花生维生素E合成相关基因APG1、APG2在提高植物α生育酚含量和耐盐性中的应用

摘要

本发明提供了花生维生素E合成相关基因APG1、APG2在提高植物α生育酚含量和耐盐性中的应用，两基因APG1、APG2的氨基酸序列的同源性为98.6%。本发明经实验证明，将这2个基因分别在花生中超量表达后，得到活性最高的α生育酚含量明显提高的转基因植株，且可明显增强转基因花生种子和植株的耐盐性；将这2个基因的反义载体转入花生后，转基因植株的α生育酚含量明显减少。本发明的蛋白及其编码基因对于植物维生素E合成机制的研究，提高植物的α生育酚含量，改良植物的抗逆性具有重要的理论及实际意义，应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及花生维生素E合成相关基因APG1、APG2在提高植物α生育酚含量和耐盐性中的应用。

背景技术

维生素E是一种脂溶性的小分子抗氧化剂，分为生育酚和生育三烯酚两类，各包括α-、β-、γ-和δ-四种类型，其中以α-生育酚的活性最高，可以被人和动物高效吸收和利用。维生素E具有酚氧基结构，在植物光合组织中可使逆境胁迫产生的活性氧自由基失活，并通过与膜脂水解产物形成复合物，清除类囊体膜上的脂质过氧化产物，阻止膜脂过氧化的扩大，保护膜的完整性，从而增强植株的抗逆境胁迫能力。在非光合组织中，维生素E能淬灭并能同单线态氧反应，保护不饱和脂质免受单线态氧损伤；还可以被超氧阴离子自由基氧化，使不饱和油脂免受自由基攻击，从而抑制油脂的自动氧化，延长油脂的贮存期。另外维生素E还具有调节脂肪酸合成、糖类运输、茉莉酸和乙烯信号转导，促进种子萌发等功能。

维生素E主要在高等植物的叶绿体内膜上合成，储存于植物的叶片和种子中，尤其是油料植物的种子。维生素E合成的第一步是前体—尿黑酸(HGA)和植基二磷酸(PDP)的合成。第二步是HGA与PDP的缩合，它由尿黑酸植基转移酶(HPT)催化，生成2-甲基-6-植基-1,4-苯醌(MPBQ)。第三步是MPBQ在2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶的作用下形成2,3-甲基-5-植基-1,4-苯醌，后者由生育酚环化酶(TC)和γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)催化形成γ-和α-生育酚；MPBQ也可由TC和γ-TMT直接催化形成δ-和β-生育酚。

发明内容

本发明提供了花生维生素E合成相关基因APG1、APG2在提高植物α生育酚含量和耐盐性中的应用，本发明通过将APG基因转入花生中，可以显著提高转基因植株的维生素E含量和种子的耐盐性。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

花生APG-1基因在提高植物α生育酚含量中的应用，所述花生APG-1基因的序列表如SEQ ID No:1所示，其氨基酸序列表如SEQ ID No:2所示。

进一步的，所述花生APG-1基因能提高植物的α生育酚含量，转APG-1基因植株叶片中α生育酚含量达到对照的1.74倍；将花生APG-1反义载体进行遗传转化后明显减少α生育酚含量，转基因植株叶片中α生育酚含量达对照的20.9%。

花生APG-2基因在提高植物α生育酚含量中的应用，所述花生APG-2基因的序列表如SEQ ID No:3所示，其氨基酸序列表如SEQ ID No:4所示。

进一步的，所述花生APG-2基因能提高植物的α生育酚含量，转APG-2基因植株叶片中α生育酚含量达到对照的1.34倍；将花生APG-2反义载体进行遗传转化后能明显减少α生育酚含量，转基因植株叶片中α生育酚含量达对照的13.7%。

花生APG-1基因在提高植物耐盐性中的应用，所述花生APG-1基因的序列表如SEQ ID No:1所示，其氨基酸序列表如SEQ ID No:2所示。

进一步的，所述花生APG-1基因受盐胁迫处理的诱导表达，将花生APG-1基因在花生中超量表达，花生转基因种子在0.7% NaCl溶液中发芽率达到36%，同时转基因植株耐盐性增强。

花生APG-2基因在提高植物耐盐性中的应用，所述花生APG-2基因的序列表如SEQ ID No:3所示，其氨基酸序列表如SEQ ID No:4所示。

进一步的，所述花生APG-2基因受盐胁迫处理的诱导表达，将花生APG-2基因在花生中超量表达，花生转基因种子在0.7% NaCl溶液中发芽率达到49%，同时转基因植株耐盐性增强。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1、本发明从花生中克隆了APG-1和APG-2基因（测序结果表明这2个基因均有3个外显子， 分别对应APG-1和APG-2的碱基均为20-610，1125-1428，2262-2422。

