解淀粉芽孢杆菌JK6及生物肥和应用

摘要

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌JK6及生物肥和应用，该菌株保藏编号为CGMCC No.10658，于2015年03月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；本发明的解淀粉芽孢杆菌JK6主要用于番茄青枯病的生物防治；该解淀粉芽孢杆菌具备产铁载体、生物膜、蛋白酶、过氧化氢酶、纤维素酶和IAA特性，可有效抑制香蕉枯萎病原菌、荔枝炭疽病原菌、荔枝霜疫霉病原菌、水稻稻瘟病原菌、黄瓜枯萎病原菌等多种真菌病原菌，显著促进生菜植株的生长；K6菌株能够在土壤中成功定殖，并在土壤中表达防病功能基因yndJ、srfAB、fenD和ituC；该菌种繁殖速度快，生产工艺简单，抗逆能力强，易保存，利于工业化生产，利用该菌株制备生物肥，既可以防治土传病害又能促进植物生长，应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物及其应用，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌JK6(Bacillus  amyloliquefaciens)及应用。

背景技术

番茄青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种毁灭性土传病害， 重病田发病率可高达80％以上，甚至造成绝收。目前，农业上对番茄青枯病主要依靠化学农 药防治，效果均不理想，长期大量、不合理地施用化肥和化学农药，容易导致病原菌的耐药 性、果蔬有毒化学物质残留量增加等问题。随着绿色农业的发展，逐渐转向以生物防治为主 的综合防治，筛选高效拮抗菌株是生物防治的核心。研究表明能产生多种抗生素、具有广谱 抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌成为生物防治的重要研究对象。

全基因组测序快速发展以及对防病功能基因表达调控的研究，为探明生防菌株田间生防 潜力提供了有力的技术方法。Okubara报道生防菌抗菌活性物质的合成与功能基因有关。 B.amyloliquefaciens FZB42、FMB38、AS43.3的全基因组测序发现其均含有srfA、B、C、D， ituA、B、C、D，fenA、B、C、D，yndj，qk等多对防病功能基因，其发酵产物中也检测到 多种抗生素，例如B.amyloliquefaciens FZB42能产surfactin、fengycin等抗生素，对尖孢镰刀 菌、水稻纹枯病、灰霉病等有抑制作用；Christopher报道的B.amyloliquefaciens AS 43.3能产 iturinA、bacillibactin等抗生素，可以有效防治赤霉病。Abdulwareth研究了Bacillus strain Am1、 D16单独培养以及和青枯雷尔氏菌混合培养中ituC、srfAA、bacA、fenD等四个功能基因表 达量的差异，结果表明：Bacillus strain D16和青枯雷尔氏菌混合培养液中，四个功能基因的 表达量都增高；而Bacillus strain Am1和青枯雷尔氏菌混合培养液中，fenD的表达量下降， 其余三个功能基因的表达量均增高；该结果表明Bacillus strain Am1、D16抑制青枯雷尔氏菌 的效果与功能基因的表达情况密切相关。

虽然较多生防菌株已经报道含有多种防病功能基因，但在复杂的土壤环境因子中菌株能 否成功定殖并大量表达还没有深入研究，土壤中功能基因表达量的定量检测方法尚待研究。 本发明中的B.amyloliquefaciens JK6基因组中含有srfAB，ituA、B、C、D，fenD，yndJ等多 种防病功能基因，并建立了利用RT-PCR技术研究菌株在土壤中功能基因表达的制备方法， 结果证明施加了JK6菌剂的盆栽土中yndJ、srfAB、fenD、ituC等功能基因的拷贝数显著高 于对照组，表明JK6菌株能够在土壤中大量定殖、繁殖，并成功表达多种功能基因，这些结 果进一步确证菌株在土壤中生防潜力发挥。

发明内容

本发明的目的之一在于根据现有技术中上述问题，提供一种兼具防病与促生功能的解淀 粉芽孢杆菌JK6。

本发明的第二个目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌JK6基因组为模板进行PCR扩增得到 合成脂肽类抗生素的功能基因。

本发明的第三个目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌JK6的功能基因在土壤中表达的制备 方法。

本发明的第四个目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌JK6的发酵液。

本发明的第五个目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌JK6发酵液的生物肥。

本发明的最后一个目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌JK6及生物肥的应用。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案实现上述目的：

