一种肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型检测方法

摘要

本发明公开了一种肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型检测方法，所述方法为：以待测菌株基因为模板，在引物1和引物2作用下进行PCR扩增反应，然后以扩增产物为模板，在引物3-引物8的混合引物作用下进行SNaPshot PCR反应；根据SNaPshot PCR反应产物进行分型；本发明首次提供了一种同时对KPC1-KPC15共14种亚型的分型检测方法，检测通量较传统的定量检测方法都高，准确度可与测序检测方法相当，费用更低。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型检测方法。

(二)背景技术

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)为常见院感病原菌，是临床 医院感染重点监测的病原菌之一。随着碳青霉烯类抗生素的大范围使用， 多药耐药株肺炎克雷伯菌不断出现。由肺炎克雷伯菌感染导致巴西大规模 流行的“超级细菌”事件使全球的目光又聚焦到了“多重抗生素耐药”和“肺 炎克雷伯菌”上。

据报道，一些肠杆科属细菌体内也发现携带肺炎克雷伯菌型碳青霉烯 酶，如大肠埃希菌、沙门菌、阴沟肠杆菌、产酸克雷伯菌、沙雷菌等，使 得利用临床抗生素治疗细菌感染性疾病失败或者造成治病疗程延缓。肺炎 克雷伯菌产生耐药性的机理主要是菌体产生质粒介导的超广谱β-内酰胺 酶(ESBLs)和头孢菌素酶(AmpC酶)，进而导致菌体外膜孔蛋白丢失、抗 菌药物主动外排、生物被膜形成、基因变异等，因此针对于抑制上述两种 酶活性的抗生素治疗是解决肺炎克雷伯菌耐药性的关键。碳青霉烯类抗生 素是目前临床使用的抗菌活性最强、抗菌谱最广的一类抗生素，尤其对产 超广谱β-内酰胺酶和头孢菌素酶的菌株治疗效果极佳，因此在临床上被 广泛使用。随着该类抗生素使用频率的不断提高，在世界范围内不断出现 了产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae carbapenemase， KPC)。碳青霉烯酶是一种由质粒编码并能够被克拉维酸抑制的酶类，能 够水解碳青霉烯类、青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等抗生素，因此该类 菌株的出现是导致临床抗生素治疗失败的主要原因。肺炎克雷伯菌型碳青 霉烯酶是近年来发现的新型碳青霉烯酶类，属于Bush分类的2f组，Ambler 分类的A类，能够水解碳青霉烯类、青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等 临床常用的抗生素。肺炎克雷伯菌型碳青霉烯酶基因位于可转移的质粒 上，可依靠质粒、整合子、插入序列的基因元件进行传播，这也是多药耐 药菌株易于传播的重要原因。

目前有报道采用多重荧光定量PCR技术结合酶切的方法针对肺炎克 雷伯菌KPC-2和KPC-3型碳青霉烯酶进行分型。最新的文献报道采用多 重荧光定量PCR结合分子信标技术对11种类型的肺炎克雷伯菌碳青霉烯 酶基因进行区分。该11种碳青霉烯酶基因型是由5个不同的基因多态性 位点构成。

对于肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因分型及新基因筛查相关工作开展 较少，国内并无该方面研究，而且对于每种肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因 亚型的生物学功能尚不清楚。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型分类方法，该 方法对肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase， KPC)基因KPC 1-15共14种亚型进行分型，该方法涉及一对大片段扩增 引物，六条SNaPshot检测用引物，扩增结果使用毛细管测序基因分析仪 检测，操作方便。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型检测方法，所述方法 为：以待测菌株基因为模板，在引物1和引物2作用下进行PCR扩增反 应，然后以扩增产物为模板，在引物3-引物8的混合引物作用下进行 SNaPshot PCR反应，对SNaPshot PCR产物进行测序；

若SNaPshot PCR产物在147位、308位和814位均为C碱基(即胞 嘧啶)，272位为T碱基(即胸腺嘧啶)，502位为G碱基(即鸟嘌呤)， 716位为A碱基(即腺嘌呤)，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-1 或KPC-2；

若SNaPshot PCR产物在147位、308位为C碱基，272位和814位 为T碱基，502位为G碱基，716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯 酶基因型为KPC-3；

若SNaPshot PCR产物在147位、716位和814位为C碱基，在308 位和502位为G碱基，在272位为T碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基 因型为KPC-4；

若SNaPshot PCR产物在147位和814位为C碱基，在308位和502 位为G碱基，在272位为T碱基，在716位为A碱基，则待测菌株的碳 青霉烯酶基因型为KPC-5；

