一种家蚕主要协助转运蛋白BmMFS及其融合表达和纯化方法

摘要

本发明公开了一种家蚕主要协助转运蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种家蚕主要协助转运蛋白BmMFS及其融合表达和纯化方法。

背景技术

膜蛋白在生物的生命活动中扮演重要角色，作为受体、转运蛋白和通道蛋白，参与细胞黏附、信号通路以及一系列的代谢途径。基因组研究表明，膜蛋白大约占基因产物的30%，其中半数以上可作为药物设计的靶点。在蛋白数据库已解析结构的蛋白中，膜蛋白只占到0.5%左右。膜蛋白天然含量低，疏水性极强，通常需要高浓度的洗涤剂才能溶于水。这对天然膜蛋白的分离纯化造成了很大的困难，导致后续的结晶和结构解析不能顺利进行。因此提高膜蛋白的表达量并且建立易于分离纯化的方法对于膜蛋白的研究至关重要。利用基因工程方法表达重组膜蛋白仍然是研究膜蛋白的另一条有效的途径。大肠杆菌是膜蛋白表达时最常用的表达宿主，但是仍然存在膜蛋白不表达或表达量极低的情况。

多角体蛋白是昆虫杆状病毒感染昆虫后晚期高效表达的一种结构蛋白，在大肠杆菌表达系统中表达的多角体蛋白是以包涵体的形式存在的，在pH10.8及以上的条件下溶解，具有和天然多角体蛋白晶体相同的特性。

发明内容

为了解决现有技术中已知膜蛋白数量少，分离纯化难等技术问题，本发明提供了一种家蚕主要协助转运蛋白BmMFS。

本发明还提供了上述家蚕主要协助转运蛋白BmMFS的融合表达及纯化方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种家蚕主要协助转运蛋白BmMFS，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

经家蚕蛋白库筛选，筛选出一条家蚕主要协助转运蛋白BmMFS，经TMHMM服务器http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM对该蛋白进行跨膜分析，得知此蛋白是含有六个跨膜区的膜蛋白。

上述家蚕主要协助转运蛋白BmMFS的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

上述家蚕主要协助转运蛋白BmMFS的融合表达和纯化方法，是将该蛋白的编码基因与核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的多角体片段Ph20编码基因融合，构建重组表达载体表达融合蛋白，融合蛋白纯化后经凝血酶酶切，获得BmMFS蛋白。

本发明将多角体的部分片段与膜蛋白融合表达，多角体的部分片段保持了多角体蛋白的部分特性，不用再和以前使用多角体蛋白一样必须反复调节pH值才能达到纯化的目的，大大简化了纯化步骤。

优选地，所述家蚕主要协助转运蛋白BmMFS的融合表达和纯化，具体步骤如下：

（1）设计合成引物，以cDNA为模板，PCR扩增家蚕主要协助转运蛋白BmMFS的编码基因；

（2）步骤（1）所得编码基因用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，酶切产物与同样经过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的载体pET-32a-Ph20连接，构建重组表达载体；所述pET-32a-Ph20为pET-32a载体和多角体片段Ph20编码基因同时经BamHI和EcoRI进行双酶切后再连接构建而成；

（3）重组表达载体转化宿主菌，培养诱导表达重组蛋白；

（4）步骤（3）的重组蛋白用pH值11.5的PBS搅拌溶解，再调节p H值调节至7.5~8.5，经镍离子亲和层析进行纯化。

（5）将纯化后的融合蛋白用凝血酶酶切即可得到BmMFS蛋白。

优选地，上述家蚕主要协助转运蛋白BmMFS的融合表达和纯化方法中，步骤（1）所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4~5所示。

优选地，上述家蚕主要协助转运蛋白BmMFS的融合表达和纯化方法中，步骤（2）所述连接使用的连接酶为TOYOBO公司的ligation high，连接反应时间为40min。

优选地，上述家蚕主要协助转运蛋白BmMFS的融合表达和纯化方法中，步骤（3）所述的宿主菌为Fermentas公司的产品E.coli Rosetta。

优选地，上述家蚕主要协助转运蛋白BmMFS的融合表达和纯化方法中，步骤（3）所述的培养诱导条件为：在含50μg /mL氨苄青霉素的LB培养基中37℃，220 rpm振荡培养至OD600=0.5，加入终浓度为1 mM 的IPTG，37℃，220 rpm诱导表达5h。