2、转APG-1和APG-2基因花生植株形态发育正常，过量表达APG-1和APG-2基因后，转基因花生叶片中α生育酚含量分别可达到295.4和226.5 μg/g鲜重，分别为对照（169.6 μg/g鲜重）的1.74和1.34倍；而将花生APG-1和APG-2反义载体进行遗传转化后，转基因植株叶片中α生育酚含量可降低到35.5和23.2 μg/g鲜重，分别只有对照的20.9%和13.7%。本发明中的APG-1和APG-2可明显改变花生叶片中α生育酚含量（图4）。

3、APG-1和APG-2基因均受盐胁迫诱导表达，APG-1基因受盐胁迫诱导48 h时可达到对照的27.7倍；APG-2基因受盐胁迫诱导6 h时可达到对照的9倍（图3）。

4、将花生APG-1和APG-2基因在花生中超量表达，花生转基因种子在0.7% NaCl溶液中发芽率分别可达到36%和49%，而非转基因种子的发芽率只有15%；本发明将APG-1和APG-2基因在花生过量表达可显著提高种子（图5）和植株（图6）的耐盐性。

本发明以花生这一重要的油料作物为实验材料，克隆了2个维生素E生物合成途径中的重要基因APG-1和APG-2，并对其功能验证。这将为以后通过基因工程调控花生的α生育酚含量和提高植株的抗逆能力奠定基础。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是本发明中花生的遗传转化，A: 在SIM培养基上共培养3 d的子叶外植体; B: 在SIM+cef培养基上培养2 w的子叶外植体; C: 添加100 mg /L卡那霉素的SEM+cef培养基上筛选的抗性芽（培养4 w）; D: 150 mg /L卡那霉素的SEM+cef培养基上筛选的抗性苗（培养6 w）。

图2是本发明中拟转APG-1和APG-2基因植株的PCR鉴定，左侧为拟转APG-1基因阳性苗鉴定：M: DL2000; 1: 未转基因植株（对照）; 2-8: 拟转基因植株；右侧为拟转APG-2基因阳性苗鉴定：M: DL2000; 1: 未转基因植株（对照）; 2-8: 拟转基因植株

图3是本发明中1.5% NaCl胁迫处理后APG-1和APG-2基因在不同时间段的相对表达量。

图4是本发明中对照花育23号和T₂代转基因花生种子在0.7%的NaCl溶液中的发芽情况；a: 花育23号种子；b: 过量表达APG-1基因的T₂代花生种子；c: 过量表达APG-2基因的T₂代花生种子。

图5是本发明中对照花育23号和T₂代转基因植株经1.5%的NaCl溶液胁迫处理7天后的情况；左：花育23号种子；中：过量表达APG-1基因的T₂代花生植株；右：过量表达APG-2基因的T₂代花生植株。

图6是本发明中用高效液相色谱测定对照花育23号和T₂代转基因植株叶片的生育酚含量，图6a: 花育23号叶片的生育酚含量；图6b: 过量表达APG-1基因的T₂代花生叶片的生育酚含量；图6c: 过量表达APG-2基因的T₂代花生叶片的生育酚含量；图6d: 转化反义APG-1基因的T₂代花生叶片的生育酚含量果；图6e: 转化反义APG-2基因的T₂代花生叶片的生育酚含量。

图7是本发明中过量表达APG1 基因T₂代种子的品种性状。

图8是本发明中过量表达APG2基因T₂代种子的品种性状。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步详细的说明。

实施例1：花生维生素E合成相关基因APG1、APG2

一、实验材料

1.基因、菌种与花生品种

本发明克隆了花生2个APG基因(AhAPG-1和AhAPG-2)，大肠杆菌DH5α由青岛农业大学遗传研究室实验室保存，根癌农杆菌菌株EHA105（购自北京天恩泽基因科技有限公司），转基因的受体材料为花生品种 “花育23号”（由山东农科院花生所育成，青岛农业大学遗传研究室实验室引进）。

2.植物培养基

花生转化中采用的培养基有：

基本培养基：为MS无机盐+B₅有机成分（简称MSB₅），添加3%蔗糖、0.8%琼脂，pH=5.8，在121℃、105 Kpa条件下灭菌20min；

SIM诱导培养基：MSB₅+5 mg/L BAP +1.5 mg/L 2,4-D；

SEM芽伸长培养基：MSB₅+5 mg/L BAP。

cef: 头孢霉素。

二、实验方法

本发明包括以下具体实验步骤：

1、扩增获得APG基因全序列

花生APG-1基因，其序列表如SEQ ID No:1所示，其氨基酸序列表如SEQ ID No:2所示。

花生APG-2基因，其序列表如SEQ ID No:3所示，其氨基酸序列表如SEQ ID No:4所示。

克隆所述花生APG-1和APG-2基因的引物名称与序列如下：

P1：5＇- TCAGGTTCCTTCTTCAACAATGGCT -3＇（SEQ ID No:7）；

P2：5＇- ACGGCTCTTAGATTGGCTGACCCT -3＇（SEQ ID No:8）;

