具有神经多肽诱导陈骨活性的骨修复材料的制造方法

摘要

本发明涉及具有神经多肽诱导成骨活性的骨修复材料的制造方法，包括：制备自固化磷酸钙粉剂；制备I型胶原溶液；制备具有纳米级立体网状结构的I型胶原明胶；制备人工合成神经多肽P物质；制备枸橼酸盐缓冲液；枸橼酸盐缓冲液溶解P物质制备生物活性固化液；磷酸钙粉剂与生物活性固化液混合调拌，加入条状明胶，制成骨修复材料。该方法通过仿生骨松质结构构建自固化骨修复材料，明胶构建材料内部通道，利于组织液渗透和新生血管长入，固化液加入P物质，可使材料具备骨再生诱导活性，自主诱导体内干细胞动员，制备的骨修复材料可随意塑形，适于各种复杂形态骨缺损，可促进骨修复材料在体内向正常骨组织转化，提高修复效率和成功率。

说明书

技术领域

本发明属于人工骨修复材料技术领域，涉及一种可塑性自固化骨修复材料的 制造方法，尤其涉及一种具有神经多肽诱导成骨活性和复合胶原网络立体通道的 骨修复材料的制造方法。

背景技术

临床常见因外伤、感染、肿瘤切除或发育异常等导致的骨缺损，目前临床修 复方法在重建理想形态、恢复完整功能和避免额外创伤等方面常难以获得满意效 果，再生医学技术是解决这些问题的希望所在。为实现个体化，功能化骨组织工 程重建，还需要进一步探索构建具有诱导动员机体组织再生能力，同时保证生物 安全、成分结构可控、力学性质相当的生物活性材料。

骨骼形态和功能的特殊性对组织工程核心环节的生物材料有更高的要求，要 求：材料具有生物活性的启动信号，诱导动员机体组织系统修复机制的同时，保 证材料活性的安全可控；材料成分结构的构建方式，可以保证早期获得支架内部 循环支持的同时，并保证活性物质的稳定作用；材料具有可控的力学性质，既能 根据缺损形态随意塑形，又可早期负载，并保证材料成分的引导转化。

神经多肽P物质分子结构为十一肽：Arg Pro Lys Pro GlnGlnPhePheGlyLeu  Met(RPKPQQFFGLM)，广泛存在于机体各种类型的组织，在人类、兔、鼠等具有 相同的氨基酸组成序列，是高度保守的神经肽，体外人工合成方便易得，并且没 有不良药理作用或遗传毒性。近期研究表明，P物质除了作为神经多肽参与痛觉 传导，还广泛分布于骨髓基质细胞、血管内皮细胞、中性粒细胞、上皮细胞等， 可以诱导间充质细胞动员，类似创伤诱导的细胞动员，刺激干细胞更新、增殖以及 多向分化，被认为是一个系统反应信使，是动员干细胞和促进创伤修复的重要分 子，在骨再生重建过程中具有诱导血管新生、促进骨愈合和骨转换(turnover， 骨吸收与骨形成)活动等重要作用。由于P物质为小分子多肽，体内环境下极易 水解，生物活性难以长期稳定保持，临床应用时，需要合适的载体给予保护和缓 释。

自固化磷酸钙(Calcium phosphate cement，CPC)在构建复合生物材料方面， 具有独特的优势。CPC也被称为磷酸钙骨水泥，是由几种磷酸钙盐混合而成的粉 状物，包括磷酸四钙(TTCP)、无水磷酸氢钙(DCPA)等，与水或添加其他成分的水 溶液调和后能够自行固化，固化反应温和，可以非常方便的与各种有机成分混合 固化。固化过程中可随意塑形，固化后形成羟基磷灰石结晶，能够承担一定负载， 具有引导成骨活性和良好的生物相容性，已经成为骨再生研究和临床应用中的重 要材料，并且是生物活性分子较为理想的无机载体。但是单纯CPC材料与天然骨 基质的成分、结构和功能仍有较大差距，主要的问题包括：固化孔隙率较低、不 具有动员诱导细胞分化能力、体内降解转化速度慢等。

