为地下部分，即人参的根和须。随时现代研究的不断深入，对人参地上部分即花、果、茎叶等的研究越来越多。而且发现，人参地上部分中的功效成分含有与地下部分相同的功效成分，有些成分的含量要比地下部分更高。目前已从人参茎叶部分得到皂苷类、黄酮类、有机酸类、挥发油类、多糖类等。但现在人参茎叶除少量用于人参皂苷提取外，大部分被废弃。对人参茎叶黄酮的深入研究近些年也刚刚开始。

黄酮类化合物是广泛存在于植物中的次生代谢产物，多与糖结合形成黄酮糖苷，只有极少数以苷元的形式存在。黄酮类化合物具有很多的生物活性功能，包括抗氧化、抗癌、抗高血压和抗菌活性等。随着对其生理生化研究的深入，发现黄酮苷元比黄酮糖苷具有更高的生物效价，黄酮苷元在小肠直接吸收，而糖苷型通过结肠中的微生物等作用而水解，再进一步降解生成苷元后被结肠壁吸收。因此，生产黄酮苷元具有更为重要的意义。结构式如下：

中国专利CN 101768613 A公开了一种沙棘叶中提取黄酮苷元的生产方法，该方法主要利用微生物转化来制备苷元，转化率在14％～23％。虽然微生物法反应条件温和，能最大限度保护原料中成分的破坏，但是转化反应时间长，并且筛选高产菌株的是一个庞大的工程，还有转化率低的缺点。

中国专利CN 103142685 A公开了一种山核桃叶中总黄酮苷元的提取方法，该方法主要利用乙醇进行提取，再利用聚酰胺处理得到纯度87.47％的黄酮苷元。

目前，尚未见关于人参茎叶黄酮糖苷经盐酸水解转化为黄酮苷元的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人参茎叶黄酮苷元的制备方法。利用化学法制备人参茎叶黄酮苷元，从而提高人参茎叶黄酮的生理活性和最终产品中黄酮苷元的含量。本发明利用化学法进行转化，即利用盐酸对人参茎叶中黄酮糖苷进行转化，最后生成山奈酚、槲皮素和异鼠李素等黄酮苷元。本方法的操作工艺简单，时间短，成本低，转化率高， 适合工业化生产。

本发明的目的在于提供一种从人参茎叶中制备黄酮苷元的方法，该方法包括以下步骤：通过超声技术提取人参茎叶总黄酮粗提物的步骤、配制人参茎叶总黄酮粗提物溶液的步骤、通过盐酸水解法将所述人参茎叶总黄酮粗提物溶液中的黄酮糖苷转化为黄酮苷元的转化步骤、干燥步骤。