分别与APG-1基因第1-25碱基、第2406-2429碱基对应；与APG-2基因第1-25碱基、第2406-2429碱基对应。

2、APG基因植物表达载体的构建

(1)扩增APG基因编码区

花生品种“花育23号” 由青岛农业大学遗传研究室实验室引进，通过RT-PCR扩增了APG基因的编码区（APG1编码区序列表如SEQ ID No:5所示，APG2编码区序列表如SEQ ID No:6所示）。

P3：5＇- GGTACCTCAGGTTCCTTCTTCAACAATGGCT -3＇ (KpnI) （SEQ ID No:9）；

P4：5＇- GGTACCACGGCTCTTAGATTGGCTGACCCT -3＇(KpnI) （SEQ ID No:10）；

上述引物序列除去酶切接头外分别与AhAPG-1基因的第1-25碱基、第1059-1082碱基对应；与AhAPG-2基因的第1-25碱基、第1059-1082碱基对应。

(2) AhAPG基因与克隆载体pUC18及植物表达载体pBI121的连接

回收PCR产物，并在T₄ DNA连接酶作用下与克隆载体pUC18 (购买于TaKaRa)进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α获得了抗氨苄青霉素的菌落。提取重组质粒，测序后获得2种不同的DNA片段，分别命名为AhAPG-1和AhAPG-2。用KpnI进行酶切，回收含AhAPG1和AhAPG2基因的酶切片段，分别正向克隆到植物表达载体pBI121的对应酶切位点中，获得该基因的植物表达载体pBI121-AhAPG1和pBI121-AhAPG2；反向克隆到植物表达载体pBI121的对应酶切位点中，获得该基因的反义表达载体：反义pBI121-AhAPG1和反义pBI121-AhAPG2。

3、将上述表达载体转化花生，包括以下步骤：

a、农杆菌重组菌株的制备、活化及菌液制备：分别将pBI121-AhAPG1和pBI121-AhAPG2重组质粒利用液氮冻融法转化农杆菌菌株EHA105感受态细胞，筛选出含有重组质粒的重组菌株。挑取重组菌株单菌落，接种到YEB（利福平50 mg/L，卡那霉素50 mg/L）液体培养基中，28℃、180 rpm培养至OD₆₀₀=0.5~0.8时，取2 mL菌液转移到50 mL YEB（利福平50 mg/L，卡那霉素 50 mg/L）培养基中，培养到OD₆₀₀=0.6~0.8。将菌液于5000 rpm离心15 min后，用相同体积的液体MSB₅悬浮备用。

b、花生子叶外植体的分离：选取饱满的花生种子，在70%酒精中浸泡1 min，0.1%升汞浸泡20 min，无菌水冲洗4-6次。去种皮和胚轴，将每片子叶纵向切成2半。

c、农杆菌介导的遗传转化：切好的外植体浸于已备好的农杆菌菌液中，28℃、90 rpm温和震荡侵染10 min，用无菌滤纸将残留菌液吸干，接入SIM诱导培养基上在暗中共培养3 d。转移到添加250 mg/L头孢霉素的SIM诱导培养基，将外植体切口端嵌入培养基，培养2 w左右，诱导丛生芽，培养条件：光强为1500-2000 lx、光照12 h、温度为26℃±1℃。

将形成丛生芽的外植体转移外到250 mg/L头孢霉素、100 mg/L卡那霉素的SEM培养基上筛选抗性芽，培养2 w，培养条件：光强为1500-2000 lx、光照12 h、温度为26℃±1℃。

培养2 w后，切下不定芽部分转移到250 mg/L头孢霉素、150 mg/L卡那霉素的SEM培养基上，进行抗性芽的筛选及诱导芽伸长，培养4w左右，期间继代培养2-3次（如图1所示）。

4、转基因植株的PCR检测

提取再生植株的基因组DNA，利用上述CaMV 35S启动子的引物对进行PCR扩增。PCR反应程序为：95℃、5 min；95℃、30 s，56℃、35s，72℃、40 s，35个循环；72℃、10 min。