胶原是糖蛋白，是细胞外基质的主要成分，起支持、保护、连接等多种作用。 其中I型胶原主要分布于骨组织中，是骨骼的基本有机成分。人工酸/碱等处理 动物胶原，使之变性水解，提取的产物为胶原明胶，与胶原一样由18种氨基酸组 成，但可去除动物源性胶原的免疫原性、生物毒性等问题。经冻干处理，水解分 散的胶原肽链靠分子内氢键等重聚类三螺旋结构，形成具有纳米级三维立体网状 结构的明胶材料，在体内具有可吸收性，并有良好的血小板凝聚性能，与各种组 织细胞、生长因子有良好的亲和性。

以上所述神经多肽、磷酸钙材料、明胶材料分属于不同研究领域，虽然已形 成大量研究成果或临床产品，但均存在各自局限性，尚未有能够随意塑形、具有 早期固化强度、具备内部组织液渗透/血管长入通道、能够安全快速诱导自身骨 再生重建等综合性能的人工骨修复材料出现。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有神经多肽诱导成骨活性的自固化磷酸钙-明 胶复合骨修复材料的制造方法，通过该方法制备的人工骨修复材料具有随意塑形 和自行固化能力，固化后具有内部组织液渗透/血管长入通道，仿生天然松质骨 结构，混合加载神经多肽，能够在材料内外部稳定缓释多肽生物活性，具备自主 诱导机体干细胞动员、促进骨再生改建的能力，可用于各种复杂形态骨缺损的修 复，模拟天然骨愈合过程，解决复杂骨缺损修复重建的问题。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种具有神经多肽骨诱导活 性的骨修复材料的制造方法，其包括以下步骤：(1)制备自固化磷酸钙粉剂，具 体方法为：按照1∶2的摩尔比混合CaCO₃与CaHPO₄，然后再将混合后的物质在 1100摄氏度下烧结5小时，制得磷酸四钙材料，通过研钵破碎所得磷酸四钙材 料，然后再用355μm孔径筛进行筛分，筛分之后再用球磨机研磨10分钟制成粉 末，并将所述粉末按照1∶3的摩尔比与CaHPO₄混合搅拌30秒，制成自固化磷 酸钙粉剂；(2)制备I型胶原溶液，具体方法为：将大鼠鼠尾腱按照质量体积浓 度3％W/V加入5mol/L的乙酸溶液中，并在4℃温度下磁力搅拌溶解，然后将溶 液用半透膜双蒸水透析48小时去除乙酸成分，在低温高速离心机中在-20℃、 4000转/分的条件下离心15分钟，吸取上清，制成I型胶原溶液；(3)制备具有 纳米级立体网状结构的I型胶原条状明胶，具体方法为；将I型胶原溶液置于平 底物料盘中，使液面高度为5mm，转移至真空冷冻干燥机中，在-60℃下冻干 25小时，制成具有纳米网状结构的冻干胶原明胶，再剪切制成1mm×1mm×5mm 的条状明胶；(4)制备人工合成神经多肽多肽P物质，具体方法为：使用自动多 肽合成仪按照以下氨基酸序列 Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂人工合成神经多肽多肽P物 质；(5)制备枸橼酸盐缓冲液，具体方法为：称取21.01g的分子式为C₆H₈O₇·H₂O 的枸橼酸溶于1000ml蒸馏水中，制备0.1mol/L的枸橼酸溶液；称取29.41g的分 子式为C₆H₅Na₃O₇·2H₂O的枸橼酸钠溶于1000ml蒸馏水中，制备0.1mol/L的枸橼 酸钠溶液；取9ml枸橼酸溶液和41ml枸橼酸钠溶液加入450ml蒸馏水中，调 溶液pH值为7.0，制成枸橼酸盐缓冲液；(6)用枸橼酸盐缓冲液溶解神经多肽 多肽P物质制备生物活性固化液，具体方法为：超滤法消毒枸橼酸盐缓冲液，按 照浓度1mg/ml溶解神经多肽多肽P物质，制成生物活性固化液；(7)自固化磷 酸钙粉剂与生物活性固化液按照质量体积比例为0.18g∶0.08ml混合调拌，制成自 固化磷酸钙糊剂，并在自固化磷酸钙糊剂中按照体积比1∶1加入I型胶原条状明 胶，调拌使I型胶原条状明胶分散在糊剂中，即制得具有神经多肽诱导活性的骨 修复材料。