一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JK6，简称JK6菌。该菌株于2015年 03月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号 CGMCC No.10658，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究 所。

该JK6菌是在广州华南农业大学蔬菜基地的赤红壤中分离、纯化所得，目前已经在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，其保藏编号为：CGMCC No.10658， 保藏日期为2015年03月23日。

菌株的生理生化性质如下：属革兰氏阳性菌，有芽孢；菌体为杆状，有运动性，好氧； 在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24h后形成的菌落为圆形或不规则状，48h后菌落全部为圆形， 乳白色，直径约为1～2mm，边缘不整齐，扁平湿润，表面形成生物膜，接触酶反应、蛋白酶 反应为阳性；利用碳水化合物产酸试验：淀粉水解、水解明胶为阳性，柠檬酸盐利用和甲基 红试验为阴性。

菌株具有较强的抑制细菌和真菌病原菌的能力，经过生理生化和分子鉴定为解淀粉芽孢 杆菌，其拉丁名为：Bacillus amyloliquefaciens，菌株的16S rRNA基因序列测定结果如SEQ ID  NO:1所示。

JK6菌的保藏方法，其保藏培养基的成分为牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，氯化钠5.0g，琼 脂18.0g，蒸馏水1000mL，或按照此比例配制成的培养基，pH值为7.0～7.2。按常规菌种保 藏温度保藏。

本发明的第二个目的是通过下述技术方案实现的：

以上述的解淀粉芽孢杆菌JK6基因组为模板进行PCR扩增得到合成脂肽类抗生素的功能 基因；

所述的功能基因如下：

1)yndJ，其基因序列如SEQ ID NO.4；

2)fenD，其基因序列如SEQ ID NO.5；

3)ituC，其基因序列如SEQID NO.6；

4)ituD，其基因序列如SEQID NO.7；

5)ituB，其基因序列如SEQID NO.8；

6)ituA，其基因序列如SEQID NO.9；

7)srfAB，其基因序列如SEQID NO.10。

上述功能基因，其PCR反应体系和条件如下：

(1)PCR反应体系：10×Taq buffer 5μL，dNTP 4μL，5’端引物(25pmol/L)2μL，3’ 端引物(25pmol/L)2μL，模板DNA 2μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.25μL，H₂O 34.75μL， 总体积50μL。

(2)PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸 30s，30个循环；72℃补充延伸10min。

本发明的第三个目的是通过下述技术方案实现的：

上述解淀粉芽孢杆菌JK6的功能基因在土壤中表达的制备方法：

(1)以分别含有功能基因(yndJ、srfAB、fenD、ituC)的重组质粒载体为模板，测定其 DNA浓度并换算成拷贝数，绘制标准曲线；用Power soil试剂盒提取番茄盆栽不同处理土壤 的总DNA；将供试土壤总DNA和获得的重组质粒DNA为模板，进行RT-PCR分析；

(2)其RT-PCR扩增体系为20μL：DNA模板1μL；上、下引物各1μL；SYBR Premix Ex-Taq (DBI)10μL，水7μL；

(3)其RT-PCR扩增条件如下：

Cycle1：95℃2min；

Cycle2×40(Real time)：step1:95℃15s，step2:60℃20s；

Cycle3(Melt Curve)：95℃1min，60℃1min，95℃20s；

(4)其RT-PCR扩增的引物为：ituC：ITUC-F：GCCTCCTGCTCATTGTCCTT，ITUC-R： GACGGCGTATCGTGGAGAAT，其它功能基因RT-PCR采用的引物同菌株DNA功能基因普 通PCR引物一致，如表7所示。

本发明的第四个目的是通过下述技术方案实现的：

一种含解淀粉芽孢杆菌JK6的发酵液。

进一步的，上述的含解淀粉芽孢杆菌JK6的发酵液，所述的发酵液中含有脂肽类抗生素 surfactin，其含量为64.24mg/L。

该发酵液的制备方法如下：

在超净工作台中把保存在斜面上的菌株接种到平板上活化培养，培养温度28～30℃，培 养18-36h；种子液培养：从平板上挑活化的菌落接入种子培养液中，30℃摇床培养1d， 转速150r/min，得到种子液；按5％接种量，将获得的种子液接入发酵培养基中，30℃摇 床培养2～4d，转速150r/min，得到解淀粉芽孢杆菌JK6的发酵液。

