二斑叶螨依赖解旋酶DNA等温扩增快速检测引物、试剂盒、检测方法

摘要

本发明公开了一种二斑叶螨依赖解旋酶DNA等温扩增快速检测引物、试剂盒、检测方法。18SUP1上游引物序列为SEQ ID NO 1；18SNP1下游引物序列为SEQ ID NO 2；18SUP2上游引物序列为SEQ ID NO 3；18SNP2下游引物序列为SEQ ID NO 4。试剂盒内有反应液I、反应液I’和反应液Ⅱ。检测二斑叶螨的方法包括叶螨DNA的提取、模板预处理、HDA等温扩增、核酸检测。本发明优点是简单、快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及一种二斑叶螨依赖解旋酶DNA等温扩增（HDA）快速检测引物、试剂盒及其检测方法，属生物检测领域。

背景技术

叶螨属于蜱螨亚纲叶螨科，是重要的农业害螨，危害多种农作物和观赏植物由于叶螨具有体型微小 形态学特征有限和物种之间高度相似的特征等，因此对叶螨科物种的鉴定非常困难，为叶螨深入研究带来很大的障碍。二斑叶螨( Tetranychus urticae) 被认为是一个十分复杂的物种，有多达44个名字。二斑叶螨是一种重要的世界性害螨，寄主植物达240科1100多种，很多国家将此螨列为非检疫性的限制性有害生物和检疫性有害生物，在进出口农产品中屡次被检出，给进出口商尤其是出口商造成很大经济损失，因此对二斑叶螨的准确、快速检测对保障出口的顺利进行，保护出口商农的经济利益具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种二斑叶螨依赖解旋酶DNA等温扩增（HDA）快速检测引物、试剂盒及其检测方法，以克服现有形态鉴定等常规技术的不足，从而为生物安全提供科学的依据和指导作用。

本发明提供的二斑叶螨的HDA等温扩增快速检测试剂盒，包括：

（1）模板预处理反应液I： 0.1umol/L特异性上下游引物18SUP1，18SNP1，0.1mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L DTT，0.25 mmol/L dNTP，dH₂O， pH 7.5。

18SUP1    5’- ATTAAGAGGGACAGACGG -3 。

18SNP1    5’- AATGCTTTCGCTGTAGTT -3 。

（2）模板预处理反应液I’： 0.1umol/L特异性上下游引物18SUP2，18SNP2，0.1mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L DTT，0.25 mmol/L dNTP，dH₂O， pH 7.5。

18SUP2   5’- GGGTCCACTGATTAAAGG -3’。

18SNP2   5’- ATTCTTGGCAAATGCTTTCGCTGTA-3’。

（3）阳性对照模板：0.1umol/L DNA模板

（4）HDA等温扩增液Ⅱ：0.15mg/ml BSA，20mmol/L乙酸镁，5.5mmol/LATP，0.02U/μL Exo-Klenow， 2ng/μL UvrD解旋酶，10ng/μL MutL，0.1 ug/μL T4gp32， dH₂O， pH 7.5。

本发明提供的利用上述试剂盒检测二斑叶螨的方法，包括下列步骤：

（1）待检螨虫或二斑叶螨DNA的提取：

提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD₂₆₀/ OD₂₈₀在1.6-2.0范围内，浓度在10-100 ng/μL范围内；

