一株生物农药武夷菌素的高产菌株W-273及其应用

摘要

本发明公开了一株武夷菌素高产菌株及其应用。本发明所提供的武夷菌素高产菌株具体为不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)W-273，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.9604。发酵罐发酵培养该菌株，发现其产武夷菌素的量达到6500-7500μg/mL发酵液，较出发菌株CK-15提高了约132-317％，该菌株具有广阔工业应用的前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一株武夷菌素高产菌株及其应用。

背景技术

生物农药是农作物病虫害生物防治的重要手段，具有安全、高效和环境友好的特 点，其中农用抗生素在生物农药占重要的地位。武夷菌素是由不吸水链霉菌武夷变种 (Streptomyces anhygroscopicus var.wuyiensis)产生的一种高效、广谱、低毒、与环境 相容性好的农用抗生素，主要用于防治农作物真菌病害。2000年武夷菌素获得国家五 部委颁发的“国家重点新产品”证书(2000G041B326001)。2001年武夷菌素被列入 露地、保护地无公害番茄生产技术规程(农业行业标准NY/T5006-2001、 NY/T5074-2002)，全国多个省市(自治区)也将该技术列入无公害黄瓜、辣椒、草莓、 茄子生产技术规程。2009年武夷菌素又被列入蔬菜病虫害安全防治技术规范(国家标 准)，指定用于防治茄果类、瓜类、绿叶类蔬菜白粉病、灰霉病、叶霉病等多种病害。 2010年武夷菌素产品获得国家有机产品认证(COFCC-R-0903-0070)。目前，武夷菌素 的应用已经成为我国无公害蔬菜和有机蔬菜生产中防治病害的核心技术。

提高防病效果和降低生产成本是武夷菌素产业化生产和大面积推广面临的主要问 题。武夷菌素生产方法主要包括产生菌二级发酵培养、有效成分提取和产品加工三个 主要步骤，因此，筛选武夷菌素高产菌株，同时改进高产菌株的培养条件对于降低生 产成本起着重要作用。由于采用原来武夷菌素产生菌及培养基配方发酵生产武夷菌素 效价较低、生产成本高，严重影响武夷菌素的产业化生产。

因此，选育武夷菌素高产菌株W-273并改进该高产菌株培养条件，对于提高武夷 菌素产业化生产水平和增强产品在农业市场的竞争力具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株生物农药武夷菌素的高产菌株及其在发酵生产的应用。

本发明所提供的武夷菌素高产菌株，具体为不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces  ahygroscopicus var.wuyiensis)W-273。该菌株是从武夷菌素生物合成正调控基因wysR 过表达菌株的单菌落中筛选得到的新菌株，研究表明，W-273菌株在MS培养基上较 原始菌株CK-15生长迅速，产孢时间早且产孢量增加。该菌株已于2014年8月26日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北 京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC  No.9604。

本发明的再一个目的是提供一种菌剂。

本发明所提供的菌剂的活性成分为所述不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces  ahygroscopicus var.wuyiensis)W-273CGMCC No.9604。

所述不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)W-273 CGMCC No.9604或所述菌剂在制备武夷菌素中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的还一个目的是提供一种制备武夷菌素的方法。

本发明所提供的制备武夷菌素的方法，具体可包括如下步骤：发酵培养所述不吸 水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)W-273CGMCC No. 9604，收集发酵产物，获得武夷菌素。

在上述方法中，所述发酵培养的培养基的溶剂为水，溶质及其浓度为玉米粉30 mg/ml、黄豆粉20mg/ml、葡萄糖39mg/ml、氯化铵4mg/ml、碳酸钙2.65mg/ml、氯 化镁0.4mg/ml；pH6.89。

在上述方法中，所述发酵培养可为摇瓶发酵培养；所述摇瓶发酵培养的培养时间 可为48～72h(如60h)；所述摇瓶发酵培养的培养温度可为26～30℃(如28℃)；所述摇 瓶发酵培养的震荡转速可为180～220rpm(如220rpm)。