本发明的优越性在于：采用自固化磷酸钙材料作为基本无机成分，具有良好 的材料兼容性、组织相容性和生物安全性，易于塑形(包括整体材料外形、支架 内部结构)，具有骨引导能力，可以为复合材料提供类似骨松质的整体强度；P 物质为人工合成十一氨基酸的小分子多肽，成分确定，活性确实，安全可靠，方 便易得；以自固化磷酸钙为载体，混合加载P物质，可保护和缓释其生物活性； I型胶原是骨骼的基本有机成分，人工酸解变性和冻干提取明胶材料，安全无毒， 具有纳米级三维立体网状结构，体内有良好的血小板凝聚性能，与各种组织细胞、 生长因子有良好的亲和性，可以早期降解，在磷酸钙材料内部形成通道网络，利 于组织液渗透和血管长入，以及生物活性P物质在材料内部的释放。

附图说明

图1是采用本发明的方法制造的具有神经多肽骨诱导活性的骨修复材料的 放大图。

其中，1、自固化磷酸钙；2、神经多肽P物质；3、I型胶原条状明胶。

具体实施方式

下面结合附图详细描述本发明的具体实施方式，具体实施方式的内容不作为 对本发明的保护范围的限制。

本发明所述的具有神经多肽诱导成骨活性的自固化磷酸钙-明胶复合骨修 复材料的制造方法，利用材料学与组织工程学技术相结合的生物活性构建技术， 制备自固化磷酸钙、人工合成神经多肽P物质、明胶复合骨修复材料，从而使得 制备的材料能够随意塑形、具有早期固化强度、具备内部组织液渗透/血管长入 通道、能够安全快速诱导和引导自身骨再生重建等综合性能。

本发明的构思是利用小分子多肽构建生物活性，利用磷酸钙材料构建能自行 固化并具有一定强度基本支架，利用条状明胶构建复合材料内部通道。小分子活 性肽在合成保存、功能定位和安全控制等方面具有显著优势，是构建组织工程生 物活性的更好选择。研究表明，十一肽P物质(Substance P，SP)广泛分布于骨 髓基质细胞、血管内皮细胞、中性粒细胞、上皮细胞等，具有高度保守性，是动 员干细胞活化和分化的神经内分泌信号，具有诱导血管新生、促进骨再生和骨转 换等多种功能作用，是一种方便易得、作用多样、安全可靠的小分子活性肽。而 自固化磷酸钙在构建复合生物材料方面，具有如下独特的优势：磷酸钙本身具有 骨组织引导活性，能够从可随意塑形的糊剂状态自固化为具有良好强度的羟磷灰 石结晶状态，能够通过离子置换等方法控制固化强度，固化反应温和，能够通过 物理吸附、共价交联等多种方式加载生物活性成分，实现骨引导+骨诱导多重生 物活性。I型胶原明胶具有纳米级立体网状结构，在体内具有可吸收性，并有良 好的血小板凝聚性能，与各种组织细胞、生长因子有良好的亲和性，可以作为组 织液渗透、新生血管长入通道。

在本发明中，首先是制备自固化磷酸钙粉剂。具体方法为：按照1∶2的摩尔 比混合CaCO₃与CaHPO₄(即DCPA)，然后再将混合后的物质在1100摄氏度下 烧结5小时，制得磷酸四钙材料(即TTCP，其分子式为Ca₄(PO₄)O)。通过研钵 破碎所得磷酸四钙材料，然后再用355μm孔径筛进行筛分，筛分之后再用球磨 机研磨10分钟制成粉末，并将所述粉末按照1∶3的摩尔比与CaHPO₄(即DCPA) 混合搅拌30秒，制成自固化磷酸钙粉剂。

第二步，制备I型胶原溶液。具体方法为：将大鼠鼠尾腱按照质量体积浓度 3％W/V加入5mol/L的乙酸溶液中，并在4℃温度下磁力搅拌溶解制成溶液。然 后将溶液用半透膜双蒸水透析48小时去除乙酸成分，在低温高速离心机中在- 20℃、4000转/分的条件下离心15分钟，吸取上清，制成I型胶原溶液。

第三步、制备具有纳米级立体网状结构的I型胶原条状明胶。具体方法为； 将I型胶原溶液置于平底物料盘中，使液面高度为5mm，转移至真空冷冻干燥 机中，在-60℃下冻干25小时，制成具有纳米网状结构的冻干胶原明胶，再剪 切制成1mm×1mm×5mm的条状明胶。