抑菌活性物质的提取方法如下：

取5mL发酵液在10000r/min下离心10min，除去菌体、取上清液，重复该步骤一次得 到无细胞上清液，加入活化的C18萃取柱中，用5mL高纯水洗涤2遍，再分别用1mL的 60％～100％的甲醇溶液萃取，再过0.22μm的滤膜，既得抑菌活性物质surfactin的萃取液。

用HPLC仪器测定surfactin含量的方法如下：

从sigma公司购买surfactin标准品，用甲醇分别配制成100、250、500、1000ppm的标 准品，用HPLC测定标品和JK6样品，其HPLC的检测条件：色谱柱为Agilent C18柱，4.6 mm×250mm×0.5μm；进样量20μL；柱温33-35℃；检测波长210nm；流速0.8-1.0ml/min； 检测时间20min。溶剂：A为水加0.1％TFA，B为100％乙腈；梯度变化条件如表1所示。

表1surfactin检测时的流动相

本发明的第五个目的是通过下述技术方案实现的：

一种含上述的解淀粉芽孢杆菌JK6发酵液的生物肥，其中，所述的解淀粉芽孢杆菌JK6 含量为2×10⁸～2×10¹⁰cfu/mL。

该生物肥的制备方法如下：

1)在超净工作台中把保存在斜面上的菌株接种到平板上活化培养，培养温度28～30℃， 培养18-36h；

2)种子液培养：从平板上挑活化的菌落接入种子培养液中，30℃摇床培养1d，转速 150r/min，得到种子液；

3)发酵培养：按5％-10％接种量，将获得的种子液接入发酵培养基中，30℃摇床培养 1d，转速150r/min，得到解淀粉芽孢杆菌JK6的发酵液。

其中：

种子培养时所用的培养基成分：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15～20 g/L，pH 6.8～7.2；

发酵培养时所用的培养基成分：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L， pH7.0～7.2。

本发明的最后一个技术方案是提供该解淀粉芽孢杆菌JK6的应用，具体如下：

上述的解淀粉芽孢杆菌JK6或者生物肥在产铁载体、生物膜、蛋白酶、过氧化氢酶、纤 维素酶以及IAA方面的应用。

上述的解淀粉芽孢杆菌JK6或者生物肥在抑制植物真菌病原菌方面的应用，所述的植物 真菌病原菌为香蕉枯萎病原菌、荔枝炭疽病原菌、荔枝霜疫霉病原菌、水稻稻瘟病原菌、黄 瓜枯萎病原菌。

上述的解淀粉芽孢杆菌JK6或者生物肥在防治番茄青枯病方面的应用。

所述番茄青枯病的病原菌为青枯假单胞菌(Ralstonia Solanacearum)。所述香蕉枯萎病 的病原菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)。所述荔枝炭疽病的病原菌为 (Colletotrichum gloeosporioides)。所述荔枝霜疫霉的病原菌为(Peronophythora litchii)。所 述水稻稻瘟病的病原菌为(Magnaporthe oryzae)。所述黄瓜枯萎病的病原菌为(F.oxysporum  f.sp.cucumerinum)。

上述的解淀粉芽孢杆菌JK6或者生物肥在促进植物生长中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明从广州华南地区的赤红壤中分离得到解淀粉芽孢杆菌JK6，在室内试验中验证了 其具备产铁载体、生物膜、过氧化氢酶、蛋白酶、纤维素酶和IAA等多种拮抗和促生特性， 并从其发酵液中分离得到主要抗菌物质脂肽类抗生素surfactin。本研究分别从多方面综合探 究生防菌株的防病机制，将为其防病促生潜力稳定高效发挥提供理论依据，对生防菌剂的大 面积推广应用有重要的实践意义，具体表现如下：

(1)本发明提供的解淀粉芽孢杆菌JK6，对番茄青枯病具有高效生物防治能力，盆栽试 验结果表明，在含有青枯病菌的土壤中施加该菌剂后，番茄青枯病的生物防治率达52.2％。