在上述方法中，所述发酵培养也可为发酵罐发酵培养；所述发酵罐发酵培养的培 养温度可为26～30℃(如28℃)；所述发酵罐发酵培养过程中的罐压可为0.02～0.10MPa (如0.05MPa)。所述发酵罐发酵培养过程中的搅拌转速可为50～300rpm(如220rpm)。

所述发酵罐发酵培养可为一级发酵或二级发酵；

当所述发酵罐发酵培养为一级发酵时，培养时间为45～100小时(如60小时)；

当所述发酵罐发酵培养为二级发酵时，两次发酵培养时间依次为16～45小时(如18 小时)、30～80小时(如60小时)。

本发明的又一个目的是提供所述菌剂的制备方法。

所述菌剂的制备方法，具体可包括如下步骤：将所述不吸水链霉菌武夷变种 (Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)W-273CGMCC No.9604作为活性成分， 得到所述菌剂。

所述不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)W-273 CGMCC No.9604的发酵液或所述发酵液的过滤液也属于本发明的保护范围。

本发明以不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) CK-15为出发菌株，对其进行代谢工程改造，筛选得到不吸水链霉菌武夷变种 (Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)W-273CGMCC No.9604。发酵罐发酵培 养该菌株，发现其产武夷菌素的量达到6500-7500μg/mL发酵液，较出发菌株CK-15 提高了约132-317％，该菌株具有广阔工业应用的前景。

保藏说明

菌种名称：不吸水链霉菌武夷变种

拉丁名：(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)

菌株编号：W-273

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2014年8月26日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.9604

附图说明

图1为高产菌株W-273和原始菌株CK-15在MS培养基培养不同天数观察结果。

图2为高产菌株W-273和原始菌株CK-15培养不同天数显微镜观察结果(100×)。

图3为高产菌株W-273和原始菌株CK-15培养不同天数显微镜观察结果(1000 ×)。

图4为高产菌株W-273和原始菌株CK-15孢子电镜扫描对比图。a(4.0k×)和 A(15.0k×)为高产菌株W-273；b(4.0k×)和B(15.0k×)为原始菌株CK-15。

图5为高产菌株W-273和原始菌株CK-15不同发酵时间菌丝体生长情况。

图6为高产菌株W-273和原始菌株CK-15不同发酵时间发酵液总糖含量。

图7为高产菌株W-273和原始菌株CK-15不同发酵时间发酵液效价。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)CK-15：记载 于“王万群，武夷菌素产生菌CK-15细菌人工染色体(BAC)文库构建，2008.6.1” 一文中。公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

深红酵母AS2.282(Rhodotorula rubra)：武夷菌素生物效价测定用指示菌，载于 “曾洪梅林德忻石义萍，农抗武夷菌素产生菌原生质体诱变育种.中国生物防治， 1996年01期，48-49.”一文中。

实施例1、不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) W-273的获得

一、武夷菌素过表达菌株群体的构建

从原始菌株不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) CK-15中得到一个武夷菌素生物合成正调控基因wysR，将该基因克隆至具有强启动子 P_SF14的pSETC载体上，转移至原始菌株CK-15中，构建了过表达菌株群体(具体参 见专利申请号为201310566436.2的中国专利申请)。

二、武夷菌素高产菌株的筛选

(1)培养过表达菌株单菌落：将步骤一构建的过表达菌株群体菌种菌液均匀涂布 于MS培养基平板上，28℃培养箱倒置培养，至单菌落产生灰色孢子。

(2)琼脂块法初筛：用打孔器打出单菌落琼脂块，挑取菌块放置于PDA平板上， 按一定距离摆放，有菌一面朝上，28℃恒温培养。挑选出抑菌圈直径明显较大的几株 菌株，用灭菌牙签挑孢子接种于MS平板上划线培养，准备进行摇瓶发酵复筛。

(3)摇瓶发酵复筛：待平板表面产生大量孢子时，将初筛得到的几个菌株进行发 酵培养，得到发酵液采用杯碟法对红酵母AS2.282抑菌效果测定，筛选得到几株最优 菌株。

(4)遗传稳定性实验：将经初筛和复筛选出的高产菌株，接种于MS平板培养基 上进行传代培养，传代培养5次，并对各代菌株进行摇瓶发酵实验，管碟法测效价， 分析比较菌株遗传稳定性，确定最优高产菌株。