本发明所述的从人参茎叶中制备黄酮苷元的方法，通过超声技术提取人参茎叶总黄酮粗提物的步骤中，乙醇浓度选自20％～100％的范围。

本发明所述的从人参茎叶中制备黄酮苷元的方法，通过超声技术提取人参茎叶总黄酮粗提物的步骤中，超声提取时间选自10～50分钟的范围。

本发明所述的从人参茎叶中制备黄酮苷元的方法，通过超声技术提取人参茎叶总黄酮粗提物的步骤中，超声提取温度可以选自40～80℃的范围。

本发明所述的从人参茎叶中制备黄酮苷元的方法，通过超声技术提取人参茎叶总黄酮粗提物的步骤中，超声提取功率选自200～400W的范围。

本发明所述的从人参茎叶中制备黄酮苷元的方法，通过超声技术提取人参茎叶总黄酮粗提物的步骤中，料液比选自1:10～1:50的范围。

本发明所述的从人参茎叶中制备黄酮苷元的方法，在配制人参茎叶总黄酮粗提物溶液的步骤中，将上述人参茎叶总黄酮粗提物使用低分子醇类化合物配成醇溶液。

本发明所述的从人参茎叶中制备黄酮苷元的方法，将上述人参茎叶总黄酮粗提物使用甲醇配成醇溶液。

本发明所述的从人参茎叶中制备黄酮苷元的方法，通过盐酸水解法将所述人参茎叶总黄酮粗提物溶液中的黄酮糖苷转化为黄酮苷元的转化步骤。

本发明所述的从人参茎叶中制备黄酮苷元的方法，在盐酸水解法制备人参茎叶黄酮苷元的步骤中，水解时间选自1～6小时的范围。

本发明所述的从人参茎叶中制备黄酮苷元的方法，在盐酸水解法制备人参茎叶黄酮苷元的步骤中，盐酸浓度选自1mol/L～6mol/L的范围。

通过本发明的从人参茎叶中制备黄酮苷元的方法，其操作工艺简单、时间短、成本低、转化率高，适合工业化生产。在天然活性物质的利用过程中，往往将其中的低效成分转化为高效成分。而化学盐酸法适合于小分子天然成分，工艺简单，时间短，成本低，转化率高，适合工业化生产。经多年的潜心研究，利用人参茎叶进行人参黄酮苷元的制备。从而使用被废弃的人参茎叶为主要原料，利用盐酸水解法将人参茎叶黄酮糖苷水解转化为黄酮苷元，而且原料来源丰富。

附图说明

图1是4种黄酮单体混合标样HPLC色谱图，按出峰顺序依为芦丁、槲皮素、山奈酚、异鼠李素；

图2是盐酸水解前样品液的HPLC色谱图；

图3是盐酸水解后样品液的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面，将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

图1是四种黄酮单体混合标样HPLC色谱图，按出峰顺序依为芦丁、槲皮素、山奈酚、异鼠李素；图2是盐酸水解前样品液的HPLC色谱 图；图3是盐酸水解后样品液的HPLC色谱图。由图2、3色谱图可以看出，人参茎叶中含有丰富的芦丁、少量的山奈酚；经盐酸水解后几乎全部转化为山奈酚，还有少量槲皮素及异鼠李素。

在本发明中，从人参茎叶中获取黄酮苷元的方法，其包括以下步骤：将人参茎叶进行干燥、粉碎后，以所定料液比浸泡规定时间，再利用超声技术进行提取，过滤、浓缩、石油醚脱色后得到人参茎叶总黄酮粗提物；其次，将人参茎叶总黄酮粗提物用甲醇配成规定浓度的溶液；以规定的体积比例在上述溶液加入盐酸溶液，在一定条件下水解；将水解液减压浓缩为浸膏；干燥处理。

在本发明中，人参茎叶采用吉林省汪清县产的经鉴定的人参茎叶；芦丁使用中国药品生物制品检定所提供；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等使用国产分析纯。

(一)制备人参茎叶总黄酮粗提物

将人参茎叶进行干燥、粉碎过20目筛后以规定料液比浸泡一定时间，利用超声技术进行提取，再经过过滤、浓缩、石油醚脱色后得人参茎叶总黄酮粗提物。利用超声波辅助，通过乙醇浓度、超声提取时间、超声提取温度、超声提取功率及料液比研究从人参茎叶中提取总黄酮。

在人参茎叶总黄酮粗提物的步骤中，进一步研究乙醇浓度对总黄酮含量的影响，具体而言，准确称取人参茎叶粉末1Kg，料液比为1:20，浸泡20min，以超声提取功率200W、超声提取温度60℃条件下提取20min，考察不同乙醇浓度下对人参茎叶总黄酮含量的影响。

在本发明中，乙醇浓度可以选择20％～100％的范围，优选为40％～100％的范围，最优选为80％。随着乙醇浓度的增加，人参茎叶总黄酮含量呈上升趋势；乙醇浓度达到80％时总黄酮含量基本上达到最高值，再增加乙醇浓度，总黄酮含量变化不大。当乙醇浓度超过80％的情况下，随着浓度的增加，提取液的颜色逐渐变为深绿色，叶绿素等低极性杂质在溶剂中的含量不断增加，影响后续纯化工序，因此不优选。