优选地，上述家蚕主要协助转运蛋白BmMFS的融合表达和纯化方法中，步骤（4）具体操作为：收集步骤（3）的培养物，经超声破碎菌体后离心，取沉淀用pH值11.5的PBS搅拌溶解，再将pH值调节至7.5~8.5，离心取上清，经0.45μm纤维素膜过滤后，加入镍离子亲和层析柱中，用20mM的咪唑水溶液洗脱杂蛋白，用浓度为200mM的咪唑水溶液洗脱获得目的重组蛋白。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

MFS蛋白是一种次级膜转运蛋白，转运底物的多样性使得其在细胞物质交换和能量代谢过程中起着重要作用。在最初发现时被认为只在糖类的吸收过程中起作用，随后发现该蛋白在药物外排系统、磷酸：Na⁺转运系统、有机磷：磷酸交换系统也发挥了重要作用。目前还没有该类蛋白在家蚕中表达及纯化的报道，本发明获得的家蚕主要协助转运蛋白BmMFS填补了这一空白。

本实验室研究发现，多角体蛋白自N端起的20个氨基酸残基的片段在大肠杆菌中依然保持了多角体晶体的特性，并且在pH值回调至8.0时融合蛋白依然存在于上清中，大大简化了纯化过程，提高了纯化效率。本发明利用Ph20与膜蛋白融合表达的方式获得融合蛋白，通过调节pH和镍离子亲和层析的方法即可获得纯度较高的重组蛋白，克服了天然膜蛋白表达量低、分离纯化难以及利用基因工程方法难表达跨膜区多的膜蛋白的问题。

附图说明

图1是本发明BmMFS基因的PCR扩增回收结果图；M：DNA Ladder Mix；1：第2次PCR扩增条带。

图2是本发明pET-32a-Ph20-BmMFS重组表达载体的PCR和双酶切鉴定图：M：DNA Ladder Mix；1：PCR的产物；2：双酶切的产物。

图3是本发明重组融合蛋白的表达图：M：蛋白分子量标准；1：pET-32a空载体诱导对照；2.pET-32a-BmMFS未诱导；3.pET-32a-BmMFS诱导；4.pET-32a-Ph20-BmMFS未诱导；5.pET-32a-Ph20-BmMFS诱导。

图4是本发明重组融合蛋白通过调节pH进行纯化的情况；M：蛋白分子量标准；1.超声后上清； 2.pH8.0上清； 3.pH8.0沉淀； 4.pH9.0上清； 5.pH9.0沉淀； 6.pH10.0上清； 7.pH10.0沉淀； 8.pH11.0上清 ；9.pH11.0沉淀； 10.pH11.5上清 ；11.pH11.5沉淀。

图5是本发明重组目的蛋白通过镍柱进一步纯化的结果。M：蛋白分子量标准；1:纯化后的融合蛋白。

图6 是本发明重组目的蛋白的Western blotting鉴定图；M：蛋白分子量标准；1：pET-32a空载诱导对照；2.pET-32a-BmMFS未诱导；3.pET-32a-BmMFS诱导 ；4.pET-32a-Ph20-BmMFS未诱导 ；5.pET-32a-Ph20-BmMFS诱导。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。实施例中如无特殊说明，均为本领域常规试剂及操作手段。

生物材料及试剂来源：

pET-32a载体、限制性内切酶EcoRⅠ和限制性内切酶XhoⅠ购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒购自康为世纪生物科技公司，氨苄青霉素购自上海恒远生物科技有限公司，LB培养基购自Oxoid公司，连接酶ligation high购自TOYOBO公司，E.coli TG1感受态细胞购自Fermentas公司，E.coli Rosetta购自Fermentas公司。

实施例1 家蚕主要协助转运蛋白BmMFS的制备

1. BmMFS的筛选

经本实验室家蚕蛋白库筛选，筛选出一条家蚕主要协助转运蛋白(BmMFS)，经TMHMM服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)对该蛋白进行跨膜区分析，发现此蛋白是含有六个跨膜区的膜蛋白(是为了预测BmMFS基因表达出的蛋白是一个六次跨膜蛋白)。

2. 扩增BmMFS的编码基因

（1）根据BmMFS的特性，设计引物F和R，以家蚕蚕蛹cDNA为模板，进行PCR，扩增BmMFS的编码基因。

F: 5'-GGAATTCATGAGACGCGACCCAGTT-3' (SEQ ID NO:4，下划线为 EcoRⅠ酶切位点)；

R: 5'-CCGCTCGAGTTACACAGATGGATCAAT-3' (SEQ ID NO:5，下划线为XhoⅠ酶切位点)。

反应体系总共50μL：10×Buffer 5 μL，dNTPs 2μL，引物F和R各2μL，cDNA 2 μL，Taq酶 2 μL，ddH₂O 35μL。

反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环30次；最后72℃延伸10min。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时割胶回收目的片段。