（2）模板预处理：

将装有23μL模板预处理反应液Ｉ和I’的反应管分别加入2 μL待检模板DNA于95 ℃水浴5 min后迅速放入37℃的水浴中冷却5min；

（3）HDA等温扩增：

将上述经过处理的模板预处理混合溶液25μL分别加入25μL扩增液Ⅱ，64℃加热100min，80℃10min，降温至4℃；

（4）核酸凝胶电泳检测：

核酸扩增完成后，扩增结果在琼脂糖凝胶电泳检测，如果Ｉ和I’反应液均出现100bp单条条带，可以判断为阳性，否则为阴性。

本发明的试剂盒根据二斑叶螨的18S rDNA基因序列设计引物，引物的设计主要经过与近缘种的对比，选取变异较大的两个区域设计扩增二斑叶螨的HDA等温扩增上下游引物两对，用于增加检测的准确度与特异性。同时对设计的引物进行特异性筛选。本发明采用改进的HDA扩增技术，该技术特异性强，具有与PCR检测方法相似灵敏度，但其阔增速度比PCR快，在30min内就可以检测到扩增，并且不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，检测方法简单、快速，特异性强、灵敏度高，特别适用于基层植保机构及植物产品公司与相关检测部门现场诊断。

附图说明

图1 二斑叶螨HDA扩增图谱，其中：M:DL2000marker，1-2:二斑叶螨样品样品在Ｉ反应液扩增结果；3-5:二斑叶螨样品样品在I’反应液扩增结果； 6-7:阴性对照；8:空白对照。

图 2 二斑叶螨HDA等温扩增特异性检测，其中： 1: DL2000marker；2:二斑叶螨样品在Ｉ反应液扩增结果；3: 山楂叶螨样品在I反应液扩增结果；4::朱砂叶螨样品在Ｉ反应液扩增结果；5: 迈叶螨样品在I反应液扩增结果；6: 土耳其斯坦叶螨样品在I反应液扩增结果；7: 神泽氏叶螨样品在I反应液扩增结果； 8:伪二点红螨样品在I反应液扩增结果；9:阴性对照10:空白对照。

1’:阴性对照；2’ DL2000marker；3’-4’:二斑叶螨样品在Ｉ’反应液扩增结果；5’: 山楂叶螨样品在Ｉ’反应液扩增结果；6’: 朱砂叶螨样品在I’反应液扩增结果；5’: 迈叶螨样品在I’反应液扩增结果；6’: 土耳其斯坦叶螨样品在I’反应液扩增结果；7’: 神泽氏叶螨在I’反应液扩增结果； 8’:伪二点红螨在I’反应液扩增结果；9’:阴性对照。

具体实施方式

本发明的主要原理为在恒温条件下利用生物复制系统的关键组分实现DNA的体外扩增。

本发明提供的二斑叶螨HDA等温扩增快速检测试剂盒，其中包括：

（1）模板预处理反应液I：，0.1umol/L特异性上下游引物18SUP1，18SNP1，0.1mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L DTT，0.25 mmol/L dNTP，dH₂O，pH 7.5。

二斑叶螨特异性引物1：

18SUP1    5’- ATTAAGAGGGACAGACGG -3

18SNP1    5’- AATGCTTTCGCTGTAGTT -3

（2）模板预处理反应液I’： 0.1umol/L特异性上下游引物18SUP2，18SNP2，0.1mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L DTT，0.25 mmol/L dNTP，dH₂O， pH 7.5。

二斑叶螨特异性引物2：

18SUP2   5’- GGGTCCACTGATTAAAGG -3’

18SNP2   5’- ATTCTTGGCAAATGCTTTCGCTGTA -3’

（3）阳性对照模板：0.1umol/L DNA模板

（4）HDA等温扩增液Ⅱ：0.15mg/ml BSA，20mmol/L乙酸镁，5.5mmol/LATP，0.02U/μL Exo-Klenow， 2ng/μL UvrD解旋酶，10ng/μL MutL，0.1 ug/μL T4gp32， dH₂O， pH 7.5。

本发明提供的利用上述试剂盒检测二斑叶螨的方法，包括下列步骤：

（1）待检螨虫或二斑叶螨DNA的提取：

提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD₂₆₀/ OD₂₈₀在1.6-2.0范围内，浓度在10-100 ng/μL范围内；

（2）模板预处理：

将装有23μL模板预处理反应液Ｉ和I’的反应管分别加入2 μL 待检模板，阴性对照加入2 μL dH₂O，于95 ℃水浴5 min后迅速放入37℃的水浴中冷却5min；