将花生APG-1和APG-2基因在花生中过量表达，对花生转基因植株进行PCR检测的引物均为：

P5：5?-GCTCCTACAAATGCCATCA-3?（SEQ ID No:11）；

P6：5?- GATAGTGGGATTGTGCGTCA -3? （SEQ ID No:12）。

如图2所示（图2中为部分转基因植株样品），全部拟转基因植株的PCR阳性率均在20%以上。

5、荧光定量PCR，包括以下步骤：

a、用1.5% NaCl处理‘花育23号’的幼苗，在不同时间段取幼苗叶片，立即在液氮中冷冻处理后备用。分别取不同时间段胁迫处理的花生幼叶0.05 g，液氮速冻并研磨成粉末状，用RNA提取试剂盒提取RNA。抽提后的总RNA用DNase I处理，并进行纯化。

b、样品在ABI 7500 FAST型荧光定量PCR仪上进行反应。20 μL反应体系包括：10 μL 2× SybrGreen qPCR Master Mix，20 μmol/L正反向引物各0.25 μL，20 ng反转录产物。扩增程序为：先95℃预变性2 min；接着进入40个循环反应，每个循环中95℃变性10 s，60℃延伸33 s；循环结束后，缓慢升至95℃，制备熔解曲线。每个反应设2个复孔。

c、APG1基因定量PCR的正向引物序列为5'- CATGGCTTGATTATGGGTTG -3'（SEQ ID No:13）；反向引物序列为5'- GGAAACGATATAAGAACACAAAGGTA -3'（SEQ ID No:14）。APG2基因定量PCR的正向引物序列为5'- CATGGCTTGATTATGGGTTG -3'（SEQ ID No:15）；反向引物序列为5'- AGCGATATAAGAACACAAAGGGT -3'（SEQ ID No:16）。

以花生Actin基因为内标，扩增正向引物序列为5'- GTGGCCGTACAACTGGTATCGT -3'（SEQ ID No:17）；反向引物序列为5'- ATGGATGGCTGGAAGAGAACT -3'（SEQ ID No:18）。

实验结果如图3所示， APG-1和APG-2基因均受盐胁迫诱导表达，APG-1基因受盐胁迫诱导48 h时可达到对照的27.7倍；APG-2基因受盐胁迫诱导6 h时可达到对照的9倍。

6、T₂代转基因种子的耐盐性鉴定                           

以T₂代种子转基因花生种子和花育23号种子（对照）为材料，挑选饱满种子，加0.7%NaCl充分浸泡4 h，倒掉多余NaCl溶液至适量，于光照培养箱中进行培养，培养箱条件设置为25℃、暗培养24 h，处理期间每1 d更换一次NaCl溶液。5 d后统计发芽率，胚根长度≥种子长度为发芽标准。每个处理设两个重复。

将花生APG-1和APG-2基因在花生中超量表达，花生转基因种子在0.7% NaCl溶液中发芽率分别可达到36%和49%，而非转基因种子的发芽率只有15%；本发明将APG-1和APG-2基因在花生过量表达可显著提高种子（图4）和植株（图5）的耐盐性。

7、T₂代转基因植株生育酚含量的测定

    挑选培养1个月的PCR阳性植株和未转基因的野生型植株的叶片各100 mg，用液氮研磨后转入到含600 μL 甲醇﹕氯仿（2﹕1）抽提液的1.5 mL 离心管中，充分震荡混匀，然后加入200 μL 氯仿和200 μL 无菌水，充分混匀。12 000 r/min 离心15 min，取下层有机相转入到新的离心管中，氮气吹干，溶于400 μL 的无水乙醇中。进行高效液相色谱仪分析。

分析条件：流动相为正己烷﹕异丙醚（90﹕10，V/V）；硅胶柱为粒度5 μL，4.6 cm×25 cm；检测波长为激发波长：298 nm；发射波长：325 nm；柱温：40℃；流速：1.5 mL·min^-1；分析时间：20 min。标准品α、β、γ、δ-生育酚的浓度均为10 ng·μL-1，上样体积为10 μL。

如图6所示，转APG-1和APG-2基因花生植株形态发育正常，过量表达APG-1和APG-2基因后，转基因花生叶片中α生育酚含量分别可达到295.4和226.5 μg/g鲜重，分别为对照（169.6 μg/g鲜重）的1.74和1.34倍；而将花生APG-1和APG-2反义载体进行遗传转化后，转基因植株叶片中α生育酚含量可降低到35.5和23.2 μg/g鲜重，分别只有对照的20.9%和13.7%。本发明中的APG-1和APG-2可明显改变花生叶片中α生育酚含量。