(2)该菌株能产吲哚乙酸，能促进植物的生长，生菜大田试验结果表明：施加了该菌剂 处理的生菜干物质量比对照增加了64.2％，显著增加生菜植物的产量。

(3)该菌株对香蕉枯萎病原菌、荔枝炭疽病原菌、荔枝霜疫霉病原菌、水稻稻瘟病原菌、 黄瓜枯萎病原菌等多种真菌病原菌具有广谱抑菌能力。

(4)该菌株发酵液的抑菌物质中分离得到脂肽类抗生素surfactin，其产量高达64.24 mg/L，属于天然农用抗生素，对生物防治的重要作用在国内外均有报道。

(5)对土壤DNA中的防病功能基因采用RT-PCR技术进行定量分析，结果表明施加了 JK6菌剂的土样中功能基因(yndJ、srfAB、fenD、ituC)的拷贝数显著高于没有施加JK6菌 剂的对照处理，进一步确证了生防菌株在土壤中产生实际的生防效果，并建立了菌株功能基 因在土壤中表达的制备方法。

(6)该菌株繁殖速度快，生产工艺简单，抗逆能力强，易保存，利于工业化生产；能防 治多种土传真菌和细菌病害，显著促进植物生长，可以减少农民使用化肥和化学农药的用量， 既能节省开支，又利于蔬菜无公害生产，利于农产品出口，同时可为农民增加收入。

(7)本发明将为研究功能菌株的高效生物防治潜力发挥提供理论依据，同时为生物防治 提供高效菌株资源。

图1.JK6菌革兰氏染色显微照片，菌体被染成紫色；

图2.JK6菌芽孢染色显微照片，其中蓝色部分为芽孢；

图3.JK6菌系统发育树图；

图4.JK6菌产过氧化氢酶试验照片，其中HL-1为阳性对照；

图5.JK6菌解淀粉试验照片，其中HL-1为阳性对照；

图6.JK6菌产生物膜试验照片；

图7.JK6菌产铁载体试验照片；

图8.JK6菌为产蛋白酶试验；

图9.JK6菌产纤维素酶试验；

图10.JK6菌对番茄青枯病原菌的拮抗效果图；

其平板是含番茄青枯病原菌的培养基，用灭菌打孔器打孔，用移液枪移20μLJK6发酵液 于孔中，对峙培养2d后观察含菌平板上形成的抑菌圈；

图11.JK6菌对真菌病原菌的拮抗效果图；

其中A：香蕉枯萎病原菌；B：荔枝炭疽病原菌；C：荔枝霜疫霉病原菌；D：水稻稻瘟 病原菌；E：黄瓜枯萎病原菌。

图12.JK6菌防治番茄青枯病的盆栽试验照片；

图13.JK6菌抗菌物质合成相关功能基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

其中左右的泳道分别为DL 2000DNA maker、yndJ、fenD、ituC、srfAB、ituA、ituD、ituB。

图14.JK6菌发酵液中m/z([M-H]^-)分别为992.7、1006.6、1020.6、1034.6的surfactin类组 分的质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明 的任何限制，任何人在本发明权力要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求 保护范围之内。

以下实施例中除特别说明外，均为本领域内的常规实验方法和操作步骤。

实施例1 菌株的分离、纯化

(1)分离

牛肉膏蛋白胨培养基：细菌学蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水 1000mL，pH调为7.0～7.2。

含青枯菌平板的制备：将青枯病菌制成菌悬液，用移液枪吸取5mL青枯病菌(Ralstonia  Solanacearum)菌悬液加入盛有加热融化后温度降至50℃左右的100mL的牛肉膏蛋白胨培养 基中，摇匀，倒板，自然晾干，制成含青枯菌的平板备用。

以广州华南农业大学农场番茄种植基地的赤红壤为筛选土样，用平板涂布法准确称取筛 选土样10g，放入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中(加玻璃珠)，摇床振荡30min， 使细菌充分分散，静置20～30s，取上清液进行10倍递减稀释，采用10³～10⁵稀释度，用移液 枪分别移取稀释液0.l mL，涂布在含菌平板上，28℃倒置培养2d，逐日观察透明圈，记录拮 抗圈直径(D)。筛选出有拮抗圈的细菌菌株编号为JK6、F7和Y-2，其中JK6的拮抗效果最强， D/d值为5.04。

(2)纯化

将初步筛选出的拮抗菌在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化后，挑单菌落于LB液体培养 基中过夜培养，菌液保存在-80℃的甘油管中。

实施例2 特性鉴定

(1)菌体形态特性

革兰氏阳性菌，有芽孢。菌体为杆状，有运动性，好氧。菌体革兰氏染色显微照片见图 1，芽孢染色照片见图2。

(2)菌落形态特性

在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24h后形成的菌落为圆形或不规则状，48h后菌落全部为 圆形，乳白色，直径约为1～2mm，边缘不整齐，扁平湿润，表面形成生物膜。

