一株产L-赖氨酸的菌株及其生产L-赖氨酸的方法

摘要

本发明涉及一株产L-赖氨酸的菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌ZY0217（Escherichia coliZY0217），保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号：CCTCC NO：M 2015079。本发明还提供该菌株的诱变筛选方法及利用该菌株生产L-赖氨酸的方法。大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ZY0217菌株连续传代7次后发酵液中L-赖氨酸含量为70g/L左右，无显著变化，遗传稳定性好。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株产L-赖氨酸的菌株及其生产L-赖 氨酸的方法。

背景技术

L-赖氨酸(L-Lysine，Lys)是生物体维持生命活动的必需氨基酸之一，是世 界上仅次于味精的第二大氨基酸品种，也是生物基尼龙等新型材料的重要前体。 L-赖氨酸的生产方法包括抽提法、化学合成/酶法和微生物发酵法。微生物发酵 法是目前工业生产赖氨酸的最重要方法，发酵原料广泛易得且价格便宜，如淀粉 (木薯淀粉、玉米淀粉等)、糖蜜(甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜等)。

微生物发酵法是通过代谢控制发酵，人为地控制或改变微生物的代谢途径来 实现L-赖氨酸的生产。离子束生物工程技术作为一种全新的诱变育种技术已广 泛地应用于生物诱变育种方面。低能氮离子作用于微生物时，能够使微生物细胞 壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢 网络显著变化，最终导致微生物产生突变。此诱变技术已分别应用于谷氨酸、 L-乳酸等生产菌株选育，使得谷氨酸、L-乳酸分别提高35％、46％。

发明内容

本发明的第一目的是提供了一种能够简单、高效、安全生产L-赖氨酸的菌 株。

本发明第二目的是提供一种上述菌株的获取方法。

本发明第三目的是提供一种利用上述菌株生产L-赖氨酸的方法。

为了实现本发明的第一目的，本发明采用的技术方案如下：

一种生产L-赖氨酸的菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌ZY0217(Escherichia  coli ZY0217)，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO： M 2015079。

本发明菌株的形态学及生理生化特征如下：

菌落颜色：灰白色。

需氧方式：好氧生长。

菌落大小：0.2～0.9×1～5μm。

适宜生长温度：34-40℃。

适宜生长pH：6.5-7.2。

菌体形态：圆形菌落，有金属光泽。

革兰氏染色：阴性。

上述大肠埃希氏菌ZY0217的获取方法，是以E.coli A301为出发菌株，通 过紫外-氯化锂复合诱变，低能离子注入诱变，初、复筛而得到。

具体地说，所述大肠埃希氏菌ZY0217的获取方法包括如下步骤：

1)菌悬液制备

E.coli A301与添加氯化锂的无菌水混合制成菌悬液，细菌浓度为10⁶个/mL；

2)紫外-氯化锂复合诱变

将步骤1)的菌悬液转入含有磁力转子的无菌空平板中，在搅拌速率50-100 rpm下，进行紫外照射诱变，后取菌悬液涂布于添加氯化锂的LB平板培养基中， 在34-40℃下避光倒置培养1-2d；

3)低能离子注入诱变

将步骤2)中培养后的菌株洗涤，并制成菌悬液涂布于无菌空平皿上，吹干 后，进行氮离子注入，后洗脱、涂布到LB平板培养基上，在34-40℃下避光倒 置培养1-2d；

4)初筛

挑取步骤3)培养得到的单菌落，接种至斜面培养基上活化，在34-40℃下 倒置培养1-2d后，移至种子培养基中搅拌培养7-10h；

将若干培养好的菌落按一定接种量分别接种到1L发酵罐中，同时通入空气， 搅拌发酵24-62h，检测发酵液中L-赖氨酸含量，初筛出L-赖氨酸含量大于65g/L 的菌落；

发酵过程中，采用氨水、2mol/L盐酸控制发酵液pH；

5)复筛

将步骤4)初筛得到的单菌落接种至斜面培养基上活化，在34-40℃下倒置 培养1-2d后，移至种子培养基中搅拌培养7-10h；

将若干培养好的菌落按一定接种量分别接种到5L发酵罐中，同时通入空气， 搅拌发酵48-120h；检测发酵液中L-赖氨酸含量，筛选出L-赖氨酸产量高的菌 落；

重复步骤1)至步骤5)，最终筛选出发酵液中L-赖氨酸含量为70g/L及以 上的目标菌株大肠杆菌ZY0217。

上述大肠杆菌ZY0217的获取方法中，所述步骤1)中氯化锂的添加量为无 菌水质量的2-4％，优选2.5％；

所述步骤2)中氯化锂的添加量为LB平板培养基质量的2-4％，优选2.5％； 所述紫外照射条件：30W紫外灯；照射距离25cm；照射时间10-90s，优选30s；

所述步骤3)中低能氮离子注入条件：2-4Kv/cm×2-5min(在电场强度为2-4 Kv/cm的条件下，诱变2-5min)，优选为：4Kv/cm×3min；注入剂量为 15×10¹⁴-20×10¹⁴ions/cm²；优选15×10¹⁴ions/cm²。

