可用于检测与大肠癌相关的PCDH-γ-A12基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了可用于检测与大肠癌相关的

说明书

技术领域

本发明涉及一种辅助诊断大肠癌的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测与大肠癌相关的PCDH-γ-A12基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用。

背景技术

大肠癌(Colorectal Cancer, CRC)又称结直肠癌，是消化系统中常见的恶性肿瘤。目前研究表明大肠癌是大肠黏膜上皮细胞在遗传和环境等多种复杂的因素共同作用下，发生遗传和表观遗传的改变而获得无限增殖，躲避凋亡程序等能力，从而在局部形成肿块。近年来，随着人们生活水平的提高，饮食习惯与结构的改变，加之人口老龄化趋势的影响，我国大肠癌的发病率和死亡率增长迅速，而且，发病年龄明显提前。世界卫生组织(WHO)发布的《全球癌症报告2014》显示中国癌症新增病例和死亡人数的绝对数值位居世界首位。其中以胃癌、食道癌、大肠癌为代表的消化道癌症威胁最为显著。尽管目前手术方式和辅助治疗手段不断改进，大肠癌的患者的术后生存情况有了较大的改善，但是CRC患者的五年总体生存率仍旧不高，其中最重要的一个因素就是，许多患者在疾病发生的早期没有得到及时的诊断和治疗。因此，有必要探索其他分子指标独立或者联合CEA 等检测，对大肠癌患者做到早发现，早诊断，早治疗，提高大肠癌患者总体生存率。

原钙粘附蛋白家族(protoeadherin family)是钙粘蛋白超家族中一个最大的亚族。其根据基因结构的不同，原钙粘附蛋白家族(protoeadherin family)主要由两类构成：聚集型原钙粘附蛋白和非聚集型原钙粘附蛋白。原钙粘附蛋白伽马亚家族(protoeadherin gamma subfamily,PCDH-γ)是聚集型原钙粘附蛋白中一类重要的亚族，包括原钙粘附蛋白伽马亚家族A12 (protoeadherin gamma subfamily A12，PCDH-γ-A12)在内，共有22位成员。原钙粘附蛋白伽马亚家族A12 (protoeadherin gamma subfamily A12,PCDH-γ-A12)位于5号染色(chr5:140254931-140257434)，其编码的细胞表面粘附蛋白，在细胞和细胞间，细胞和细胞基质间相互作用以及肿瘤转移过程中发挥重要作用。有研究表明，在原发人脑胶质瘤组织中，原钙粘附蛋白伽马亚家族中原钙粘附蛋白伽马亚家族A11成员(protoeadherin gamma subfamily A11，PCDH-γ-A11)启动子序列因表观遗传甲基化修饰而失活，该基因启动子甲基化可能成为胶质瘤恶性程度和预后评价的分子生物学标记。而目前，国内外还没有公开任何关于在大肠癌中用于检测原钙粘附蛋白伽马亚家族A12 (protoeadherin gamma subfamily A12，PCDH-γ-A12)基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测方便、针对性强、检测准确率高的可用于检测与大肠癌相关的PCDH-γ-A12基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，其中基因PCDH-γ-A12甲基化水平与大肠癌的患病率呈正相关，可通过对样品DNA甲基化水平测定辅助诊断大肠癌。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种可用于检测与大肠癌相关的PCDH-Γ-A12基因启动子区甲基化程度的试剂盒，包括PCDH-γ-A12基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物、下游引物及其未甲基化特异性扩增上游引物和下游引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

5’-ATTAAGGTGGTGGCGGTGGAT -3’；

所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

5’-GACGCCGACGCTCCTATCAA -3’；

所述的未甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

5’-AAGGTGGTGGTGGTGGATAG -3’；

所述的未甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：

5’-ACCAACACTCCTATCAAAC -3’。

一种可用于检测与大肠癌相关的PCDH-γ-A12基因启动子区甲基化程度的试剂盒的应用，该试剂盒可用于大肠癌辅助检测、诊断或药物治疗中。

 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了可用于检测与大肠癌相关的PCDH-γ-A12基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，所述的检测试剂盒包含PCDH-γ-A12基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物、甲基化特异性扩增下游引物及其未甲基化特异性扩增上游引物、未甲基化特异性扩增下游引物，原钙粘附蛋白伽马亚家族A12基因启动子区域的高甲基化水平导致大肠癌患者原钙粘附蛋白伽马亚家族A12基因低表达，从而导致大肠癌细胞具有更强的侵袭能力，影响大肠癌患者的预后。因此，原钙粘附蛋白伽马亚家族A12基因启动子区甲基化情况能用作大肠癌恶性程度和预后评价的分子生物学标记，以检测大肠癌原钙粘附蛋白伽马亚家族A12基因启动子区甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对大肠癌的检测，对大肠癌恶性程度和预后判断，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于大肠癌的早期发现和及时治疗。

附图说明

图1为PCR产物琼脂糖凝胶电泳成像图；

图2为PCR产物测序结果图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例

1、研究对象的收集

本研究选取宁波市某三甲医院手术切除的大肠癌患者42例手术标本作为研究对象。所有病例诊断，依据患者的临床资料、影像学和结肠镜检查等，并得到术后病理诊断确认。手术切除大肠癌组织和癌旁组织(距离癌组织至少5cm以上的正常组织)立即保存于-80度液氮，用于日后组织标本全基因组DNA提取。所有研究对象都签署知情同意书。