最终获得一株可以稳定高产武夷菌素的不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces  ahygroscopicus var.wuyiensis)菌株，其编号为W-273。

该菌株已于2013年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC  No.9604。

实施例2、不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) W-273CGMCC No.9604的鉴定

一、生理形态特征鉴定

1、实验方法

将灭菌MS培养基熔化后倒入直径90mm培养皿中，尽量使培养基厚一些，划线 接种不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)W-273 CGMCC No.9604和原始菌株CK-15，将无菌盖玻片以45°角插入平板培养基，与划 线垂直，28℃恒温培养箱培养；光学显微镜镜检时用镊子小心拔出盖玻片，有菌的一 面朝下放在载玻片上直接观察即可；电子显微镜镜检时先将盖玻片放入2～4％戊二醛 固定液中固定1～2天，0.1M pH7.2PBS缓冲液洗，用1％OsO₄后固定1～2小时，再用 重蒸水冲洗30分钟，随后用30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％乙醇梯度脱 水，每级15～20分钟，样品脱水后用醋酸异戊酯处理，CO₂临界点干燥，干燥好的样 品粘贴在样品台上，用离子溅射仪表面喷金，喷金后样品在扫描电镜下扫描，拍照并 记录。每天取盖玻片在光学显微镜下观察菌丝和孢子生长情况，待产生大量孢子后再 电子显微镜下观察孢子形态。

2、结果

将实施例1获得的不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis)W-273CGMCC No.9604和原始菌株CK-15接种到改良MS培养基平板(配 方：MS培养基中添加2％黄豆饼汁，2％甘露醇，1.6％琼脂)上，观察生长状况(图1)， 及用插片法观察菌丝及孢子生长状况(见图2至图4)。可见，高产菌株W-273较原始 菌株CK-15菌株菌丝生长较快产孢量增加且产孢时间提前，高产菌株W-273生长3～4 天即可完成产孢，较原始菌株CK-15产孢时间提前了3～4天。高产菌株W-273孢子比 原始菌株CK-15孢子稍大，高产菌株孢子呈椭圆形或杆状，原始菌株孢子呈圆形。产 孢速率和产孢量的增加缩短了生长周期提高了产率，既可节省时间、增加产量又可节 约成本。

二、发酵产物效价及糖含量测定

1、实验方法

(1)菌丝体干重测量：采用纯液体发酵培养基(配方：葡萄糖20mg/ml，酵母 粉20mg/ml，氯化铵4mg/ml，硫酸镁0.4mg/ml)28℃摇床震荡培养，转速为220rpm/ 分钟，实施例1获得的不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis)W-273CGMCC No.9604和原始菌株CK-15发酵培养8、16、24、32、40、 48、56、64、72、80h后，发酵液用事先称好重量的滤纸过滤，过滤完后在80℃烘箱 烘干，称重，减去滤纸重量即为菌丝体干重。

(2)发酵液总糖含量测定：在液体发酵培养基(配方：葡萄糖20mg/ml，酵母粉 20mg/ml，氯化铵4mg/ml，硫酸镁0.4mg/ml)中接种实施例1获得的不吸水链霉菌 武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)W-273CGMCC No.9604和原始 菌株CK-15，28℃摇床震荡培养，转速为220rpm/分钟，发酵培养8、16、24、32、40、 48、56、64、72、80h后采用DNS法测定发酵液中总糖含量。具体如下：

a、先做葡萄糖溶液标准曲线

b、发酵液中总糖的水解：取发酵过滤液0.5mL置于50mL容量瓶中，加入6mol/L 的盐酸溶液2mL，在沸水浴中加热15min水解，冷水冷却后加入6mol/L的氢氧化钠 溶液1.8mL，并定容至50mL，得总糖水解液。

c、发酵液中总糖的测定：取总糖水解液2mL于25mL容量瓶中，加入DNS试剂 1.5mL沸水浴中加热5min，冷水冷却后定容至25mL摇匀，以空白作对照在520nm波 长测吸光值。以葡萄糖吸光值标准曲线为对照，计算发酵液中总糖含量。