所述步骤4)和5)中，种子培养中搅拌速度为150-250rpm；接种量为 1-5％(v/v)；发酵中搅拌速度为200-900rpm。

本发明中，所述LB培养基，包含如下质量百分数组分：胰蛋白胨1％、酵 母提取物0.5％、氯化钠1％，其余为水，pH 6.8-7.2。

所述种子培养基包含如下质量百分数组分：碳源0.1％-0.2％、氮源3％-8％、 无机盐0.5％-1.3％，其余为水，pH 6.8-7.2；其中，所述碳源为葡萄糖和/或蔗糖； 所述氮源为蛋白胨、酵母提取物或硫酸铵中的一种或几种混合；所述无机盐为钾 盐、镁盐、铁盐、锰盐、钠盐或钙盐中的一种或几种混合；优选种子培养基，由 如下质量百分数组分组成：葡萄糖0.05％、蔗糖0.15％、蛋白胨3％、酵母提取 物3％、硫酸铵2％、磷酸氢二钾0.3％、硫酸镁0.1％、硫酸亚铁0.05％、硫酸锰 0.03％、磷酸二氢钠0.25％、碳酸钙0.17％，其余为水，pH 6.8-7.2。

所述发酵罐中的发酵培养基包含如下质量百分数组分：

碳源1.0％-2％，氮源0.5％-2％，无机盐0.1％-1％，其余为水，pH 6.8-7.2； 其中，所述碳源为葡萄糖和/或蔗糖；所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、 酵母提取物或硫酸铵中的一种或几种混合；所述无机盐为钾盐、镁盐、铁盐、锰 盐、钠盐或钙盐中的一种或几种混合。

优选发酵培养基，由如下质量百分数组分组成：葡萄糖0.5％、蔗糖0.3％、 玉米浆0.4％、花生饼粉0.4％、黄豆饼粉0.4％、硫酸铵0.2％、磷酸氢二钾0.08％、 硫酸镁0.02％、硫酸亚铁0.04％、硫酸锰0.05％、磷酸二氢钠0.15％、碳酸钙0.13％， 其余为水，pH 6.8-7.2。发酵过程采用氨水、2mol/L盐酸控制发酵液pH。

一种利用大肠杆菌ZY0217生产L-赖氨酸的方法，包括如下步骤：

1)斜面培养

将ZY0217接种于斜面培养基中，培养温度34-40℃，培养时间1-2d；

2)种子培养

将步骤1)斜面培养的菌株ZY0217接种于种子培养基中，培养温度为34-40 ℃，搅拌培养7-10h；

3)发酵培养

将步骤2)培养后的菌株ZY0217接种到发酵培养基中，培养温度为34-40℃； 同时通入空气，搅拌发酵24-62h。

在利用菌株ZY0217生产L-赖氨酸的方法中，所述斜面培养基为LB培养基， 具体配方同上。

所述步骤2)中，搅拌速度为150-250rpm；种子培养基配方同上。

所述步骤3)中，搅拌速度为200-900rpm；接种量为1-5％(v/v)；发酵培养 基配方同上。

作为本发明大肠杆菌ZY0217生产L-赖氨酸的一个优选实施方式，所述斜面 培养基的配方：LB培养基，质量百分数组分为：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、 氯化钠1％，其余为水，pH 6.8-7.2；

所述种子培养基的配方：蔗糖0.2％、蛋白胨2％、硫酸铵2％、酵母提取物 1％、磷酸氢二钾0.4％、硫酸镁0.3％、硫酸亚铁0.02％、硫酸锰0.07％，其余为 水，pH 6.8-7.2；

所述发酵培养基的配方：

葡萄糖1.5％、玉米浆0.5％、硫酸铵0.5％、磷酸氢二钾0.05％、硫酸锰0.02％、 硫酸亚铁0.04％、硫酸镁0.05％，其余为水，pH 6.8-7.2。

本发明有益效果：

本发明采用将低能氮离子注入和紫外-氯化锂复合诱变相结合，最终筛选获 得一株生产L-赖氨酸的大肠杆菌ZY0217，菌株连续传代7次后发酵液中L-赖氨 酸含量为70g/L左右，无显著变化，遗传稳定性好；利用该菌株生产L-赖氨酸， 可较大幅度提高发酵产物中L-赖氨酸含量。