(3)生长特性

在酵母提取粉5g，细菌学蛋白胨10g，氯化钠10g，水1000mL的液体培养基中，转 速150rpm/min，温度30℃，起始pH值为7.0的条件下，培养18h，测得活菌数为(3.95±0.60) ×10⁸cfu/mL。

(4)生理、生化特性

参考《伯杰氏细菌鉴定手册》的常规实验方法，对此菌株进行一些生理生化试验，实验 结果见表2。

表2 菌株JK6生理生化试验

试验名称 结果 试验名称 结果 过氧化氢酶 + 解淀粉试验 + 铁载体试验 + 明胶液化试验 + 纤维素降解 + 产IAA试验 + 产生物膜 + 蛋白酶降解 + 产氨试验 + 甲基红试验 －

注：+表示为阳性；－表示为阴性

(5)分子生物学特性

采用试剂盒法提取JK6菌总DNA。采用细菌16S rDNA通用引物27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,SEQ ID NO:2)和1492R(ACGGCTACCTTGTTACGACTT, SEQ ID NO:3)，PCR扩增细菌的16S rRNA，在1400bp附近出现明显的条带，将PCR扩增 产物回收后进行序列测定，将获得的DNA序列输入GenBank，以Blast程序对数据库中的所 有序列进行比较分析，结果发现本发明所述菌株的16S rRNA序列(SEQ ID NO:1)和与 GenBank中解淀粉芽孢杆菌模式菌株Bacillus amyloliquefaciens FZB42具有较高的同源性，其 相似度为99％。结合上述的平板菌落特征、生理生化特性、16S rRNA序列建系统发育树的结 果，初步鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，命名为Bacillus  amyloliquefaciens JK6(系统发育树见图3)。

该JK6菌是在广东省广州市华南农业大学番茄种植基地的赤红壤中分离、纯化所得，目 前已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址是：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，其保藏编号为： CGMCC No.10658，保藏日期为2015年03月23日。

实施例3 JK6菌产过氧化氢酶试验

将JK6菌在牛肉膏蛋白胨培养基上活化24h后，挑适量供试菌株于载玻片上，滴加3％ 过氧化氢于供试菌株上，立即观察，有大量气泡产生，即为阳性，反之为阴性。以HL-1为 阳性对照，试验结果如图4所示，表明JK6菌的过氧化氢酶试验为阳性。

实施例4 JK6菌解淀粉试验

将JK6菌点接在淀粉培养基平板上，30℃恒温培养箱中培养48h，形成明显的菌落后， 在平板上滴加碘液，平板呈蓝黑色，菌落周围如有不变色透明圈，表示淀粉水解阳性；仍是 蓝黑色为阴性。以HL-1为阳性对照，试验结果如图5所示，表明JK6菌的解淀粉试验为阳 性。

实施例5 JK6菌产生物膜试验

将50μL过夜培养的新鲜待测菌液接种于装有500μL的LB液体培养基的微离心管中(1.5 mL),30℃静置过夜培养(24h)，弃菌液，用无菌水轻柔地洗一遍后，加入l mL l％的结晶 紫染色15min，用无菌水将染液洗净，若在管内壁的空气与培养基的接触面上形成一道清楚 的紫色环痕，即产生物膜，试验结果如图6所示，说明该菌株产生物膜。

实施例6 JK6菌产铁载体试验

(1)铬天青(CAS)检测液的配制：

溶液A：将0.07g铬天青粉末溶于50mL去离子水中，再加入10mL 1mmolL^-1的氯化铁 溶液(配制：称取0.027g氯化铁溶解，加入0.833mL 12molL^-1的氯化氢，定容至100mL)。

溶液B：将0.06g的HDTMA溶于40mL去离子水中。

溶液C：将A溶液沿烧杯壁缓缓加入到B溶液中，轻轻晃动，使得溶液A与B混合均 匀，既得溶液C：CAS检测液。

(2)蓝色检测板的制备：

蔗糖-天冬酰胺(MSA)培养基(gL^-1)：蔗糖20g，天冬酰胺2.0g，硫酸氢二钾1.0g， 七水硫酸镁0.5g，pH7.0。

在MSA培养基中加入1.8％琼脂成为固体培养基，121℃灭菌15min。

将CAS蓝色液在55℃水浴30min以上，培养基冷却至55-60℃左右，在无菌环境下以每 100mL固体MSA培养基加20mL CAS检测液，沿三角瓶壁缓缓加入，注意轻晃，避免气泡。 待平板冷却备用。