8、转基因T₂代花生种子品种性状的测定

采用傅立叶变换近红外光谱仪对转基因T₂代花生种子品种性状进行测定（在青岛农业大学中心实验室测试），每个材料测定2次，用山东农科院花生所王传堂创建的多粒模型进行分析。

采用傅立叶变换近红外光谱仪对转基因T₂代花生种子品种性状进行测定（在青岛农业大学中心实验室测试）。结果表明过量表达APG1基因后，有7个材料的含油量范围在57.19-58.77%之间，显著高于对照花育23号（55.94%）；7个材料的棕榈酸含量范围在6.52-7.42%之间，显著高于对照（5.38%）；8个材料的的蛋白质含量范围在28.61-29.70%之间，显著高于对照（27.62%）（图7）。过量表达APG2基因后，有19个材料的棕榈酸含量范围在6.62-8.55%之间，显著高于对照；14个材料的蛋白质含量范围在28.87-29.51%之间，显著高于对照（图8）。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  青岛农业大学

 

<120>  花生维生素E合成相关基因APG1、APG2在提高植物α生育酚含量和耐盐性中

       的应用

 

<130> 

 

<160>  18   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  2429

<212>  DNA

<213>  花生

 

<400>  1

tcaggttcct tcttcaacaa tggcttcatc aatgttcagt ggaaccgaaa gcctcacact     60

tttcagtagc aaaaccccga acggtttgtg tttcaatgct tccaattttc actctaaaag    120

aataggtttc aattctagca ctactaattt caatttcagt aataaagcta gggttcgtca    180

taacagtaat aggattgtta gaaccatagt accaaaatgt agtttatcag cttctaggcc    240

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taaattttca actttgtttg ccactgctag tgaaaacatt attgaatgct tgctcatctg   2100

taatatgatc catcgatgga acatctttaa gggtaaaatg aatatggtaa ttgctgttga   2160

taaaatggta gtgcatttat atattttctt agcttaggat gataatagga agtactaata   2220

acacaagata ctaatgtgca ccttggtttt ctatattgtt gtgcagcttg gtccaaagga   2280

agaagatgtg gagaagcctg ttaatacctt tgtgttctta tatcgtttcc ttttgggtgc   2340

attggcagct acatggtttg tgttggttcc tatatacatg tggctcaagg atcaaattgt   2400

tcccaagggt cagccaatct aagagccgt                                     2429

 

<210>  2

<211>  351

<212>  PRT

<213>  花生

 

<400>  2

 

Met Ala Ser Ser Met Phe Ser Gly Thr Glu Ser Leu Thr Leu Phe Ser

1                    5                        10                        15     

  

Ser Lys Thr Pro Asn Gly Leu Cys Phe Asn Ala Ser Asn Phe His Ser

               20                         25                        30         

 

Lys Arg Ile Gly Phe Asn Ser Ser Thr Thr Asn Phe Asn Phe Ser Asn

          35                        40                       45             

 

Lys Ala Arg Val Arg His Asn Ser Asn Arg Ile Val Arg Thr Ile Val

     50                        55                      60                 

 

Pro Lys Cys Ser Leu Ser Ala Ser Arg Pro Thr Ser Gln Pro Arg Phe

65                        70                       75                       80 

 

Ile Gln His Lys Lys Glu Ala Phe Trp Phe Tyr Arg Phe Leu Ser Ile

                     85                       90                        95     

 

Val Tyr Asp His Val Ile Asn Pro Gly His Trp Thr Glu Asp Met Arg

               100                     105                      110        

 

Asp Glu Ala Leu Glu Pro Ala Asp Leu Ser Asp Arg Asn Met Ile Val

           115                     120                       125            

 

Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Phe Thr Thr Leu Gly Ile Val Lys

     130                     135                       140                

 

His Val Asp Ala Lys Asn Val Thr Ile Leu Asp Gln Ser Pro His Gln

145                     150                      155                     160

 

Leu Ala Lys Ala Lys Gln Lys Glu Pro Leu Lys Asp Cys Lys Ile Ile

                     165                      170                      175    

 

Glu Gly Asp Ala Glu Asp Leu Pro Phe Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Arg

               180                       185                         190        

  

Tyr Val Ser Ala Gly Ser Ile Glu Tyr Trp Pro Asp Pro Gln Arg Gly

        195                 200                 205            

 

Ile Arg Glu Ala Tyr Arg Val Leu Lys Leu Gly Gly Lys Ala Cys Val

    210                 215                 220                

 

Ile Gly Pro Val Tyr Pro Thr Phe Trp Leu Ser Arg Phe Phe Ala Asp

225                 230                 235                 240

  

Val Trp Met Leu Phe Pro Lys Glu Glu Glu Tyr Ile Glu Trp Phe Gln

                245                 250                 255    

 