第四步、制备人工合成神经多肽多肽P物质。具体方法为：使用自动多肽合 成仪按照以下氨基酸序列Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂人 工合成神经多肽多肽P物质。

第五步、制备枸橼酸盐缓冲液。具体方法为：称取21.01g的分子式为 C₆H₈O₇·H₂O的枸橼酸溶于1000ml蒸馏水中，制备0.1mol/L的枸橼酸溶液；称 取29.41g的分子式为C₆H₅Na₃O₇·2H₂O的枸橼酸钠溶于1000ml蒸馏水中，制备 0.1mol/L的枸橼酸钠溶液。取9ml枸橼酸溶液和41ml枸橼酸钠溶液加入450ml 蒸馏水中，调溶液pH值为7.0，制成枸橼酸盐缓冲液。

第六步、用枸橼酸盐缓冲液溶解神经多肽多肽P物质制备生物活性固化液。 具体方法为：超滤法消毒枸橼酸盐缓冲液，按照浓度1mg/ml溶解神经多肽多肽 P物质(即每ml枸橼酸盐缓冲液溶解1mg神经多肽多肽P物质)，制成生物活 性固化液。

第七步、自固化磷酸钙粉剂与生物活性固化液按照质量体积比例为 0.18g∶0.08ml混合调拌，制成自固化磷酸钙糊剂，并在自固化磷酸钙糊剂中按照 体积比1∶1加入I型胶原条状明胶，调拌使I型胶原条状明胶分散在糊剂中，即 制得具有神经多肽诱导活性的骨修复材料。

如图1所示，所制得的骨修复材料包含有自固化磷酸钙1、神经多肽P物质 2和I型胶原条状明胶3。所述骨修复材料即可用于填充骨缺损区，可随意塑形 使与自然骨形态适合，自行固化后形成具有内部胶原明胶立体网络通道的骨再生 支架，能够缓释P物质，诱导和引导骨再生愈合。

在本发明中，使用基于磷酸钙的自固化复合材料，具有良好的材料兼容性和 组织相容性，用于骨再生修复具有以下优点：易于塑形(包括整体材料外形、支 架内部结构)，可调材料强度，可控降解速率，多种功能加载(包括生物因子/ 药物加载和缓释载体等)，兼具骨引导和骨诱导活性。对于解决复杂外形骨缺损 修复问题，具有独特优势。

本发明中的SP除了作为神经多肽参与痛觉传导，还广泛分布于骨髓基质细 胞、血管内皮细胞、中性粒细胞、上皮细胞等，发挥多种作用，被认为是一个创 伤的系统反应信使，是动员干细胞和促进创伤修复的重要分子。SP还具有诱导 血管新生的功能，其机制可能包括直接诱导血管内皮细胞分化和增殖，以及通过 TNF-a信号等间接募集活化血管形成相关的其他细胞。SP在骨再生和骨转换 (turnover，骨吸收与骨形成)活动中也有重要作用。体外研究表明SP可以刺激 骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，or BMSCs)增殖分化并呈浓度依赖关 系，药理学的研究显示，SP没有不良药理作用或遗传毒性，可以安全的用于体内 细胞动员和治疗。基于以上多种特性，SP是一种方便易得、作用多样、安全可 靠的小分子活性肽，具有应用于人工器官组织工程的良好作用。

单纯SP多肽在体内会快速降解而失去活性，所以为实现SP的体内生物学 效应，应设计适当的运载、定位、缓释系统以控制SP的功能作用。在本发明中， 通过制备生物活性固化液并用于磷酸钙材料调拌固化，其主要优点在于磷酸钙逐 渐降解，稳定缓释SP，持续产生干细胞动员作用。通过条状明胶构建材料内部 通道，类似于骨松质组织，有利于组织液渗透和新生血管等长入，以及材料内部 P物质缓释，实现复合材料在体内快速向正常骨组织转化。

具体实施方式的内容是为了便于本领域技术人员理解和使用本发明而描述 的，并不构成对本发明保护内容的限定。本领域技术人员在阅读了本发明的内容 之后，可以对本发明进行合适的修改。本发明的保护内容以权利要求的内容为准。 在不脱离权利要求的实质内容和保护范围的情况下，对本发明进行的各种修改、 变更和替换等都在本发明的保护范围之内。