(3)发酵液生物活性的测定：在发酵培养基(配方：玉米粉30mg/ml，黄豆饼 粉20mg/ml，葡萄糖20mg/ml，氯化铵4mg/ml，碳酸钙3mg/ml)中接种实施例1 获得的不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)W-273 CGMCC No.9604和原始菌株CK-15，28℃摇床震荡培养，转速为220rpm/分钟，发酵 培养24、32、40、48、56、64、72、80h后，以深红酵母AS2.282(Rhodotorula rubra) 为检测菌，马铃薯葡萄糖琼脂培养基为检测培养基，采用管碟法检测武夷菌素发酵液 效价。具体如下：

a、先做武夷菌素效价标准曲线

b、将深红酵母AS2.282接种于PDA斜面培养基，28℃恒温培养5天，待斜面上 均匀地长满一层菌后用100mL无菌水洗下菌苔，制成菌悬液备用；

c、将所得菌悬液以3％(体积比)接种量接种于冷却至约40℃的PDA培养基中， 混匀后将此含深红酵母AS2.282的PDA培养基按每皿12.5mL吸入直径为9cm的无菌 培养皿中；

d、待培养基凝固后在培养基表面对称放置4个牛津杯，其中两个对称的牛津杯中 加入已知浓度为40μg/ml的武夷菌素标准品260μL，用以校正待测样品的抑菌圈直径。 另外两个对称的牛津杯中加入经过稀释的各菌株发酵液260μL，28℃培养24h后用游 标卡尺测定抑菌圈直径。

e、将每个培养皿所测样品抑菌圈直径与40μg/ml的武夷菌素标准品的抑菌圈直径 值校正，实验重复3次，结果取平均值。

f、根据标准曲线得到样品稀释后的效价，此效价值再乘以相应的稀释倍数即得到 相应发酵液的效价。

2、结果

实施例1获得的不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis)W-273CGMCC No.9604和原始菌株CK-15发酵培养8、16、24、32、40、 48、56、64、72、80h后菌丝体干重见图5、发酵液总糖含量见图6、发酵液效价见图 7。可见，发酵过程中高产菌株W-273比原始菌株CK-15菌丝体增长迅速，糖消耗量 多，产抗生素时间提前，高产菌株W-273发酵液效价稳定在6500～7500μg/ml，高产菌 株W-273比原始菌株CK-15发酵过程中代谢旺盛。采用本高产菌株W-273进行发酵 能够使武夷菌素杀菌剂的产量提高2～3倍，缩短发酵生产时间5～10小时。

实施例3、不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) W-273CGMCC No.9604抑菌活性测定

供试菌株：不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) W-273CGMCC No.9604，以及作为转基因对照的专利申请号为201310566436.2的中 国专利申请中的wysR转基因菌株ooR7和ooR12，作为原始对照的不吸水链霉菌武夷 变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)CK-15。

一、供试菌株的发酵培养

取等量各供试菌株新鲜成熟的斜面孢子分别接种于100mL发酵培养基中，振荡培 养(28℃，220r/min)60h，过滤收集发酵液。

其中，发酵培养基配方如下：每100ml发酵培养基中含玉米粉3g，黄豆饼粉2g， 葡萄糖2g，硫酸铵400mg，碳酸钙300mg，pH约为7.0。

二、管碟法检测发酵液抑菌活性

将各供试菌株发酵液过滤后，用管碟法测发酵液抑菌活性。以可被武夷菌素抑制 生长的深红酵母AS2.282(Rhodotorula rubra)作为指示菌，从而检测各菌株发酵液的 抑菌活性。具体操作如下：

①将深红酵母AS2.282接种于PDA斜面培养基，28℃恒温培养5天，待斜面上 均匀地长满一层菌后用10mL无菌水洗下菌苔，制成菌悬液备用；

②将所得菌悬液以3％(体积比)接种量接种于冷却至约40℃的PDA培养基中， 混匀后将此含深红酵母AS2.282的PDA培养基按每皿12.5mL吸入直径为9cm的无菌 培养皿中，待培养基凝固后在培养基表面对称放置4个牛津杯；