(3)接种

将菌株点接于MSA平板上，置于30℃培养3d，观察菌落外围黄色晕圈的大小，由于嗜铁 素竞争培养基中的EDTA螯合的铁离子，使培养基由蓝色变为黄色，由此判断是否产铁载体。 试验结果如图7所示，该菌株的周围出现明显的黄色晕圈，说明该菌株产铁载体。

实施例7 JK6菌产蛋白酶试验

蛋白酶检测培养基(g_.L^-1)：蛋白胨10g，氯化钠5g，氯化钙0.1g，脱脂奶粉10g，琼 脂18g，115℃灭菌30min，pH 7.2-7.4。

将菌株接种到蛋白酶检测培养基上，30℃培养2d，观察菌落周围的透明圈大小来判断菌 株的蛋白质水解能力，结果如图8所示，与对照相比，菌株平板上的蛋白质几乎都被利用完 全，说明该菌株利用蛋白质的能力很强。

实施例8 JK6菌产纤维素酶试验

CMC培养基配方(g_.L^-1)：羧甲基纤维素钠20g，磷酸氢二钠1.5g，磷酸二氢钠2.5g， 琼脂20g，水1000ml，PH：7.0-7.2。

将JK6菌从斜面上点接到CMC平板上，30℃培养2d，用千分之一的刚果红溶液(1g/L) 染色30min，再用1mol/L的氯化钠溶液固定30min，最后用流动的水冲洗，根据菌落周围 是否出现透明圈来判断菌株产纤维素酶的能力，结果如图9所示，菌落周围出现透明圈，说 明该菌株能够产纤维素酶。

实施例9 JK6菌产IAA试验

将JK6菌接种于含有100mg/L的L-色氨酸的LB液体培养基中，30℃，180r/min，摇 床培养1d，将菌悬液在8000rpm下离心10min，取4mL上清液加入4mL S2比色液，混匀， 黑暗中静置30min，在530nm下测吸光度，同时用无菌培养基做相同处理作为对照，用0、 10、20、30、50(ug/mL)的IAA作标准曲线。结果显示JK6菌的IAA产量为4μg/mL。

实施例10 JK6菌株对青枯病菌的平板拮抗效果试验

采用打孔对峙法。用移液枪吸取5mL青枯病菌菌悬液加入盛有加热融化后温度降至50℃左 右的100mL的牛肉膏蛋白胨培养基中，摇匀，倒板，自然晾干，制成含青枯菌的平板备用。 用直径为5mm的灭菌打孔器在含菌平板中央打孔，用灭菌的牙签把菌饼移除。用移液枪吸 取20μL的JK6菌悬液于含菌平板中央的孔中，30℃培养2～4d，观察孔的周围有无抑菌圈， 测量抑菌圈半径。结果表明(图10)：JK6菌拮抗番茄青枯病菌效果显著，抑菌圈直径为25.2 mm。

实施例11 JK6菌对真菌病原菌的平板拮抗效果试验

PDA培养基：取去皮的马铃薯200.0g，切成小块。加水煮沸30min，滤去马铃薯块将滤 液加水补足至1000mL，加葡萄糖20.0g，琼脂粉18g，熔化后分装，121℃灭菌20min。

采用平板对峙法。分别将已培养3d的真菌病原菌菌饼(φ5mm)移至PDA平板中央，然后 用接种环将供试JK6菌接种于病原菌菌饼的两侧，28℃培养，5d后观察抑菌圈。以不接种供 试细菌的平板作对照。结果见图11，其中A：香蕉枯萎病原菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense； B：荔枝炭疽病原菌Colletotrichum gloeosporioides；C：荔枝霜疫霉病原菌Peronophythora  litchii；D：水稻稻瘟病原菌Magnaporthe oryzae；E：黄瓜枯萎病原菌F.oxysporum f.sp. cucumerinum。该结果表明JK6菌能够显著抑制香蕉枯萎病原菌、荔枝炭疽病原菌、荔枝霜疫 霉病原菌、水稻稻瘟病病原菌、黄瓜枯萎病原菌的生长。

