一种调控光滑球拟酵母耐酸胁迫能力的转录因子Asg1p

摘要

本发明公开了一种调控光滑球拟酵母耐酸胁迫能力的转录因子Asg1p，属于生物工程领域。本发明通过改造光滑球拟酵母构建一株基因缺失突变菌株Cgasg1Δ和一株基因回补菌株Cgasg1Δ/CgASG1，然后对构建的菌株进行平板生长实验和细胞活性测定，并通过分析酸胁迫下胞内H

说明书

技术领域

本发明涉及一种调控光滑球拟酵母耐酸胁迫能力的转录因子Asg1p，属于生物工程领域。

背景技术

光滑球拟酵母(Candida glabrata)是工业生产丙酮酸的唯一微生物。除此之外，C. glabrata还可用于工业生产富马酸、苹果酸、α-酮戊二酸等有机酸。有机酸发酵过程中，随着 产物的积累，培养基的pH迅速降低，导致菌体的生长和产物的积累减缓甚至停止。近年来 国内外主要通过外源添加辅助底物、诱变育种、基因工程和适应性进化等策略提高菌体的酸 耐受性和有机酸产量。对C.glabrata进行耐酸机制的研究可从根本上解决这一问题，但此机 制尚不清楚。因此，进行光滑球拟酵母酸胁迫耐受机制的研究很有必要，这对提高有机酸产 量具有指导意义。

目前对光滑球拟酵母酸胁迫的研究尚未广泛开展，蛋白质组学分析发现相对于高pH来 说，光滑球拟酵母对低pH环境有更强的耐受性。对GPI锚定天冬氨酰蛋白酶的研究发现光 滑球拟酵母可通过CgYps1调节质子泵CgPma1的活性以适应酸胁迫环境。

本发明旨在鉴定一种调控光滑球拟酵母耐酸胁迫能力的转录因子Asg1p。

发明内容

本发明提供了一种调控光滑球拟酵母耐酸胁迫能力的转录因子Asg1p，编码所述转录因 子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

敲除光滑球拟酵母的编码所述转录因子Asg1p的基因CgASG1，获得缺失CgASG1基因 的突变菌株Cgasg1Δ，突变菌株的生长能力和对酸性环境的耐受能力都明显下降；尤其是在 pH 2.0的条件下，突变菌株的H⁺-ATPase活性降低，引起胞内酸化，进而造成胞内ROS含量 升高。基因CgASG1回补菌株Cgasg1Δ/CgASG1表现出与野生型菌株wt相同的H⁺-ATPase活 性、pH_in和ROS水平，在各培养基上均表现出与野生型菌株wt相同的生长表型。

应用所述转录因子Asg1p调控光滑球拟酵母的耐酸胁迫性能，可以是调节光滑球拟酵母 中基因CgASG1及转录因子Asg1p靶基因的表达水平，以改变其耐受酸胁迫的能力及有机酸 的产量。

本发明提供的一种参与光滑球拟酵母酸胁迫的转录因子Asg1p，其功能是在细胞生长及 酸胁迫耐受中发挥重要作用，敲除该转录因子，酵母的H⁺-ATPase活性降低，引起胞内酸化， 进而造成胞内ROS含量升高，使得酵母的生长及耐酸胁迫能力下降。本发明提供的该调控光 滑球拟酵母耐酸胁迫能力的转录因子Asg1p，能用于构建抗酸胁迫的有机酸生产菌株。

附图说明

图1基因缺失菌株的构建及验证，A敲除框的构建，B基因缺失菌株的验证；

M1、M2泳道分别代表2000bp和10000bp的DNAmarker；+/-泳道代表分别以菌株wt 基因组和水为模板进行PCR的对照；1、2泳道分别代表菌株wt和突变菌株Cgasg1Δ的阳性 转化子基因组；3、4泳道分别代表使用引物P7/P8进行的PCR验证。

图2基因回补菌株的构建及验证，A目的基因的扩增，B基因回补菌株的验证；

M2泳道代表10000bp的DNAmarker；+/-泳道代表分别以基因CgASG1和水为模板进行 PCR的对照；1泳道代表CgASG1基因片段；2泳道代表Cgasg1Δ/CgASG1阳性转化子的菌落 PCR验证。