Lys Ala Gly Phe Lys Asp Val Gln Leu Lys Arg Ile Gly Pro Lys Trp

            260                 265                 270        

 

Tyr Arg Gly Val Arg Arg His Gly Leu Ile Met Gly Cys Ser Val Thr

        275                 280                 285            

  

Gly Val Lys Pro Ala Ser Gly Asp Ser Pro Leu Gln Leu Gly Pro Lys

    290                 295                 300                

 

Glu Glu Asp Val Glu Lys Pro Val Asn Thr Phe Val Phe Leu Tyr Arg

305                 310                 315                 320

 

Phe Leu Leu Gly Ala Leu Ala Ala Thr Trp Phe Val Leu Val Pro Ile

                325                 330                 335    

 

Tyr Met Trp Leu Lys Asp Gln Ile Val Pro Lys Gly Gln Pro Ile

            340                 345                 350    

 

<210>  3

<211>  2429

<212>  DNA

<213>  花生

 

<400>  3

tcaggttcct tcttcaacaa tggcttcatc aatgttcagt ggaaccgaaa gcctcacact     60

 tttcagtagc aaaaccccga acggtttgtg cttcaatgct tccacttttc actctaaaag    120

 aataggtttc aattctagca ctactaattt caatttcagt aataaagcta gggttcgtca    180

taatagtaat aggattgtta gaaccatagt accaaaatgt agtttatcag cttctaggcc    240

aacatcacaa cctaggttca ttcagcacaa aaaagaagca ttttggttct ataggttcct    300

ttcaattgtg tatgaccatg tcataaaccc tggccattgg actgaggaca tgagagatga    360

ggcacttgag ccagctgacc taagtgacag gaacatgatt gttgttgatg ttggtggcgg    420

caccggtttc accacattgg ggattgttaa gcatgtggat gccaagaatg tcaccattct    480

tgaccagtcc ccgcaccagc tcgccaaggc caagcagaag gagcccttga aggattgcaa    540

gattatcgaa ggggatgccg aggatctccc ctttcgaact gattatgctg acagatatgt    600

gtctgctgga aggtactgca ctgcatgttg taagcttgta aagtgtttgg attagctcag    660

tttcccatca aaaccacttt ccacttatat ttacggcgag ggtgtttgtt tcattttctg    720

aaaaaatctt aagtataatt gaaaagatga aaaatgatcc ttctgataag ctattattgt    780

cagcttctgc caaaaaaaaa aaatcttcgc atctgggtta ttttataaaa tttatccaaa    840

tatttgaaaa ctgatatttt tttagttaac actgaaaagc ttctattgtg acatttcatc    900

tgcaattcat ataattgaat ataatgaact tctataaaga tctattatgt atgcccttct    960

tgatgataag tatggattag tatgctatta gttgcattgt tgttataatg ttatcaagtg   1020

atcaatttat tctcttgaaa tatttgaggt tactttatgt tatgatacaa agtagcttgt   1080

cttaaagagg caatgctgat gatgtgctgt tgtttcttga tcttagcatt gagtactggc   1140

cggatccaca gcgcggcatc agggaagcat acagggtatt gaaacttggg ggcaaagcat   1200

gtgtaattgg tcccgtctac ccaacattct ggttgtcacg attctttgct gatgtttgga   1260

tgcttttccc caaggaggaa gagtacattg agtggtttca aaaggctgga ttcaaggatg   1320

 tccaactaaa acggattggc ccaaagtggt atcgtggtgt tcggcgccat ggcttgatta   1380

tgggttgttc agttaccggt gttaagcctg catctggtga ttctcctttg caggtatttg   1440

tcatcttggc ttctcaatca atatctttgt cgatgttttc cgttgttttc tttggggatt   1500

ttgttgttac tttaaactga gttgtggttt gtatgagtat ctatcttgtt gatggcttca   1560

tgaatatccg tttgtgtaat taacatggtg ttctgattga tgtgatctgc tgttatcccc   1620

tccatttctg gttaacttaa tgaattatcc aagcatataa aaggagagac gaatgaggaa   1680

 aaaagtagaa ttgggatttg agagccactt ggttgctcga caatgacaaa aaccaagact   1740

 gatctcacta gatggagttg gctatttgaa tcaacaccat gtgttgatat accttctccg   1800

 aaggttcatt ccacctaaac aaattcaatg atcttttgta taaactcccc taattctctc   1860

 tctctctaac ctgaatgctc aaggaggttt attttctctt ctctcttctt tgtgatgtac   1920

tgctgttttc tgagcttaca gtatgttact gagcttccag ggtgactttg gtatttaccc   1980

ccatatcaaa cccaattgtt ttatgttctt tgaataaact agattttcca accaagcacg   2040

taaattttca actttgtttg ccactgctag tgaaaacatt attgaatgct tgctcatctg   2100

taatatgatc catcgatgga acatctttaa gggtaaaatg aatatggtaa ttgctgttga   2160