在人参茎叶总黄酮粗提物的步骤中，进一步研究超声提取时间对总黄酮含量的影响，具体而言，准确称取人参茎叶1Kg，80％乙醇浓度为溶剂，料液比1:20，浸泡20min，以超声提取功率200W、超声提取温度60℃条件下考察不同超声提取时间(10、20、30、40、50min)对人参茎叶总黄酮含量的影响。

在本发明中，提取时间可以选自10～50分钟的范围，优选为20～50分钟，更优选为40分钟，随着提取时间的增加，总黄酮含量呈上升趋势，超声提取时间为40分钟时，总黄酮含量最高；继续增加提取时间，总黄酮含量反而下降。

在人参茎叶总黄酮粗提物的步骤中，进一步研究超声提取温度对黄酮含量的影响，即，准确称取人参茎叶粉末1Kg，80％乙醇浓度为溶剂，料液比为1:20，浸泡20min，以超声提取功率200W条件下提取20min，考察不同超声提取温度(40、50、60、70、80℃)对人参茎叶总黄酮含量的影响。

在本发明中，超声提取温度可以选自40～80℃的范围，优选为60～80℃的范围，随着超声提取温度的上升，总黄酮含量也呈上升趋势；当超过60℃的情况下，总黄酮含量上升趋势不明显。因此，超声提取温度设定为60℃。

在人参茎叶总黄酮粗提物的步骤中，进一步研究超声提取功率对黄酮含量的影响，即，准确称取人参茎叶粉末1Kg，80％乙醇浓度为溶剂，料液比为1:20，浸泡20min，60℃条件下，提取20min，考察不同超声提取功率200、250、300、350、400W对人参茎叶总黄酮含量的影响。

在本发明中，超声提取功率选自200～400W的范围，优选300～400W的范围，更优选为350W。随着超声提取功率的增加，总黄酮含量也增加，当功率达到350W时达到最大，随后又下降。

在人参茎叶总黄酮粗提物的步骤中，进一步研究料液比对总黄酮含量的影响，即，准确称取人参茎叶粉末1Kg，80％乙醇浓度为溶剂，以不同料液比(1:10、1:20、1:30、1:40、1:50)浸泡20min，在功率200W、60℃条件下提取20min，考察不同料液比对人参茎叶总黄酮含量的影 响。在本发明中，液料比可以选自1:10～1:50的范围，优选为1:10～1:30的范围，更优选为1:20。当料液比为1:20时，总黄酮含量达到最高。

(二)配制人参茎叶总黄酮粗提物溶液

在配制人参茎叶总黄酮粗提物溶液的步骤中，将上述人参茎叶总黄酮粗提物使用低分子醇类化合物配成15mg/mL溶液，所述低分子醇类化合物可以选自碳原子数为1～4的低分子醇类化合物中任意一种以上化合物，但优选使用甲醇。

(三)盐酸水解法制备人参茎叶黄酮苷元

将人参茎叶总黄酮粗提物用甲醇配成15mg/mL溶液；将溶液放入密闭水解管中，加入盐酸溶液，恒温水解。

在盐酸水解法制备人参茎叶黄酮苷元的步骤中，水解时间可以选择1～6h，优选为3～6h。随着时间的延长，水解液中三种苷元含量上升；当时间达到3h时含量最高；随后稍有下降，但变化不大，说明3h时水解过程基本完成。

此外，在盐酸水解法制备人参茎叶黄酮苷元的步骤中，水解温度可以选择40～80℃的范围，优选为60℃。随着温度的上升，水解液中三种苷元含量出现上升、下降、又上升的变化；当温度达到60℃时含量最高，故优选。

在盐酸水解法制备人参茎叶黄酮苷元的步骤中，盐酸浓度可以选择1mol/L～6mol/L，优选为2mol/L～6mol/L，随着盐酸浓度的增加，水解液中三种苷元含量也增加；但在浓度为2mol/L时含量达到最高后，变化不大；继续增加含量开始下降。可能是因为强酸条件下，不仅糖苷键断裂，苷元也会被分解。