附图说明

图1为大肠杆菌ZY0217的诱变筛选流程图。

本发明所述的生物材料，其分类命名为大肠埃希氏菌ZY0217(Escherichia  coliZY0217)，于2015年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC， 地址是：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号：CCTCC NO：M 2015079。

具体实施方式

下面列举实施例对本发明进行进一步说明，但并不因此限制本发明的内容。

实施例1：本实施例说明将E.coli A301作为出发菌株诱变筛选大肠杆菌ZY0217 的方法。

本实施例中：

1)LB培养基，由如下质量百分数组分组成：胰蛋白胨1％、酵母提取物 0.5％、氯化钠1％，其余为水，pH 6.8-7.2。

2)种子培养基，由如下质量百分数组分组成：葡萄糖0.05％、蔗糖0.15％、 蛋白胨3％、酵母提取物3％、硫酸铵2％、磷酸氢二钾0.3％、硫酸镁0.1％、硫 酸亚铁0.05％、硫酸锰0.03％、磷酸二氢钠0.25％、碳酸钙0.17％，其余为水， pH 6.8-7.2。

3)发酵培养基，由如下质量百分数组分组成：葡萄糖1％、蔗糖1％、玉米 浆1％、花生饼粉0.4％、黄豆饼粉0.4％、硫酸铵0.2％、磷酸氢二钾0.08％、硫 酸镁0.02％、硫酸亚铁0.04％、硫酸锰0.05％、磷酸二氢钠0.15％、碳酸钙0.13％， 其余为水，pH 6.8-7.2。发酵过程采用氨水、2mol/L盐酸控制发酵液pH。

以重组大肠杆菌E.coli A301(陈可泉等，氮源对重组大肠杆菌发酵产L-精氨 酸的影响，生物加工过程，2011年11月第9卷第6期，P11-14)为出发菌株。该 出发菌株系申请人拥有的在先公开文献公开的菌株，由申请人自行保藏，申请人 在此声明从本专利申请日起免费向公众发送该出发菌株。

如图1所示，获取大肠杆菌ZY0217的具体步骤如下：

1)菌悬液制备

取37℃恒温培养1d的E.coli A301新鲜斜面，加无菌水15mL，刮洗下菌 株并转入带有玻璃珠的250mL三角瓶内，向三角瓶中加入含2％氯化锂的无菌 水制成菌悬液，调整细菌浓度在10⁶个/mL；

2)紫外-氯化锂复合诱变

取15mL步骤1)的菌悬液，转入含有磁力转子的无菌空平板中，在50rpm 搅拌速度下，置于30W紫外灯下25cm处进行紫外照射诱变，照射时间为10s， 诱变结束后取菌悬液涂布于含2.5％氯化锂的LB平板培养基中，在37℃下避光 倒置培养1d；

3)低能离子注入诱变

用无菌水洗涤步骤2)中培养后的大肠杆菌2次，并制成菌悬液，取0.1mL 菌悬液均匀涂布于无菌空平皿上，以无菌风吹干，在3Kv/cm×2min，注入剂量 为20×10¹⁴ions/cm²条件下对大肠杆菌进行氮离子注入，离子注入完毕后，取出 平皿，在无菌条件下用1mL无菌水洗脱，涂布到LB平板培养基上，37℃下避 光倒置培养1d；

4)初筛

将步骤3)诱变得到的若干单菌落接种至斜面培养基上活化，在37℃下倒置 培养1d后，用接种环分别挑取一环活化菌株至其种子培养基中，搅拌速度150 rpm，培养10h后，再按1％(v/v)的接种量接入到1L发酵罐中的发酵培养基中， 同时通入空气，搅拌速度200rpm，发酵60h。检测发酵液中L-赖氨酸含量，初 筛出发酵液中L-赖氨酸含量大于65g/L的单菌落。

5)复筛

将步骤4)初筛的单菌落接种至斜面培养基上活化，在37℃下倒置培养1d 后，用接种环挑取一环活化菌株至种子培养基中，搅拌速度200rpm，培养10h 后，按5％(v/v)的接种量接入到5L发酵罐中的发酵培养基中，同时通入空气， 搅拌速度900rpm，发酵62h；检测发酵液中L-赖氨酸含量，复筛出发酵液中 L-赖氨酸含量高的单菌落。