 taaaatggta gtgcatttat atattttctt agcttaggat gataatagga agtactaata   2220

acacaagata ctaatgtgca ccttggtttt ctatattgtt gtgcagcttg gtccaaagga   2280

agaagatgtg gagaagcctg ttaaaccctt tgtgttctta tatcgcttga ttttgggtgc   2340

attggcagct acatggtttg tgttggttcc tatttacatg tggctcaagg atcaaattgt   2400

 tcccaagggt cagccaatct aagagccgt                                     2429

 

 

<210>  4

<211>  351

<212>  PRT

<213>  花生

 

<400>  4

 

Met Ala Ser Ser Met Phe Ser Gly Thr Glu Ser Leu Thr Leu Phe Ser

1               5                   10                  15     

 

Ser Lys Thr Pro Asn Gly Leu Cys Phe Asn Ala Ser Thr Phe His Ser

            20                  25                  30          

 

Lys Arg Ile Gly Phe Asn Ser Ser Thr Thr Asn Phe Asn Phe Ser Asn

        35                  40                  45             

 

Lys Ala Arg Val Arg His Asn Ser Asn Arg Ile Val Arg Thr Ile Val

    50                  55                  60                  

 

Pro Lys Cys Ser Leu Ser Ala Ser Arg Pro Thr Ser Gln Pro Arg Phe

65                  70                  75                  80 

  

Ile Gln His Lys Lys Glu Ala Phe Trp Phe Tyr Arg Phe Leu Ser Ile

                85                  90                  95     

 

Val Tyr Asp His Val Ile Asn Pro Gly His Trp Thr Glu Asp Met Arg

            100                 105                 110        

 

Asp Glu Ala Leu Glu Pro Ala Asp Leu Ser Asp Arg Asn Met Ile Val

        115                 120                 125            

 

Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Phe Thr Thr Leu Gly Ile Val Lys

    130                 135                 140                

 

His Val Asp Ala Lys Asn Val Thr Ile Leu Asp Gln Ser Pro His Gln

145                 150                 155                 160

 

Leu Ala Lys Ala Lys Gln Lys Glu Pro Leu Lys Asp Cys Lys Ile Ile

                165                 170                 175    

 

Glu Gly Asp Ala Glu Asp Leu Pro Phe Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Arg

            180                 185                 190        

 

Tyr Val Ser Ala Gly Ser Ile Glu Tyr Trp Pro Asp Pro Gln Arg Gly

        195                 200                 205            

 

Ile Arg Glu Ala Tyr Arg Val Leu Lys Leu Gly Gly Lys Ala Cys Val

    210                 215                 220                

 

Ile Gly Pro Val Tyr Pro Thr Phe Trp Leu Ser Arg Phe Phe Ala Asp

225                 230                 235                 240

 

Val Trp Met Leu Phe Pro Lys Glu Glu Glu Tyr Ile Glu Trp Phe Gln

                245                 250                 255    

 

Lys Ala Gly Phe Lys Asp Val Gln Leu Lys Arg Ile Gly Pro Lys Trp

            260                 265                 270        

 

Tyr Arg Gly Val Arg Arg His Gly Leu Ile Met Gly Cys Ser Val Thr

        275                 280                 285            

 

Gly Val Lys Pro Ala Ser Gly Asp Ser Pro Leu Gln Leu Gly Pro Lys

    290                 295                 300                

 

Glu Glu Asp Val Glu Lys Pro Val Lys Pro Phe Val Phe Leu Tyr Arg

305                 310                 315                 320

  

Leu Ile Leu Gly Ala Leu Ala Ala Thr Trp Phe Val Leu Val Pro Ile

                325                 330                 335    

 

Tyr Met Trp Leu Lys Asp Gln Ile Val Pro Lys Gly Gln Pro Ile

            340                 345                 350    

  

<210>  5

<211>  1082

<212>  DNA

<213>  花生

 