（3）HDA等温扩增：

将上述经过处理的模板预处理混合溶液25μL分别加入25μL溶液Ⅱ中，64℃加热100min，80℃10min，降温至4℃；

（4）核酸凝胶电泳检测：

核酸扩增完成后，核酸扩增完成后，在反应管中加入6×Loading buffer(组分：30mM EDTA ；36%(v/v) Glycerol；0.05%(w/v) Xylene Cyanol FF；0.05%(w/v) Bromophenol Blue)，取产物10 μL加入2%的琼脂糖凝胶板的样品孔中，100v电压，电泳 30-40分钟，电泳成像系统拍照。如果Ｉ和I’反应液均出现100bp单条条带，可以判断为阳性，否则为阴性。

实施例1

利用二斑叶螨HDA等温扩增检测试剂盒，检测二斑叶螨：

（1）待检螨虫和二斑叶螨DNA的提取（2）模板预处理（3）HDA等温扩增（4）核酸凝胶电泳检测。结果如图1所示。二斑叶螨样品扩增条带单一、清晰。

实施例2 特异性实验

利用二斑叶螨HDA等温扩增检测试剂盒，检测二斑叶螨：

（1）待检螨虫和二斑叶螨DNA的提取：分别提取山楂叶螨Tetranychus viennensis，二斑叶螨Tetranychus urticae，朱砂叶螨Tetranychus innabarinus，迈叶螨Tetranychus mcdanieli，土耳其斯坦叶螨Tetranychus turkestani，伪二点红螨Tetranychus truncates，神泽氏叶螨 Tetranychus kanzawai样品DNA，提取的DNA OD₂₆₀/ OD₂₈₀在1.6-2.0范围内，浓度在10-100 ng/μL范围内；

（2）模板预处理：将装有23μL模板预处理反应液Ｉ和Ｉ’的反应管加入2 μL 待检模板（分别为二斑叶螨、山楂叶螨、朱砂叶螨、迈叶螨、土耳其斯坦叶螨、伪二点红螨、神泽氏叶螨，阴性对照加dH₂O）于95 ℃水浴5 min后迅速放入37℃的水浴中冷却5min；

（3）HDA等温扩增：将上述经过处理的模板预处理混合溶液25μL分别加入25μL溶液Ⅱ中，64℃加热100min，80℃10min，降温至4℃；

（4）核酸凝胶电泳检测。结果如图2所示。二斑叶螨样品在反应液Ｉ和Ｉ’扩增条带单一、清晰，其他六种叶螨反应液Ｉ和Ｉ’都没有扩增，说明本试剂盒的特异性较好。

以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

核苷酸序列表

 

<110>  潍坊科技学院

 <120>  二斑叶螨依赖解旋酶DNA等温扩增快速检测引物、试剂盒、检测方法

<160>  4    

<170>  PatentIn version 3.5

 

 

<210>  1

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<221>  primer_bind

<222>  (1)..(18)

<223>  用于扩增二斑叶螨的18S rDNA 基因的上游引物

<400>  1

ATTAAGAGGGACAGACGG                                             18

                                          

 

 

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<221>  primer_bind

<222>  (1)..(18)

<223>  用于扩增二斑叶螨的18S rDNA基因的下游引物

<400>  2

AATGCTTTCGCTGTAGTT                                           18

 

 

<210>  3

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<221>  primer_bind

<222>  (1)..(18)

<223>  用于扩增二斑叶螨的18S rDNA基因的上游引物

<400>  3

GGGTCCACTGATTAAAGG                                               18

 

 

 

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213> 人工序列

<221>  primer_bind

<222>  (1)..(18)

<223>  用于扩增二斑叶螨的18S rDNA基因的下游引物

<400>  4

ATTCTTGGCAAATGCTTTCGCTGTA                                         18