若SNaPshot PCR产物在147位、308位、716位和814位为C碱基， 在272位为T碱基，在502位为G碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因 型为KPC-6；

若SNaPshot PCR产物在147位、272位和814位为T碱基，在308 位为C碱基，在502位为G碱基，在716位为A碱基，则待测菌株的碳 青霉烯酶基因型为KPC-7；

若SNaPshot PCR产物在147位、308位和716位为C碱基，在272 位和814位为T碱基，在502位为G碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基 因型为KPC-8；

若SNaPshot PCR产物在147位和308位为C碱基，在272位和814 位为T碱基，在502位和716位为G碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基 因型为KPC-9；

若SNaPshot PCR产物在147位为C碱基，在308位和502位为G碱 基，在272位和814位为T碱基，716位为A碱基，则待测菌株的碳青 霉烯酶基因型为KPC-10；

若SNaPshot PCR产物在147位和814位为C碱基，在502位为G碱 基，在308位和272位为T碱基，716位为A碱基，则待测菌株的碳青 霉烯酶基因型为KPC-11；

若SNaPshot PCR产物在147位、308位和814位为C碱基，在272 位和502位为T碱基，716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因 型为KPC-12；

若SNaPshot PCR产物在147位、308位和272位为C碱基，在502 位为G碱基，在814位为T碱基，716位为A碱基，则待测菌株的碳青 霉烯酶基因型为KPC-13；

若SNaPshot PCR产物在147位、308位、272位和814位为C碱基， 在502位为G碱基，716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型 为KPC-14；

若SNaPshot PCR产物在147位和716位为C碱基，在308位和502 位为G碱基，在272位和814位为T碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基 因型为KPC-15；

引物1为：5’-CTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGT-3’；

引物2为：5’-CAGAGCCTTACTGCCCGTTGA-3’；

引物3为：5’-(T)₃GCGCCTGAGCCGGTATC-3’，(T)₃表示有3个T， 即(T)₃为TTT；

引物4为：5’-(T)₉GCAAAAATGCGCTGGTTC-3’，(T)₉含义同(T)₃；

引物5为：5’-(T)₁₄CCGTAACGGATGGGTGTG-3’，(T)₁₄含义同(T)₃；

引物6为：5’-(T)₂₀GGGATGGCGGAGTTCA-3’，(T)₂₀含义同(T)₃；

引物7为：5’-(T)₂₈GTCATTTGCCGTGCCATAC-3’，(T)₂₈含义同 (T)₃；

引物8为：5’-(T)₃₈GCGCCTAACAAGGATGACAAG-3’，(T)₃₈含义 同(T)₃。

进一步，所述PCR扩增反应体系为：基因组DNA0.5μL、反应混合 物10.0μL，0.1-3.5μM引物混合物5.0μL、5U/μL热启动Taq酶1.0μL， sdH₂O补足至25.0μL；所述反应混合物为2.5×PCR缓冲液、MgCl₂1.2-3.0 mM和dNTPs 200μM。

进一步，所述PCR扩增程序为95℃初始变性5分钟，30个循环：94℃ 1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟，72℃终延伸5分钟，4℃保温。

PCR产物经2.5U CIAP(宝生物碱性磷酸酶)和5U Exo I处理后， 以美国生命科技公司(life technology)的ABI PRISM SNaPshot Multiplex  Kit进行反应，所述SNaPshot PCR反应体系为：反应缓冲液Reaction  Mix0.5μL，PCR产物2.0μL，引物混合物1.0μL，水1.5μL。所述SNaPshot  PCR反应程序为：预变性96℃，10秒，96℃变性10秒，53℃延伸5秒， 60℃30秒，30个循环；终延伸60℃10秒，4℃保温。

