刺足根螨依赖解旋酶DNA等温扩增快速检测引物、试剂盒、检测方法

摘要

本发明公开了一种刺足根螨依赖解旋酶DNA等温扩增快速检测引物、试剂盒、检测方法。CUP1上游引物序列为SEQ ID NO 1；CNP1下游引物序列为SEQ ID NO 2；SUP2上游引物序列为SEQ ID NO 3；SNP2下游引物序列为SEQ ID NO 4。试剂盒内有反应液I、反应液I’和反应液Ⅱ。检测刺足根螨的方法包括刺足根螨DNA的提取、模板预处理、HDA等温扩增、核酸检测。本发明的优点是简单、快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及一种刺足根螨依赖解旋酶DNA等温扩增（HDA）快速检测引物、试剂盒及其检测方法，属生物检测领域。

背景技术

根螨生存能力很强，全年均可发生，群集为害植物地下部，取食植物组织，而且可作为植物病原物的载体，诱发、刺激病原菌发生，与病原菌可以互相促进发生，在田间可致使植物叶片枯黄，植株矮化、凋萎，甚至死亡，在仓库可使植物腐烂，对农作物及花卉等的品质有极大影响；唐菖蒲严重受害时，产量损失高达54.2%-9%。由于根螨能造成严重经济损失，而且一旦定殖即难以根除，澳大利亚、新西兰、美国、日本等国家将该属的多个种列为检疫性有害生物。刺足根螨是根螨属中危害最严重的种类之一，刺足根螨能够危害韭黄、韭菜、葱类、百合、芋、甜菜、马铃薯、唐菖蒲、半夏、贝母等，该螨既有寄生性也有腐生性，同时也有很强的携带腐烂病菌和镰刀菌的能力。近年来，随着进出口产品的增多，螨类检疫越来越重要。我国刺足根螨分布比较广泛，而我国的大蒜、百合、马铃薯等农产品每年出口量连续递增，很多出口目的国家对刺足根螨实行严格检疫甚至列为检疫性对象，因此对刺足根螨的准确、快速检测对保障出口的顺利进行，保护出口商农的经济利益具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种刺足根螨依赖解旋酶DNA等温扩增（HDA）快速检测引物、试剂盒及其检测方法，以克服现有形态鉴定等常规技术的不足，从而为生物安全提供科学的依据和指导作用。

本发明提供的刺足根螨的HDA快速检测试剂盒，包括：

（1）模板预处理反应液I： 0.1umol/L特异性上下游引物CUP1、CNP1，0.1mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L DTT，0.25 mmol/L dNTP，dH₂O，反应液I的pH 7.5。

SEQ ID NO 1：CUP1    5’- GAGCCTTTTGGTAGTCTT -3。

SEQ ID NO 2：CNP1    5’- CATCTAAACCAACTGTGAA -3。

（2）模板预处理反应液I’： 0.1umol/L特异性上下游引物SUP2、SNP2，0.1mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L DTT，0.25 mmol/L dNTP，dH₂O，反应液I’的pH 7.5。

SEQ ID NO 3：SUP2   5’-ATTATGTATGTGCTCGAG-3’。

SEQ ID NO 4：SNP2   5’-GCACTTTTCCTTCATGCCAGATT -3’。

（3）阳性对照模板：0.1umol/L DNA模板。

（4）HDA等温扩增液Ⅱ：0.15mg/ml BSA，20mmol/L乙酸镁，5.5mmol/LATP，0.02U/μL Exo-Klenow， 2ng/μL UvrD解旋酶，10ng/μL MutL，0.1 ug/μL T4gp32， dH₂O，扩增液Ⅱ的pH 7.5。

本发明提供的利用上述试剂盒检测刺足根螨的方法，包括下列步骤：

（1）待检螨虫或刺足根螨DNA的提取：

提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD₂₆₀/ OD₂₈₀在1.6-2.0范围内，浓度在10-100 ng/μL范围内；

（2）模板预处理：

将装有23μL模板预处理反应液Ｉ和I’的反应管分别加入2 μL待检模板DNA于95 ℃水浴5 min后迅速放入37℃的水浴中冷却5min；

（3）HDA等温扩增：

将上述经过处理的模板预处理混合溶液25μL分别加入25μL扩增液Ⅱ，64℃加热100min，80℃10min，降温至4℃；

（4）核酸凝胶电泳检测：

核酸扩增完成后，扩增结果在琼脂糖凝胶电泳检测，如果Ｉ和I’反应液均出现100bp单条条带，可以判断为阳性，否则为阴性。

本发明的试剂盒根据刺足根螨的COI基因序列及18S rDNA基因序列设计引物，引物的设计主要经过与近缘种的对比，选取变异较大的区域设计扩增刺足根螨的HDA等温扩增上下游引物两对，用于增加检测的准确度与特异性。同时对设计的引物进行特异性筛选。本发明采用改进的HDA技术，该技术特异性强，具有与PCR检测方法相似灵敏度，但其阔增速度比PCR快，在30min内就可以检测到扩增，并且不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，检测方法简单、快速，特异性强、灵敏度高，特别适用于基层植保机构及植物产品公司与相关检测部门现场诊断。

附图说明

图1是刺足根螨HDA扩增图谱，其中：M:DL2000marker，1:刺足根螨样品样品在Ｉ反应液扩增结果，2:刺足根螨样品样品在I’反应液扩增结果；3:阴性对照；4:空白对照。