表3 JK6菌对植物真菌病原菌的抑制效果

注：数据为4次重复的平均值±标准误，表中同列不同字母者，表示在0.05水平差异显著(DMR法)， 下表相同。

实施例12 JK6菌防治番茄青枯病及促进植物生长盆栽效果试验

盆栽试验：采用JK6菌和空白对照进行效果对比试验，共分2个处理组(第1组加入JK6 菌菌体重悬液70mL，用JK6表示，第2组加入无菌水70mL作为空白对照，用CK表示)， 每个重复2盆，每盆4棵苗，每个处理3个重复。各处理组含土1.5kg，具体试验设计见表4。 番茄种子水洗催芽，用滤纸沁润保存水分，放置在30℃培养箱内，两天后露出芽播种至苗 床中。当苗约10cm高，移苗至盆中。每天浇水适量，每盆的水量相同，均匀，注意不要使 水流出盆底以免肥料损失而误差。2014年4月26日测量番茄株高和复叶片数。结果表明(表 5及图12)：加入JK6菌能够有效降低青枯病的发病率及显著促进植物的生长。

表4 番茄盆栽试验设计

实施例13 JK6菌促进植物生长田间效果试验

采用JK6菌和空白对照进行效果对比试验，共分2个处理组(第1组加入JK6菌发酵液， 用JK6表示；第2组加入相同量的未接菌株的培养基，用CK表示)。每个处理组3个小区， 每个小区面积2.43×1.4m²，种植密度15×8＝120株苗(除去边际效应保护行，实际株数13 ×6＝78株)。生菜种子水洗催芽，用滤纸沁润保存水分，两天后露出芽播种至苗床中。当苗 长出两心一叶时，移入大田，每小区136棵苗。每个小区定量浇水，均匀一致。2014年4月 18日收苗，并测量生菜株高、叶面积、相对叶绿素含量、根干重、叶干重等。结果表明(表 6)：加入JK6菌能够促进生菜的生长。

表6 JK6菌对生菜植株的田间促生效果对比表

实施例14 JK6菌抗生素合成功能基因的检测

为了明确解淀粉芽孢杆菌JK6能否产生脂肽类抗生素，首先采用PCR方法对菌株JK6 基因组中脂肽抗生素合成相关功能基因进行检测，对可能产生的脂肽类物质进行预判断。本 研究采用的引物是参照文献报道，引物序列见表7。PCR反应体系为：10×Taq buffer 5μL， dNTP 4μL，5’端引物(25pmol/L)2μL，3’端引物(25pmol/L)2μL，模板DNA 2μL，Taq  DNA聚合酶(5U)0.25μL，H₂O 34.75μL，总体积50μL。PCR反应条件：95℃预变性5min， 94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃补充延伸10min。PCR 产物切胶回收后，连接到载体pMD18-T上，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克 隆测序。测序由华大科技公司(广州)完成。DNA测序后的产物序列利用NCBI数据库的 BLASTN程序进行同源性检索，与GenBank数据进行对比分析。

表7 扩增基因及引物序列

以菌株JK6基因组DNA为模板，扩增抗菌物质合成的相关功能基因，其PCR产物的大小 与理论值相吻合。结果如图13所示，左右的泳道分别为DL 2000DNA maker、yndJ、fenD、 ituC、srfAB、ituA、ituD、ituB。

将扩增的各基因片段送测序，测序结果如：yndJ：SEQ ID NO:4；fenD：SEQ ID NO:5；ituC： SEQ ID NO:6；ituD：SEQ ID NO:7；ituB：SEQ ID NO:8；ituA：SEQ ID NO:9；srfAB：SEQ  ID NO:10；将其序列在NCBI上进行BLAST同源性分析，结果如下表8所示：

表8 PCR产物测序比对结果以及具有最高相似度的菌株信息

因此鉴定菌株JK6基因组上含有脂肽类抗生素surfactin，fengycin，iturin的合成功能基 因以及yndj假定蛋白基因。

实施例15 JK6菌功能基因在番茄盆栽土壤中表达的制备方法及拷贝数

1)以分别含有功能基因(yndJ、srfAB、fenD、ituC)的重组质粒载体为模板，测定其DNA 浓度并换算成拷贝数，绘制标准曲线；用Power soil试剂盒提取番茄盆栽不同处理土壤的总 DNA；将供试土壤总DNA和获得的重组质粒DNA为模板，进行RT-PCR分析；