再将步骤5)复筛得到的单菌落配制成菌悬液，重复步骤1)至步骤5)，当 SBA-40E生物传感仪测定发酵液中L-赖氨酸含量为70g/L及以上时，所对应的 菌株为目标菌株大肠杆菌ZY0217。

实施例2

按照实施例1的诱变筛选方法获取大肠杆菌ZY0217。

其中，氯化锂添加量为LB平板培养基质量的2％；紫外照射时间为90s；低 能氮离子注入条件为4Kv/cm×5min，注入剂量为15×10¹⁴ions/cm²_.。

实施例3

按照实施例1的诱变筛选方法获取大肠杆菌ZY0217。

其中，氯化锂添加量为LB平板培养基质量的2.5％；紫外照射时间为10s； 低能氮离子注入条件为42Kv/cm×4min，注入剂量为20×10¹⁴ions/cm²_.。

上述实施例1-3获得的大肠杆菌NT 1003的形态学及生理生化特征如下：

菌落颜色：灰白色。

需氧方式：好氧生长。

菌落大小：0.2～0.9×1～5μm

适宜生长温度：34-40℃。

适宜生长pH：6.5-7.2。

菌体形态：圆形菌落，有金属光泽。

革兰氏染色：阴性。

实施例1-3的大肠杆菌ZY0217的遗传稳定性测试

在以葡萄糖和蔗糖为碳源的发酵培养基中，检测实施例1-3获取的突变株大 肠杆菌ZY0217的遗传稳定性，菌株传代发酵试验结果如表1所示。发酵液中 L-赖氨酸含量由SBA-40E生物传感仪测定。

表1大肠杆菌ZY0217的遗传稳定性试验

从实验结果可以看出，经过7次传代，突变株大肠杆菌ZY0217的L-赖氨酸 产量稳定，具有较好的遗传稳定性。

实施例4：本实施例说明大肠杆菌ZY0217生产L-赖氨酸的方法

本实施例所用的培养基配方：

斜面培养基：LB培养基，质量百分数组分为：胰蛋白胨1％、酵母提取物 0.5％、氯化钠1％，其余为水，pH 6.8-7.2。

种子培养基：葡萄糖0.1％、蔗糖0.1％、蛋白胨2％、硫酸铵1％、磷酸氢二 钾0.3％、硫酸镁0.03％、硫酸亚铁0.05％、硫酸锰0.02％、磷酸二氢钠0.05％、 碳酸钙0.05％，其余为水，pH 6.8-7.2。

发酵培养基：葡萄糖1.5％、蔗糖0.5％、酵母提取物0.5％、硫酸铵1％，磷 酸二氢钾0.05％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.02％、氯化钠0.01％，其余为水，pH  6.8-7.2。

1)斜面培养

将实施例1获取的大肠杆菌ZY0217接种于斜面培养基中，在34℃条件下 活化1d；

2)种子培养

将步骤2)斜面培养的菌株ZY0217接种于种子培养基中，500mL三角瓶中 装液量为20mL，培养温度为37℃，250rpm摇床转速下培养10h；

3)发酵培养

将步骤2)种子培养的菌株ZY0217接种到发酵培养基中，接种量为5％(v/v)， 5L发酵罐中装液量为2L，培养温度为34℃，同时通入空气，以保持发酵体系 中适宜的溶氧环境，搅拌速度在900rpm，发酵过程采用氨水、2mol/L盐酸控制 发酵液pH，发酵时间为62h。经SBA-40E型生物传感仪测得发酵液中L-赖氨酸 含量为73g/L。

实施例5：本实施例说明大肠杆菌ZY0217生产L-赖氨酸的方法

本实施例所用的培养基配方：

斜面培养基：LB培养基，质量百分数组分为：胰蛋白胨1％、酵母提取物 0.5％、氯化钠1％，其余为水，pH 6.8-7.2。

所述种子培养基的配方：蔗糖0.2％、蛋白胨2％、硫酸铵2％、酵母提取物 1％、磷酸氢二钾0.6％、硫酸镁0.41％、硫酸亚铁0.02％、硫酸锰0.06％，其余 为水，pH 6.8-7.2；

所述发酵培养基的配方：葡萄糖1.5％、玉米浆0.5％、硫酸铵0.5％、磷酸氢 二钾0.05％、硫酸锰0.02％、硫酸亚铁0.04％、硫酸镁0.05％，其余为水，pH  6.8-7.2。