2、基因组DNA的提取

采用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, 德国)DNA提取试剂盒提取组织全基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计(美国，Thermo Fisher Scientific)检测所得DNA的浓度，以供原钙粘附蛋白伽马亚家族A12基因启动子区DNA甲基化水平的检测。

3、DNA甲基化测定

本实验采用甲基化特异性链式聚合反应技术对原钙粘附蛋白伽马亚家族A12基因启动子区序列进行了DNA甲基化测定。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链反应(PCR)扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶(C)碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变成了尿嘧啶(U)，然后通过甲基化特异性引物能且只能与甲基化样本结合进行PCR反应，而未甲基化特异性引物能且只能与未发生甲基化样本结合进行PCR反应，从而得出样本是否甲基化。本次研究采用Primer Premier 6.0 (PREMIER Biosoft International，Palo Alto，加拿大)软件进行引物设计，用于实验的PCR扩增引物如下：

所述的甲基化特异性扩增上游引物核苷酸序列如下：

5’-ATTAAGGTGGTGGCGGTGGAT -3’；

所述的甲基化特异性扩增下游引物核苷酸序列如下：

5’-GACGCCGACGCTCCTATCAA -3’；

所述的未甲基化特异性扩增上游引物核苷酸序列如下：

5’-AAGGTGGTGGTGGTGGATAG -3’；

所述的未甲基化特异性扩增下游引物核苷酸序列如下：

5’-ACCAACACTCCTATCAAAC -3’。

DNA甲基化测定的具体步骤：

步骤一：采用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen，Hilden，德国)DNA提取试剂盒提取组织全基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA的浓度；

步骤二：采用EZ DNA甲基化试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化；

步骤三：取步骤二中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo Taq^TM PreMix酶(Zymo Taq^TM PreMix，ZYMO RESEARCH)，分别加入上述一对原钙粘附蛋白伽马亚家族A12基因启动子区甲基化特异性扩增引物和一对原钙粘附蛋白伽马亚家族A12基因启动子区未甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增，扩增条件：首先95℃ 15min的变性；接着94℃45s，Tm 45s，72℃ 1min，共35个循环的退火反应；然后延伸反应72℃10min(注：Tm在实验中根据跑PCR梯度温度确定)；

步骤四：将步骤三的PCR产物取5μl放置于采用Regular Agarose G-10 (Biowest，西班牙)配制的浓度为2%琼脂糖凝胶进行电泳，在通过BIO-RAD Gel Doc? XR+ 凝胶成像系统成像，判断PCR产物甲基化情况（图1）。如图1，M 代表甲基化，U代表未甲基化。T代表肿瘤组织，N代表癌旁组织。应用PCDH-γ-A12基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物和下游引物能扩增出明显的特异条带则认为该样本PCDH-γ-A12基因发生甲基化，如应用PCDH-γ-A12基因启动子区的未甲基化特异性扩增上游引物和下游引物扩增出的明显单一条带，则认为该样本PCDH-γ-A12基因未发生甲基化，且条带的亮暗程度与基因的甲基化程度相关。从结果中我们可以看出T5，T12和T36肿瘤组织以及N5，N12和N36正常组织中PCDH-γ-A12基因启动子区都存在甲基化，但是肿瘤组织中的条带亮度明显高于正常组织，提示肿瘤组织中的甲基化程度要高于正常组织。随后，我们将样本进行测序（图2），如图2所示，野生型PCDH-γ-A12基因序列（wild-type）是正常组织测序所得结果，而我们的样本中PCDH-γ-A12基因序列（methylated）因存在甲基化，并且被随后的重亚硫酸盐处理处理碱基序列发生改变，测序结果证明PCDH-γ-A12基因启动子区存在甲基化。

4、数据分析

本次实验采用SPSS 16.0对数据进行整理分析，我们发现：在大肠癌组织中原钙粘附蛋白伽马亚家族A12基因启动子区甲基化率高于周边癌旁组织，且差异有统计学意义(卡方值=6.891，p = 0.009，见表 1，注： p值小于0.05，具有统计学意义)。此外，42例大肠癌研究对象中，21例已发生淋巴结转移，21例未发生淋巴结转移。进一步分析，我们发现发生淋巴结转移的大肠癌标本中原钙粘附蛋白伽马亚家族A12基因启动子区甲基化率高于未发生淋巴结转移的大肠癌标本，且差异有统计学意义(卡方值=6.171, p = 0.013，见表2)；

表 1 癌组织与癌旁组织甲基化比较(n=42)

 注：n表示样本个数，p值小于0.05，具有统计学意义；

表2发生淋巴结转移和未发生淋巴结转移的大肠癌组织甲基化比较(n=21)

 注：n表示样本个数，p值小于0.05，具有统计学意义。

与其他传统的大肠癌检测技术相比，此试剂盒技术具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。本发明采用上述试剂盒对PCDH-γ-A12基因启动子区甲基化水平进行检测，能够快速可靠地为大肠癌的辅助诊断、检测或筛查药物提供借鉴。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。