(四)将水解液减压浓缩为浸膏；干燥处理。

实施例1

称取1Kg人参茎叶干燥粉碎后的粉末；加入20L的体积分数67％ 乙醇超声波提取50min，过滤后浓缩，利用3倍体积石油醚脱色三次得人参茎叶总黄酮粗提物；加入甲醇配成15mg/mL溶液；将溶液放入密闭水解管中，加入1/4体积2mol/L盐酸溶液，置于60℃恒温水浴中水解3h；减压浓缩为浸膏；干燥处理，得人参茎叶黄酮苷元，以槲皮素、山奈酚、异鼠李素计，苷元含量为6.08％，转化率为95.89％。

实施例2

称取1Kg人参茎叶干燥粉碎后的粉末；加入20L的体积分数67％乙醇超声波提取50min，过滤后浓缩，利用3倍体积石油醚脱色三次得人参茎叶总黄酮粗提物；加入甲醇配成15mg/mL溶液；将溶液放入密闭水解管中，加入1/4体积4mol/L盐酸溶液，置于50℃恒温水浴中水解3h；减压浓缩为浸膏；干燥处理，得人参茎叶黄酮苷元，以槲皮素、山奈酚、异鼠李素计，苷元含量为5.54％，转化率为95.48％。

实施例3

称取1Kg人参茎叶干燥粉碎后的粉末；加入20L的体积分数67％乙醇超声波提取50min，过滤后浓缩，利用3倍体积石油醚脱色三次得人参茎叶总黄酮粗提物；加入甲醇配成15mg/mL溶液；将溶液放入密闭水解管中，加入1/4体积4mol/L盐酸溶液，置于70℃恒温水浴中水解4h；减压浓缩为浸膏；干燥处理，得人参茎叶黄酮苷元，以槲皮素、山奈酚、异鼠李素计，苷元含量为5.58％，转化率为95.53％。

实施例4

称取1Kg人参茎叶干燥粉碎后的粉末；加入20L的体积分数67％乙醇超声波提取50min，过滤后浓缩，利用3倍体积石油醚脱色三次得人参茎叶总黄酮粗提物；加入甲醇配成15mg/mL溶液；将溶液放入密闭水解管中，加入1/4体积2mol/L盐酸溶液，置于50℃恒温水浴中水解5h；减压浓缩为浸膏；干燥处理，得人参茎叶黄酮苷元，以槲皮素、山奈酚、异鼠李素计，苷元含量为4.49％，转化率为94.43％。

实施例5

称取1Kg人参茎叶干燥粉碎后的粉末；加入20L的体积分数67％乙醇超声波提取50min，过滤后浓缩，利用3倍体积石油醚脱色三次得人参茎叶总黄酮粗提物；加入甲醇配成15mg/mL溶液；将溶液放入密闭水解管中，加入1/4体积4mol/L盐酸溶液，置于60℃恒温水浴中水解4h；减压浓缩为浸膏；干燥处理，得人参茎叶黄酮苷元，以槲皮素、山奈酚、异鼠李素计，苷元含量为6.02％，转化率为95.85％。

实施例6

称取1Kg人参茎叶干燥粉碎后的粉末；加入20L的体积分数67％乙醇超声波提取50min，过滤后浓缩，利用3倍体积石油醚脱色三次得人参茎叶总黄酮粗提物；加入甲醇配成15mg/mL溶液；将溶液放入密闭水解管中，加入1/4体积3mol/L盐酸溶液，置于60℃恒温水浴中水解5h；减压浓缩为浸膏；干燥处理，得人参茎叶黄酮苷元，以槲皮素、山奈酚、异鼠李素计，苷元含量为5.95％，转化率为95.79％。

实施例7

称取1Kg人参茎叶干燥粉碎后的粉末；加入20L的体积分数67％乙醇超声波提取50min，过滤后浓缩，利用3倍体积石油醚脱色三次得人参茎叶总黄酮粗提物；加入甲醇配成15mg/mL溶液；将溶液放入密闭水解管中，加入1/4体积3mol/L盐酸溶液，置于70℃恒温水浴中水解3h；减压浓缩为浸膏；干燥处理，得人参茎叶黄酮苷元，以槲皮素、山奈酚、异鼠李素计，苷元含量为6.24％，转化率为96.00％。