图3光滑球拟酵母生长的测定，A非发酵性碳源上的平板生长实验，B不同pH下的平 板生长实验

图4胞内微环境测定结果，A H⁺-ATPase活性，B胞内pH，C胞内ROS含量

具体实施方式

以下是光滑球拟酵母(Candida glabrata)菌株构建及验证、生长性能分析及胞内微环境 测定的实施例。

平板生长实验：将待测菌株的单菌落接种于20mL的YNB(0.67％不含氨基酸的YNB， 2％葡萄糖，pH 5.2)液体培养基中，30℃摇床培养12h至对数生长期，测定菌体浓度并将 菌悬液调节至OD₆₀₀＝l.0，以此为初始浓度，进行5次10倍梯度稀释，依次将4μL菌液点种 在不同碳源的YNB(0.67％不含氨基酸的YNB，图3A中相应的碳源)和不同pH的YNB (0.67％不含氨基酸的YNB，2％葡萄糖，pH 3.0和pH 2.0)固体培养基上，30℃培养2天， 观察菌体的生长情况并拍照。

细胞活性测定：将对数期的待测菌株接种于pH 2.0的YNB液体培养基，初始OD₆₀₀＝0.1， 30℃摇床培养，每隔一定的时间取菌液200μL，稀释适当倍数(使每块平板上的单菌落数控 制在30-300个)，涂布YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)固体培养基，24h 后进行单菌落计数，活菌浓度根据下面的公式计算：

活菌浓度＝单菌落数×5×稀释倍数(个·mL^-1)

定义0h的细胞活性为100％，并以此为基础计算每隔2h在pH 2.0中各菌株的细胞活性。

光滑球拟酵母胞内微环境的测定：通过测定细胞膜H⁺-ATPase活性、胞内pH和胞内ROS 含量进行胞内微环境的评价。

(1)H⁺-ATPase活性的测定

将在pH 5.2或pH 2.0的培养基中培养2h的对数期细胞通过1mL溶液A(Tris 100mM， EDTA 5mM，DTT 2mM，pH 10.7)重悬，5mL溶液B(蔗糖0.33M，EDTA 5mM，DTT 2 mM，Tris-HCl 0.1M，pH 8.0)稀释，多次离心后用100μL溶液C(甘油20％，EDTA0.1mM， DTT 0.1mM，Tris-HCl 10mM，pH 7.5)重悬，得到总的膜碎片；取5μg膜蛋白在120μL溶 液D(ATP 5mM，MgSO₄10mM，KCl 50mM，MES 50mM，KNO₃50mM，NaN₃5mM， 钼酸铵0.2mM)中30℃培养30min，使用钼蓝比色法测定720nm处的吸光值，并通过对应 无机磷标准曲线计算H⁺-ATPase分解ATP产生的无机磷含量，定义H⁺-ATPase酶活单位为每 分钟每毫克酶蛋白消耗ATP的mM数。

(2)胞内pH

将pH 5.2或pH 2.0的培养基中培养2h的对数期细胞用50mmol·L^-1CP缓冲液洗两次， 用1mL CP缓冲液重悬至OD₆₀₀＝0.5，添加CFDA-SE至终浓度160μmol·L^-1，涡旋混匀后37℃ 培养1h，洗涤、重悬于0.25mL CP缓冲液，30℃培养30min，分别在490nm和430nm的 激发波长，525nm的发射波长处测荧光强度，根据标准曲线计算pH_in的值；标准曲线使用同 上方法，经不同pH的标准曲线用缓冲液(pH 4.0-8.0，0.5的梯度)，通过10μL 50mmol·L^-1CCCP使胞内外pH达到平衡进行测定。

(3)胞内ROS含量

将pH 5.2或pH 2.0的培养基中培养2h的对数期细胞经PBS缓冲液洗后重悬至 OD₆₀₀＝1.0，加100μmol·L^-1DCFH-DA(2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐)，28℃培养30min，PBS 洗涤并重悬，使用荧光分光光度计在488nm的激发波长和530nm的发射波长处测细胞液的 荧光强度，并同时将其稀释一定倍数后涂布平板，通过活菌数计算单位细胞的荧光强度值。