1)斜面培养

将实施例1获取的大肠杆菌ZY0217接种于斜面培养基中，在40℃条件下 活化1d；

2)种子培养

将步骤2)斜面培养的菌株ZY0217接种于种子培养基中，500mL三角瓶中 装液量为20mL，培养温度为37℃，250rpm摇床转速下培养10h；

3)发酵培养

将步骤2)种子培养的菌株ZY0217接种到发酵培养基中，接种量为5％(v/v)， 5L发酵罐中装液量为2L，培养温度为34℃，同时通入空气，以保持发酵体系 中适宜的溶氧环境，搅拌速度在900rpm，发酵过程采用氨水、2mol/L盐酸控制 发酵液pH，发酵时间为50h。经SBA-40E型生物传感仪测得发酵液中L-赖氨酸 含量为68g/L。

实施例6：本实施例说明大肠杆菌ZY0217生产L-赖氨酸的方法

斜面培养基：LB培养基，质量百分数组分为：胰蛋白胨1％、酵母提取物 0.5％、氯化钠1％，其余为水，pH 6.8-7.2。

种子培养基：葡萄糖0.1％、蛋白胨4％、硫酸铵4％、磷酸氢二钾0.3％、硫 酸镁0.3％、硫酸亚铁0.2％、硫酸锰0.2％、磷酸二氢钠0.1％、碳酸钙0.2％，其 余为水，pH 6.8-7.2。

发酵培养基：葡萄糖0.5％、蔗糖0.5％、酵母提取物1％、硫酸铵1％，磷酸 二氢钾0.5％、硫酸锰0.2％、硫酸镁0.2％、氯化钠0.1％，其余为水，pH 6.8-7.2。

1)斜面培养

将实施例1获取的大肠杆菌ZY0217接种于斜面培养基中，在34℃条件下 活化2d；

2)种子培养

将步骤2)斜面培养的菌株ZY0217接种于种子培养基中，500mL三角瓶中 装液量为20mL，培养温度为34℃，150rpm摇床转速下培养7h；

3)发酵培养

将步骤2)种子培养的菌株ZY0217接种到发酵培养基中，接种量为5％(v/v)， 5L发酵罐中装液量为2L，培养温度为37℃，同时通入空气，以保持发酵体系 中适宜的溶氧环境，搅拌速度在200rpm，发酵过程采用氨水、2mol/L盐酸控制 发酵液pH，发酵时间为62h。经SBA-40E型生物传感仪测得发酵液中L-赖氨酸 含量为73g/L。

实施例7：本实施例说明大肠杆菌ZY0217生产L-赖氨酸的方法

斜面培养基：LB培养基，质量百分数组分为：胰蛋白胨1％、酵母提取物 0.5％、氯化钠1％，其余为水，pH 6.8-7.2。

种子培养基：葡萄糖0.1％、蔗糖0.1％、蛋白胨2％、硫酸铵1％、磷酸氢二 钾0.2％、硫酸镁0.03％、硫酸亚铁0.15％、硫酸锰0.02％、磷酸二氢钠0.05％、 碳酸钙0.05％，其余为水，pH 6.8-7.2。

发酵培养基：葡萄糖1.5％、蔗糖0.5％、酵母提取物0.5％、硫酸铵1％，磷 酸二氢钾0.05％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.02％、氯化钠0.01％，其余为水，pH  6.8-7.2。

1)斜面培养

将实施例1获取的大肠杆菌ZY0217接种于斜面培养基中，在40℃条件下活 化1d；

2)种子培养

将步骤2)斜面培养的菌株ZY0217接种于种子培养基中，500mL三角瓶中 装液量为20mL，培养温度为40℃，250rpm摇床转速下培养10h；

3)发酵培养

将步骤2)种子培养的菌株ZY0217接种到发酵培养基中，接种量为5％(v/v)， 5L发酵罐中装液量为2L，培养温度为34℃，同时通入空气，以保持发酵体系 中适宜的溶氧环境，搅拌速度在900rpm，发酵过程采用氨水、2mol/L盐酸控制 发酵液pH，发酵时间为62h。经SBA-40E型生物传感仪测得发酵液中L-赖氨酸 含量为71g/L。

实施例8：本实施例说明大肠杆菌ZY0217生产优势

发明人前期以E.col iA301为出发菌株，筛选获得E.coli NT1003(陈可泉、 何珣、应晗笑、王震、袁佩佩、欧阳平凯.一株产L-赖氨酸的菌株及其生产L- 赖氨酸的方法.中国专利CN103361289B，申请日2013.07.08)。E.coli ZY0217 与E.coli NT1003的L-赖氨酸发酵性能比较见下表：

较E.coli NT1003，E.coli ZY0217的L-赖氨酸产量提高17.7％，发酵时间缩 短10h。