本发明首先从NCBI数据库下载KPC 1-15序列(KPC-1：AF297554； KPC-2：GU086225；KPC-3：AF395881；KPC-4：FJ473382；KPC-4： AY700571；KPC-5：EU400222；KPC-6：EU555534；KPC-7：EU729727； KPC-8：FJ234412；KPC-9：FJ624872；KPC-10：GQ140348；KPC-11： HM066995；KPC-12：HQ641422；KPC-13：HQ342889.1；KPC-14： JX524191；KPC-15：KC433553)，经序列比对之后，选择了6个SNP 位点(nt147，nt272，nt308，nt502，nt716及nt814)，这些位点可以将 KPC1-KPC15分成14种不同的亚型(KPC1与KPC2基因型相同)；其次设 计一对大片段引物(引物1和引物2)对检测模板进行富集，富集后模板 经纯化后，通过6条引物(引物3-引物8)，应用SNaPshot分型检测技 术，对14种亚型进行分型。SNaPshot是一种基于单碱基延伸原理的基因 分型新方法，可以同时对多种基因突变位点高通量鉴别，方法为设计单条 检测探针，使其将要延伸的第一个碱基就是需进行基因分型的位点，用荧 光标记的双脱氧NTPs(ddNTPs)作为测序底物，使其测序反应只延伸一个 碱基，从而能够鉴定该SNP。SNaPshot能同时对7-8个不同的SNP位点 进行96个样本基因分型，是一种快速、高通量的基因分型新方法，可加 快基因分型的研究速度，该技术的出现为大规模基因突变位点的筛查提供 了一种快速、准确、高通量的诊断方法，弥补了基因芯片方法不稳定、荧 光定量PCR检测数量有限等不足。

本发明首次提供了一种同时对KPC1-KPC15共14种亚型的分型检测 方法，检测通量较传统的定量检测方法都高。准确度可与测序检测方法相 当，费用更低。

(四)附图说明

图1 KPC-2型菌株检测结果，分型结果分别为：nt147C、nt308C、 nt272T、nt502G、nt716A及nt814C。

图2 KPC-3型菌株检测结果，分型结果分别为：nt147C、nt308C、 nt272T、nt502G、nt716A及nt814T。

图3 KPC-4型菌株检测结果，分型结果分别为：nt147C、nt308G、 nt272T、nt502G、nt716C及nt814C。

图4 KPC-5型菌株检测结果，分型结果分别为：nt147C、nt308G、 nt272T、nt502G、nt716A及nt814C。

图5 KPC-8型菌株检测结果，分型结果分别为：nt147C、nt308C、 nt272T、nt502G、nt716C及nt814T。

图6 KPC-11型菌株检测结果，分型结果分别为：nt147C、nt308T、 nt272T、nt502G、nt716A及nt814C。

图7 临床收集的耐药KPC菌株检测结果，分型结果分别为：nt147C、 nt308C、nt272T、nt502G、nt716A及nt814C。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

实施例1 KPC1-15的分型位点的选择及引物设计

NCBI数据库下载KPC 1-15序列(KPC-1：AF297554；KPC-2： GU086225；KPC-3：AF395881；KPC-4：FJ473382；KPC-4：AY700571； KPC-5：EU400222；KPC-6：EU555534；KPC-7：EU729727；KPC-8： FJ234412；KPC-9：FJ624872；KPC-10：GQ140348；KPC-11：HM066995； KPC-12：HQ641422；KPC-13：HQ342889.1；KPC-14：JX524191；KPC-15： KC433553)。序列经ClusterX比对之后，选择了6个SNP位点(nt147， nt272，nt308，nt502，nt716及nt814)。

设计了一对大片段引物进行模板富集，其扩增区域包含所需要检测的 6个SNP位点。Snapshot可以检测多重的SNP，选择6个位点做一个组 合，对这些目的SNP位点进行引物的设计。每个SNP设计的引物是延伸 ddNTP，设计在SNP位点的上游或者是反向的下游。具体见表1。KPC1-15 的分型见表2。

表1.大片段扩增引物及SNaPshot PCR引物

表2 KPC1-15的14种亚型分型

实施例2、已知菌株的检测

1、6种不同KPC亚型菌株DNA(KPC-2、KPC-3、KPC-4、KPC-5、 KPC-8及KPC-11)由浙江省疾病预防控制中心提供，浓度为1ng/μl，分 型结果经测序验证。

2、模板富集，用大片段引物(KPCF和KPCR)扩增模板：

PCR扩增体系：

扩增热循环

(l)将PCR扩增管置于热循环仪上；

(2)选择下面推荐的程序进行扩增；

(3)扩增后的样品应避光保存；

热循环仪的扩增程序：

PCR产物的处理

分别取6株菌株的PCR扩增产物3μL+0.7μL酶混合液(含2.5U CIAP (宝生物碱性磷酸酶)和5U Exo I)，振荡混匀，37℃孵育保温1h，然后 75℃保温15min，以灭活CIAP和Exo I酶。处理后的产物可以在4℃保 存24h或-20℃长期保存。