实施例8

称取1Kg人参茎叶干燥粉碎后的粉末；加入20L的体积分数67％乙醇超声波提取50min，过滤后浓缩，利用3倍体积石油醚脱色三次得人参茎叶总黄酮粗提物；加入甲醇配成15mg/mL溶液；将溶液放入密闭水解管中，加入1/4体积3mol/L盐酸溶液，置于50℃恒温水浴中水解4h；减压浓缩为浸膏；干燥处理，得人参茎叶黄酮苷元，以槲皮 素、山奈酚、异鼠李素计，苷元含量为4.83％，转化率为94.82％。

实施例9

称取1Kg人参茎叶干燥粉碎后的粉末；加入20L的体积分数67％乙醇超声波提取50min，过滤后浓缩，利用3倍体积石油醚脱色三次得人参茎叶总黄酮粗提物；加入甲醇配成15mg/mL溶液；将溶液放入密闭水解管中，加入1/4体积2mol/L盐酸溶液，置于70℃恒温水浴中水解5h；减压浓缩为浸膏；干燥处理，得人参茎叶黄酮苷元，以槲皮素、山奈酚、异鼠李素计，苷元含量为6.16％，转化率为95.95％。

试验例1、标准曲线的绘制

将120℃干燥至恒重的芦丁标准品5mg用70％乙醇溶解并定容至25mL，配成浓度为0.20mg/mL标准溶液。准确吸取标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别置于10mL试管中，用70％乙醇补充至2mL，加5％的NaNO₂溶液0.3mL，摇匀后静置6min，然后加入10％Al(NO₃)₃溶液0.3mL，摇匀静置6min，最后加4％NaOH溶液2mL，摇匀静置10min后于510nm波长测定吸光度A。以芦丁质量为横坐标，吸光度A为纵坐标进行线性回归，得方程：y＝0.003x+0.0039，R²＝0.9999。总黄酮测定及含量的计算如下：

准确吸取提取液0.2mL，加入70％乙醇补至2mL，按标准曲线制备操作步骤测定吸光度。由标准曲线得出以芦丁表示的总黄酮含量。

式中：X为根据标准曲线计算出芦丁含量，μg；

V为待测液定容总体积，mL；

V₀为测定吸光度用样液的体积，mL；

m为人参茎叶质量，g。

结合具体实施例进一步对本发明方案进行说明，但它们不是对本发明的限定。

试验例2、制作标准曲线

1)以芦丁、槲皮素、山奈酚、异鼠李素四种单体化合物为标准品，分别用甲醇配成0.2mg/mL标准溶液；各吸取1mL配成混合标准溶液；混匀后利用0.45um微孔膜过滤，以进样体积5、10、15、20uL作HPLC分析，以峰面积对进样量进行回归，得到标准曲线。

2)HPLC色谱条件：Inertsustain C₁₈色谱柱(4.6mm×150mm，5um)。流动相为乙腈(A)—0.4％磷酸水(B)梯度洗脱，0～10min(10％～20％A)，10～30min(20％～40％A)，30～40min(40％～10％A)，40～55min(10％A)；柱温为40℃，进样量10uL；检测波长360nm；流速0.8mL/min。

3)结果如表1：

四种单体化合物的保留时间、标准曲线、R²及线性范围见表1。

表1.四种黄酮标准曲线

通过本发明，原料多、生产制备方法简单、转化率高，为95％以上。小分子天然成分，工艺简单，时间短，成本低，转化率高，适合工业化生产。超声技术可以加速细胞的破碎，有利于有效成分的溶出。

上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。任何熟悉本领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可以轻易对本实施例做出各种修改，并把在此说明的原理应用到其它实例施而不必经过创造性劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，不脱离本发明范畴所做出改进和修改都应涵盖在本发明的保护范围之内。