③将待测的经过滤的各菌株发酵液260μL加入到牛津杯，28℃培养24h后用 游标卡尺测定抑菌圈直径。

实验重复3次，结果取平均值。

结果显示，不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) W-273CGMCC No.9604以及作为转基因对照的专利申请号为201310566436.2的中国 专利申请中的wysR转基因菌株ooR7和ooR12的抑菌圈均明显大于作为原始对照的不 吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)CK-15(P<0.01)； 而不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)W-273CGMCC  No.9604的抑菌圈明显大于作为转基因对照的专利申请号为201310566436.2的中国专 利申请中的wysR转基因菌株ooR7和ooR12(P<0.05)。各菌株发酵液的抑菌圈直径测 定结果具体见表1。

表1各菌株发酵液的抑菌圈直径测定结果(单位：cm)

  重复1 重复2 重复3 平均值 原始菌株CK-15 2.5 2.4 2.6 2.5 wysR转基因菌株ooR7 3.2 3.4 3.3 3.3 wysR转基因菌株ooR12 3.1 3.3 3.4 3.27

菌株W-273CGMCC No.9604 4.2 4.1 4.0 4.1

实施例4、发酵不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis)W-273CGMCC No.9604生产武夷菌素发酵培养基的优化

利用不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)W-273 CGMCC No.9604为生产菌株，采用Plackett-Burman设计法对武夷菌素生产配方中营 养因子包括葡萄糖、玉米粉、黄豆粉、氯化铵、碳酸钙、氯化镁共6种营养成分的主 效应进行考察，以筛选影响武夷菌素效价的关键因子；根据SAS软件中的响应面设计 模块程序，采用2因素5水平(共13组实验，见表2和表3)的中心组合设计法(Central  Composite Design,CCD)对关键因子进行优化。

表2中心组合设计各因子水平列表

表3中心组合设计及实验结果

根据实验所得数据进行二次多项式的回归拟和，预测武夷菌素产量的最大值及其 所对应的关键因子的浓度。以多元二次方程所预测的最佳培养基为发酵培养基并进行 多组发酵实验，确定优化的武夷菌素培养基配方。具体如下：以响应面模型预测的发 酵培养基进行验证实验，3次发酵武夷菌素效价分别为7118μg·mL^＿1、7235μg·mL ^＿1和7292μg·mL^＿1，平均值为7215μg·mL^＿1，与模型预测的最大值7182μg·mL^＿1之间拟合性良好，证明了模型的有效性，回归方程为武夷菌素发酵提供了一个合适的 模型。原始培养基(配方：玉米粉30mg/ml，黄豆饼粉20mg/ml，淀粉10mg/ml，葡 萄糖15mg/ml，氯化铵3mg/ml，碳酸钙3mg/ml)发酵后武夷菌素效价为5702μg·mL ^＿1，采用新发酵培养基较原始培养基武夷菌素效价提高1513μg·mL^＿1，提高率26.5％。 其中，发酵液中武夷菌素的效价测定方法参见实施例2步骤二进行。

结果显示，最终优化后的发酵培养基配方为：溶剂为水，溶质及其浓度为：玉米 粉30mg/ml，黄豆粉20mg/ml，葡萄糖39mg/ml，氯化铵4mg/ml，碳酸钙2.65mg/ml， 氯化镁0.4mg/ml；pH6.89。与传统的发酵培养基相比，主要营养成份减少，增加了 微量元素成份，总的成本降低。

实施例5、摇瓶发酵培养不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis)W-273CGMCC No.9604生产武夷菌素

供试菌株：不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) W-273CGMCC No.9604，以及作为转基因对照的专利申请号为201310566436.2的中 国专利申请中的wysR转基因菌株ooR7和ooR12，作为原始对照的不吸水链霉菌武夷 变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)CK-15。