实施例1

以C.glabrataATCC 2001(wt)基因组为模板，分别以P1/P2、P3/P4、P5/P6为引物，扩 增出待敲除转录因子Asg1p的编码基因CgASG1的左臂(L)、尿嘧啶基因(M)和右臂(R)， 经融合PCR构建敲除框CgASG1-LMR(图1A)。出发菌株C.glabrataATCC 55因缺失尿嘧啶 基因不能在MM筛选培养基(葡萄糖20g·L^-1，尿素7g·L^-1，乙酸钠3g·L^-1，磷酸二氢钠5g·L^-1， 七水硫酸镁0.8g·L^-1，琼脂粉20g·L^-1)上生长，而突变菌株经同源重组后，因标记基因尿嘧 啶表达而在MM培养基上生长。对转化子进行PCR验证，如图1B所示，提取转化子的基因 组，发现以P7/P8为引物时，野生型菌株wt无条带产生，而转化子获得1.8kb左右的基因 CgURA3及基因CgASG1的左臂。将验证正确的突变菌株命名为Cgasg1Δ。

P1：ACATTATTGGTAACTGTTTTCG

P2：AATATGAGGCACTGGACATCGTTTTATTACAGACAGTCTGACAGT

P3：AGACTGTCTGTAATAAAACGATGTCCAGTGCCTCATAT

P4：CCATGTATTCCTTCACCAGGTCAGTTTCCTATTCTTTT

P5：TGAAAAGAATAGGAAACTGACCTGGTGAAGGAATACATG

P6：AGAGTATGGTTTAGGTAGGATG

P7：GTGGAGGTGGAAGTATCT

P8：TCAGTTTCCTATTCTTTT

实施例2

以C.glabrataATCC 2001(wt)基因组为模板，将扩增出的带有酶切位点BamH I和EcoR I的转录因子Asg1p的编码基因片段CgASG1(图2A，2.5kb)经双酶切消化后连接到质粒 pY13TEF上，构建质粒pY13-CgASG1。突变菌株Cgasg1Δ因缺失组氨酸基因不能在MM筛 选培养基上生长，而质粒pY13TEF上的组氨酸基因可使回补菌株获得这一生长能力。菌落 PCR筛选验证发现，作为对照的突变菌株Cgasg1Δ无条带产生，而转化子扩增得到特异性片 段(图2B，2.5kb)，将此菌株命名为Cgasg1Δ/CgASG1。

P9：CGGGATCCATGAACTTGACTGTGCCAC

P10：CGGAATTCTTAGGCGTTATTAGTAGGTAAAT

实施例3

平板生长实验分析不同碳源对菌株wt、Cgasg1Δ和Cgasg1Δ/CgASG1生长的影响，如图 3A，突变菌株Cgasg1Δ在以乙酸钠、柠檬酸钠、甘油或乙醇为唯一碳源的YNB培养基上与 野生型菌株wt表现出相同的生长情况，而在乙酸培养基上生长微弱。比较了以乙酸和乙酸钠 为唯一碳源时的生长情况，发现在乙酸为碳源时生长微弱的原因在于乙酸引起的pH下降。 进一步改变YNB培养基的pH，菌株的生长情况如图3B，发现突变菌株Cgasg1Δ在pH 3.0 时生长受到抑制，在pH 2.0时则无法生长；而回补菌株Cgasg1Δ/CgASG1在任何培养基上均 表现出与野生型菌株wt相同的生长表型。pH 2.0时对菌株wt和Cgasg1Δ的细胞活性测定如 表1，发现12h时野生型菌株wt的细胞活性比0h增加20倍，而突变菌株Cgasg1Δ则降低了 90％。以上结果表明，基因CgASG1的缺失降低了C.glabrata的生长能力和对酸性环境的耐 受能力。

表1菌株wt和Cgasg1Δ在pH 2.0时的细胞活性

实施例4

pH 2.0时野生型菌株wt和突变菌株Cgasg1Δ的H⁺-ATPase活性、胞内pH(pH_in)和胞内 活性氧(ROS)如图4所示。野生型菌株wt通过提高8％的H⁺-ATPase活性，增加胞内质子 转运出胞外的能力以维持胞内pH稳态，而突变菌株Cgasg1Δ的H⁺-ATPase活性则降低了10％ (图4A)；野生型菌株wt的pH_in维持在6.0-6.2，而突变菌株Cgasg1Δ的pH_in则从6.0降低至 5.27(图4B)；野生型菌株wt的胞内ROS含量不变，而突变菌株Cgasg1Δ的ROS含量增加了 2倍(图4C)；回补菌株Cgasg1Δ/CgASG1表现出与野生型菌株wt相同的H⁺-ATPase活性、 pH_in和ROS水平。上述结果表明，突变菌株Cgasg1Δ在pH 2.0条件下细胞生长减弱的原因在 于H⁺-ATPase活性降低，引起胞内酸化，进而造成胞内ROS含量升高。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。