3、SNaPshot PCR

先将SNP引物(即引物3-引物8)稀释到100μM，混合SNaPshot 的PCR引物：每种引物在反应体系中的终浓度分别为1.6μM(每个SNP 引物加4-10μl到100μl ddH₂O中)。以美国生命科技公司(life technology) 的ABI PRISM SNaPshot Multiplex Kit试剂盒进行反应。

反应体系:

SNaPshot的PCR扩增程序：

SNaPshot PCR纯化

在5μL上述SNaPshot PCR产物中加入0.5U CIAP酶或者1U CIP， 震荡混匀，37℃保温1h，75℃保温15min以灭活酶，4℃可保存24h 或-20℃长期保存。

4、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测

由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(liz-120)组成上样混合物 〔(0.5μL liz-120)×(进样数)+(12μL去离子甲酰胺)×(进样数)〕。 将12.5μL上样混合物与SNaPshot PCR纯化后产物混合，避免产生气泡。 95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳。用遗传分析仪检测分析。

5、分型分析

用片段分析软件GeneMapper分析步骤4中遗传分析仪检测收集的数 据，软件根据产物测序仪电泳结果，出峰的大小确定位点，峰的颜色对应 的不同碱基(绿色为A碱基、红色为T，黑色为C，蓝色为G)。分析结 果如图1-图6，得到实际样品的基因分型数据，分型结果与预期相符。分 析后结果如下表3。

表3 6株已知分型KPC菌株SNaPshot检测结果

实施例3临床样本SNaPshot分型检测

1、样本收集

收集海宁市2008-2012年间各医院上送的肺炎克雷伯菌临床分离株。 在本实验室内做进一步鉴定，在麦康凯培养基平板上分离纯化，经法国生 物梅里埃Vitek-compact全自动细菌分析鉴定为肺炎克雷伯菌的，刮取菌 落至专用的磁珠保存管中制成均匀的菌悬液，吸干液体，置于-70℃的低 温冰箱保存。将菌株在麦康凯培养基平板上复苏培养，采用K-B(也称纸 片扩散法)，挑一定量细菌配成0.5麦氏比浊的菌液，均匀涂布于MH平 板上，室温干燥3～5min。分别贴亚胺培南、美罗培南和厄他培南3种 纸片，各纸片中心大于24mm，纸片距离平板边缘应大于15mm。置37℃ 孵育16～18h后读取结果，判断标准参照CLSI(2008)。676株肺炎克雷伯 菌中，有21株存在对亚胺培南，美罗培南，厄他培南不同程度的耐药。

详见表4。

表4 耐药的肺炎克雷伯菌的KB法药敏结果

2、21株耐药肺炎克雷伯菌做KPC SNaPshot分型检测

1)模板富集，用大片段引物扩增模板：

PCR扩增体系

扩增热循环

a)将PCR扩增管置于热循环仪上；

b)选择下面推荐的程序进行扩增；

c)扩增后的样品应避光保存；

热循环仪的扩增程序

2)PCR产物的处理

分别取21株菌株PCR扩增产物3μL+0.7μL酶混合液(含2.5U CIAP 和5U Exo I)，振荡混匀，37℃孵育保温1h，然后75℃保温15min以灭 活CIAP和Exo I酶。处理后的产物可以在4℃保存24h或-20℃长期保 存。

3)SNaPshot PCR

先将SNP引物稀释到100μM，混合SNaPshot的PCR引物：每种引 物在反应体系中的终浓度分别为1.6μM(每个SNP引物加4-10μl到100μl  ddH₂O中)。以美国生命科技公司(life technology)的ABI PRISM  SNaPshot Multiplex Kit试剂盒进行反应，试剂盒组分有Reaction Mix，水。

反应体系:

反应程序：

4)SNaPshot PCR纯化

在5μL上述SNaPshot PCR产物中加入0.5U CIAP酶或者1U CIP， 震荡混匀，37℃保温1h，75℃保温15min以灭活酶，4℃可保存24h 或-20℃长期保存。

5)扩增产物在遗传分析仪上荧光检测

由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(liz-120)组成上样混合物 〔(0.5μL liz-120)×(进样数)+(12μL去离子甲酰胺)×(进样数)〕。 将12.5μL上样混合物与SNaPshot PCR纯化后产物混合，避免产生气泡。 95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳。用遗传分析仪检测分析。

6)分型分析

用片段分析软件GeneMapper分析步骤5)中遗传分析仪检测收集的 数据。检测结果表明，筛选出的21株耐药菌均为KPC-2型。这也是国内 外报道较多的一种亚型。其中一个检测图见图7。