一、各供试菌株的发酵培养

取等量各供试菌株新鲜成熟的斜面孢子分别接种于100mL实施例4优化后的发酵 培养基中，振荡培养(28℃，220r/min)60h，过滤后收集发酵滤液。

二、发酵液中武夷菌素含量的HPLC分析

采用型号为Agilend l 100的高效液相色谱仪进行HPLC分析各菌株发酵液中武夷 菌素的含量。具体如下：

1、标准曲线制作

取武夷菌素标准品，用纯水配制系列浓度的溶液。将系列浓度的武夷菌素标准品 溶液按照如下条件进行高效液相色谱检测。以武夷菌素标准品溶液的浓度为横坐标， 以峰面积为纵坐标，制作标准曲线。

其中，高效液相色谱条件如下：

色谱柱：ZORBAX SB-AQ(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：浓度为1.4g/L的 三氯乙酸水溶液；流速：1mL/min；柱温：25℃；检测波长：254nm；进样量20μL。

具体参见“王立东，张克诚，石义萍，崔增杰，高效液相色谱法测定发酵液中的 武夷菌素，农药，第47卷第11期，816-817，2008年11月”一文。

2、待测发酵液中的武夷菌素含量测定

将步骤一所得的各供试菌株发酵液也分别按照如上条件进行高效液相色谱检测， 将与武夷菌素标准品保留时间一致的色谱峰的峰面积代入步骤1所得标准曲线，从而 计算得到待测发酵液中的武夷菌素的含量。实验重复三次，结果取平均值。

3、结果

结果显示，不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) W-273CGMCC No.9604以及作为转基因对照的专利申请号为201310566436.2的中国 专利申请中的wysR转基因菌株ooR7和ooR12的发酵液中武夷菌素的含量均明显大于 作为原始对照的不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) CK-15(P<0.01)；而不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) W-273CGMCC No.9604的发酵液中武夷菌素的含量明显大于作为转基因对照的专利 申请号为201310566436.2的中国专利申请中的wysR转基因菌株ooR7和ooR12 (P<0.05)。各菌株发酵液中武夷菌素的含量的测定结果具体见表4。

表4各供试菌株摇瓶培养发酵液中武夷菌素含量的检测结果(单位：μg/ml)

  重复1 重复2 重复3 平均值 原始菌株CK-15 1680 1650 1540 1623.33 wysR转基因菌株ooR7 3280 3180 3140 3200 wysR转基因菌株ooR12 3360 3060 3150 3190 菌株W-273CGMCC No.9604 7118 7235 7292 7215

实施例6、发酵罐发酵培养不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus  var.wuyiensis)W-273CGMCC No.9604生产武夷菌素

供试菌株：不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) W-273CGMCC No.9604，以及作为原始对照的不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces  ahygroscopicus var.wuyiensis)CK-15和现有武夷菌素高产菌株F64CGMCC No.1967 (记载于CN 100545258C)。

一、供试菌株的发酵培养

本发明的发明人分别进行了一级发酵和二级发酵。

1、一级发酵

取供试菌株新鲜成熟的斜面孢子接种于500L发酵罐中发酵培养(温度28℃，罐 压0.05MPa，搅拌转速220rpm)60h。

2、二级发酵

取供试菌株新鲜成熟的斜面孢子接种于500mL种子罐中，发酵培养(温度28℃， 罐压0.05MPa，搅拌转速220rpm)18h后转入5m³发酵罐中继续发酵培养温度28℃， 罐压0.05MPa，搅拌转速220rpm)60h。

二、发酵液中武夷菌素含量的HPLC分析

参照实施例5步骤二进行。

结果显示，不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) W-273CGMCC No.9604在发酵罐一级发酵和二级发酵中均可产生大量的武夷菌素， 发现其产武夷菌素的量达到6500-7500μg/mL发酵液，较原始菌株CK-15提高了约 132-317％，较对照菌株F64提高了约30-87.5％。具体结果参见表5。

表5供试菌株在发酵罐一级发酵和二级发酵培养发酵液中武夷菌素含量的检测结果 (单位：μg/ml)

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

实施例7、武夷菌素田间用药的制备

收集不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)W-273 CGMCC No.9604的发酵液，过滤，滤液经减压浓缩2～3倍，浓缩温度60℃，得到的 武夷菌素含量为10000～15000μg/ml浓缩液，可用于田间蔬菜、果树和粮食作物的真菌 病害。