<400>  5

tcaggttcct tcttcaacaa tggcttcatc aatgttcagt ggaaccgaaa gcctcacact     60

tttcagtagc aaaaccccga acggtttgtg tttcaatgct tccaattttc actctaaaag    120

aataggtttc aattctagca ctactaattt caatttcagt aataaagcta gggttcgtca    180

taacagtaat aggattgtta gaaccatagt accaaaatgt agtttatcag cttctaggcc    240

 aacatcacaa cctaggttca ttcagcacaa aaaagaagca ttttggttct ataggttcct    300

 ttcaattgtg tatgaccatg tcataaaccc tggccattgg actgaggaca tgagagatga    360

 ggcacttgag cctgctgacc taagtgacag gaacatgatt gttgttgatg tcggtggcgg    420

 caccggtttc accacattgg ggattgttaa gcatgtggat gccaagaatg tcaccattct    480

 tgaccagtcc ccgcaccagc tcgccaaggc caagcagaag gagcccttga aggattgcaa    540

 gattatcgaa ggggatgccg aggacctccc ctttcgaacc gattatgctg acagatatgt    600

gtctgctgga agcattgagt actggccgga tccacagcgc ggcatcaggg aagcatacag    660

ggtattgaaa cttgggggca aagcatgtgt aattggtccc gtctacccaa cattctggtt    720

 gtcacgattc tttgctgatg tttggatgct tttccccaag gaggaagagt acattgagtg    780

 gtttcaaaag gctggattca aggatgtcca actaaaacgg attggcccaa agtggtatcg    840

tggtgttcgg cgccatggct tgattatggg ttgttcagtt accggtgtta agcctgcatc    900

tggtgattct cctttgcagc ttggtccaaa ggaagaagat gtggagaagc ctgttaatac    960

ctttgtgttc ttatatcgtt tccttttggg tgcattggca gctacatggt ttgtgttggt   1020

tcctatatac atgtggctca aggatcaaat tgttcccaag ggtcagccaa tctaagagcc   1080

gt                                                                  1082

 

<210>  6

<211>  1082

<212>  DNA

<213>  花生

 

<400>  6

tcaggttcct tcttcaacaa tggcttcatc aatgttcagt ggaaccgaaa gcctcacact     60

tttcagtagc aaaaccccga acggtttgtg cttcaatgct tccacttttc actctaaaag    120

aataggtttc aattctagca ctactaattt caatttcagt aataaagcta gggttcgtca    180

taatagtaat aggattgtta gaaccatagt accaaaatgt agtttatcag cttctaggcc    240

aacatcacaa cctaggttca ttcagcacaa aaaagaagca ttttggttct ataggttcct    300

ttcaattgtg tatgaccatg tcataaaccc tggccattgg actgaggaca tgagagatga    360

ggcacttgag ccagctgacc taagtgacag gaacatgatt gttgttgatg ttggtggcgg    420

caccggtttc accacattgg ggattgttaa gcatgtggat gccaagaatg tcaccattct    480

tgaccagtcc ccgcaccagc tcgccaaggc caagcagaag gagcccttga aggattgcaa    540

gattatcgaa ggggatgccg aggatctccc ctttcgaact gattatgctg acagatatgt    600

gtctgctgga agcattgagt actggccgga tccacagcgc ggcatcaggg aagcatacag    660

ggtattgaaa cttgggggca aagcatgtgt aattggtccc gtctacccaa cattctggtt    720

gtcacgattc tttgctgatg tttggatgct tttccccaag gaggaagagt acattgagtg    780

gtttcaaaag gctggattca aggatgtcca actaaaacgg attggcccaa agtggtatcg    840

tggtgttcgg cgccatggct tgattatggg ttgttcagtt accggtgtta agcctgcatc    900

tggtgattct cctttgcagc ttggtccaaa ggaagaagat gtggagaagc ctgttaaacc    960

ctttgtgttc ttatatcgct tgattttggg tgcattggca gctacatggt ttgtgttggt   1020

tcctatttac atgtggctca aggatcaaat tgttcccaag ggtcagccaa tctaagagcc   1080

gt                                                                  1082

 

 

<210>  7

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

tcaggttcct tcttcaacaa tggct                                           25

 

 

<210>  8

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

acggctctta gattggctga ccct                                            24

 

 

<210>  9

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

ggtacctcag gttccttctt caacaatggc t                                    31

 

 

<210>  10

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  10

ggtaccacgg ctcttagatt ggctgaccct                                      30

 

 

<210>  11

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  11

gctcctacaa atgccatca                                                  19

 

 

<210>  12

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  12

gatagtggga ttgtgcgtca                                                 20

 

 

<210>  13

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  13

catggcttga ttatgggttg                                                 20

 

 

<210>  14

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  14

ggaaacgata taagaacaca aaggta                                          26

 

 

<210>  15

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  15

catggcttga ttatgggttg                                                 20

 

 

<210>  16

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  16

agcgatataa gaacacaaag ggt                                             23

 

 

<210>  17

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  17

gtggccgtac aactggtatc gt                                              22

 

 

<210>  18

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  18

atggatggct ggaagagaac t                                               21