2)其RT-PCR扩增体系为20μL：DNA模板1μL；上、下引物各1μL；SYBR Premix Ex-Taq (DBI)10μL，水7μL。

3)其RT-PCR扩增条件如下：

Cycle1：95℃，2min；

Cycle2×40(Real time)：step1:95℃15s，step2:60℃20s；

Cycle3(Melt Curve)：95℃1min，60℃1min，95℃20s。

4)其RT-PCR扩增的引物为：ituC为：ITUC-F：GCCTCCTGCTCATTGTCCTT，ITUC-R： GACGGCGTATCGTGGAGAAT，其它功能基因RT-PCR采用的引物同菌株DNA功能基因普 通PCR的引物一致，如表7所示。

5)盆栽土壤中功能基因绝对定量的拷贝数结果，如表9：

表9 番茄盆栽土壤功能基因的拷贝数

结果表明施加了JK6菌株处理的土壤中，功能基因yndJ、srfAB、fenD、ituC的拷贝数 均显著高于对照组，有助于确证生防菌株JK6在土壤中产生实际的生防效果并揭示其生防机 制。

实施例16 含解淀粉芽孢杆菌JK6发酵液的制备方法

该发酵液的制备方法如下：

在超净工作台中把保存在斜面上的菌株接种到平板上活化培养，培养温度28～30℃，培 养18-36h；种子液培养：从平板上挑活化的菌落接入种子培养液中，30℃摇床培养1d，转 速150r/min，得到种子液；按5％接种量，将获得的种子液接入发酵培养基中，30℃摇床 培养2～4d，转速150r/min，得到解淀粉芽孢杆菌JK6的发酵液。

实施例17 JK6菌发酵液粗提物中脂肽类抗生素的分离鉴定及定量

取5mL发酵液在10000r/min下离心10min，除去菌体、取上清液，重复该步骤一次得 到无细胞上清液，加入活化的C18萃取柱中，用5mL高纯水洗涤2遍，再分别用1mL的 60％～100％的甲醇溶液萃取，再过0.22μm的滤膜，收集粗提物，送去中山大学测试中心测样， 经HPLC-ESI-MS系统分析鉴定其成分并进行定量分析。将surfactin标品与JK6样品一起经 HPLC分析得：JK6发酵液中surfactin产量为：64.24mg/L；其MS阴离子流图分析可知(图 14)，JK6样品中检测到m/z([M-H]^-)为992.7、1006.6、1020.6、1034.6的质谱峰，与脂肽物 质surfactin同系物的分子量相吻合，再结合JK6菌DNA的功能基因扩增结果，鉴定JK6菌 发酵液的抗菌物质中含有脂肽类抗生素surfactin，其产量为64.24mg/L。

实施例18 含解淀粉芽孢杆菌JK6发酵液

该发酵液中含解淀粉芽孢杆菌JK6为2×10⁸～2×10¹⁰cfu/mL。

其制备方法如下：

1)在超净工作台中把保存在斜面上的菌株接种到平板上活化培(培养基)养，培养温度 28～30℃，培养18-36h；

2)种子培养：从平板上挑活化的菌落接入种子培养液中，30℃摇床培养1d，转速150 r/min，得到种子液；

3)发酵培养：按5％-10％接种量，将获得的种子液接入发酵培养基中，30℃摇床培养 1d，转速150r/min，得到解淀粉芽孢杆菌JK6的发酵液。

其中：

种子培养时所用的培养基成分：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15～20 g/L，pH 6.8～7.2；

发酵培养时所用的培养基成分：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L， pH7.0～7.2。

本发明解淀粉芽孢杆菌JK6，从广州华南地区赤红壤中分离得到，还具有多种有益特性， 譬如其发酵液的主要成分surfactin，产量高达64.24mg/L，是目前认为较好的生物表面活性 剂，具有很强的乳化和发泡作用，可以破坏细胞膜，具有抗病毒、溶血、抗支原体和抗细菌 的作用，可以协助其他脂肽抗生素如iturin、fengycin等拮抗真菌，能在植物根部形成一层生 物膜(Biofilm)保护植物根部免受病原菌的入侵，对芽孢杆菌的繁殖和定殖起到重要作用。 此外，JK6菌还产生其他抗菌和促生物质，如铁载体、生物膜、蛋白酶、过氧化氢酶、纤维 素酶和IAA等。综合而言，JK6显示了其巨大的生防和促生潜力。