图2是刺足根螨HDA等温扩增特异性检测图，其中：M: DL2000marker；1-3:刺足根螨样品在Ｉ反应液扩增结果；4:罗宾根螨样品在Ｉ反应液扩增结果；5:长毛根螨样品在I反应液扩增结果；6:紫草根螨样品在I反应液扩增结果；7:水芋根螨样品在I反应液扩增结果；8:阴性对照；9:空白对照。1’-2’:刺足根螨样品在Ｉ’反应液扩增结果；3’:罗宾根螨样品在Ｉ’反应液扩增结果；4’:长毛根螨样品在I’反应液扩增结果；5’:紫草根螨样品在I’反应液扩增结果；6’:水芋根螨样品在I’反应液扩增结果；7’:阴性对照；8’:空白对照。

具体实施方式

本发明的主要原理为在恒温条件下利用生物复制系统的关键组分实现DNA的体外扩增。

本发明提供的刺足根螨HDA等温扩增快速检测试剂盒，其中包括：

（1）模板预处理反应液I：，0.1umol/L特异性上下游引物CUP1，CNP1，0.1mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L DTT，0.25 mmol/L dNTP，dH₂O， pH 7.5。

刺足根螨特异性引物1：

CUP1    5’- GAGCCTTTTGGTAGTCTT -3

CNP1    5’- CATCTAAACCAACTGTGAA -3

（2）模板预处理反应液I’： 0.1umol/L特异性上下游引物SUP2，SNP2，0.1mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L DTT，0.25 mmol/L dNTP，dH₂O， pH 7.5。

刺足根螨特异性引物2：

SUP2   5’-ATTATGTATGTGCTCGAG-3’

SNP2   5’- GCACTTTTCCTTCATGCCAGATT -3’

（3）阳性对照模板：0.1umol/L DNA模板

（4）HDA等温扩增液Ⅱ：0.15mg/ml BSA，20mmol/L乙酸镁，5.5mmol/LATP，0.02U/μL Exo-Klenow， 2ng/μL UvrD解旋酶，10ng/μL MutL，0.1 ug/μL T4gp32， dH₂O， pH 7.5。

本发明提供的利用上述试剂盒检测刺足根螨的方法，包括下列步骤：

（1）待检螨虫或刺足根螨DNA的提取：

提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD₂₆₀/ OD₂₈₀在1.6-2.0范围内，浓度在10-100 ng/μL范围内；

（2）模板预处理：

将装有23μL模板预处理反应液Ｉ和I’的反应管分别加入2 μL 待检模板，阴性对照加入2 μL dH₂O，于95 ℃水浴5 min后迅速放入37℃的水浴中冷却5min；

（3）HDA等温扩增：

将上述经过处理的模板预处理混合溶液25μL分别加入25μL溶液Ⅱ中，64℃加热100min，80℃10min，降温至4℃；

（4）核酸凝胶电泳检测：

核酸扩增完成后，核酸扩增完成后，在反应管中加入6×Loading buffer(组分：30mM EDTA ；36%(v/v) Glycerol；0.05%(w/v) Xylene Cyanol FF；0.05%(w/v) Bromophenol Blue)，取产物10 μL加入2%的琼脂糖凝胶板的样品孔中，100v电压，电泳 30-40分钟，电泳成像系统拍照。如果Ｉ和I’反应液均出现100bp单条条带，可以判断为阳性，否则为阴性。

下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。

实施例1

利用刺足根螨HDA等温扩增检测试剂盒，检测刺足根螨：

（1）待检螨虫和刺足根螨DNA的提取（2）模板预处理（3）HDA等温扩增（4）核酸凝胶电泳检测。结果如图1所示。刺足根螨样品扩增条带单一、清晰。

实施例2 特异性实验

利用刺足根螨HDA等温扩增检测试剂盒，检测刺足根螨：

（1）待检螨虫和刺足根螨DNA的提取：分别提取刺足根螨R. echinopus、罗宾根螨R. robini、长毛根螨R. setosus、紫草根螨R. callae、水芋根螨R. caladii样品DNA，提取的DNA OD₂₆₀/ OD₂₈₀在1.6-2.0范围内，浓度在10-100 ng/μL范围内；

（2）模板预处理：将装有23μL模板预处理反应液Ｉ和Ｉ’的反应管加入2 μL 待检模板（分别为刺足根螨、罗宾根螨、长毛根螨、紫草根螨、水芋根螨及dH₂O）于95 ℃水浴5 min后迅速放入37℃的水浴中冷却5min；

（3）HDA等温扩增：将上述经过处理的模板预处理混合溶液25μL分别加入25μL溶液Ⅱ中，64℃加热100min，80℃10min，降温至4℃；

（4）核酸凝胶电泳检测。结果如图2所示。刺足根螨样品在反应液Ｉ和Ｉ’扩增条带单一、清晰，其他四种根螨反应液Ｉ和Ｉ’都没有扩增，说明本试剂盒的特异性较好。

以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

核苷酸序列表

 

<110>  山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

 <120>  刺足根螨依赖解旋酶DNA等温扩增快速检测引物、试剂盒、检测方法

<160>  4    

<170>  PatentIn version 3.5

 

 

<210>  1

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<221>  primer_bind

<222>  (1)..(18)

<223>  用于扩增刺足根螨的COI基因的上游引物

<400>  1

GAGCCTTTTGGTAGTCTT                                           18

                                          

 

 

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

<221>  primer_bind

<222>  (1)..(19)

<223>  用于扩增刺足根螨的COI基因的下游引物

<400>  2

CATCTAAACCAACTGTGAA                                         19

 

 

<210>  3

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<221>  primer_bind

<222>  (1)..(18)

<223>  用于扩增刺足根螨的18S rDNA基因的上游引物

<400>  3

ATTATGTATGTGCTCGAG                                           18

 

 

 

<210>  4

<211>  23

<212>  DNA

<213> 人工序列

<221>  primer_bind

<222>  (1)..(23)

<223>  用于扩增刺足根螨的18S rDNA基因的下游引物

<400>  4

GCACTTTTCCTTCATGCCAGATT                                     23