（2）以步骤（1）中回收产物为模板，用步骤（1）所设计引物F和R第2次扩增目的片段，具体程序同上；最后回收的片段如图1所示，说明BmMFS编码基因片段已成功获得。

（3）pET-32a-Ph20载体制备：将pET-32a载体（含有His标签）和多角体片段Ph20编码基因同时用BamHI和EcoRI进行双酶切，酶切产物分别进行电泳鉴定，然后割胶回收目的片段，用连接酶Ligation high进行连接，构建获得pET-32a-Ph20。

（4）将步骤（2）的PCR割胶回收产物和pET-32a-Ph20载体利用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ同时进行双酶切，将酶切回收的产物用连接酶ligation high进行室温连接40min，构建重组表达载体pET-32a-Ph20-BmMFS，并转化到E.coli TG1感受态细胞中；挑取单菌落摇菌培养后利用质粒提取试剂盒抽提质粒，用PCR和双酶切进行鉴定，挑选pET-32a-Ph20-BmMFS重组表达载体，将重组好的表达载体进行双酶切、PCR鉴定如图2所示，说明克隆成功，并送华大基因测序，其结果与预期相同。

（5）融合蛋白的表达：将步骤（4）重组好的表达载体pET-32a-Ph20-BmMFS转化至E.coli Rosetta中得到重组菌，在含50μg /mL氨苄青霉素的LB培养基中37℃，220 rpm振荡培养至OD600≈0.5，加入IPTG(终浓度 1 mM)，37℃，220rpm诱导培养5h。同时设置pET-32a空载体诱导、pET-32a-BmMFS未诱导、pET-32a-BmMFS诱导以及pET-32a-Ph20-BmMFS未诱导作为对照。

经诱导表达的菌液，取1.5mL，12000rpm离心后，将沉淀加入50μL 1×PBS重悬，然后取40μL，加入10μL 5×上样缓冲液，于100℃煮10min，然后在12000rpm下离心5min得到目的融合蛋白样品，取15μL进行12% SDS-PAGE，结果如图3，表明利用上述方法成功表达了融合蛋白。

将重组菌扩大培养，菌液经超声(超声的目的是为了让菌体破碎，释放出包裹在里面的蛋白)后离心，分别取上清和沉淀制备蛋白样品，进行12%SDS-PAGE，发现该重组目的蛋白是以包涵体的形式存在于上清中。

（6）融合蛋白的纯化：将步骤（5）收集的含有重组目的蛋白包涵体的上清溶于pH8.0的PBS中，4℃下搅拌3h，4℃，12000 rpm离心30 min，将上清和沉淀分别取样并进行SDS-PAGE分析。将上一步的沉淀继续溶于pH 9.0的PBS中，按照上述方式进行操作。依次继续将上一步所得沉淀溶于pH 10.0，pH 11.0，pH 11.5的PBS中，每一步均取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。

SDS-PAGE检测发现，重组融合蛋白大部分存在于pH 11.5 PBS溶液的上清中。将pH 4.0的PBS缓慢滴加到pH 11.5的上清液中，边加边搅拌，将溶液pH调至8.0左右，此时重组融合蛋白依然存在于上清中，结果如图4所示。

上清经0.45μm纤维素膜过滤后，加入镍离子亲和层析柱中，用20mM的咪唑水溶液洗脱杂蛋白，用浓度为200mM的咪唑水溶液洗脱重组融合蛋白。纯化后的蛋白进行12%SDS-PAGE，结果如图5所示，表明重组融合蛋白可以通过镍离子亲和层析柱进一步纯化即可得到纯度较高的目的融合蛋白。

（6）重组目的蛋白的鉴定

由于重组目的蛋白带有HIS标签，所以用HIS的抗体(二抗用辣根过氧化酶(HRP)标记羊抗鼠IgG，上海江莱生物科技有限公司 )作为一抗鉴定重组目的蛋白，如图6所示，结果表明重组目的蛋白已成功表达。重组目的蛋白经挖带进行质谱鉴定，其肽指纹图谱与家蚕蛋白库比对结果表明该蛋白为家蚕主要协助转运蛋白。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  天津耀宇生物技术有限公司

 

<120>  一种家蚕主要协助转运蛋白BmMFS及其融合表达和纯化方法

 

<130> 

 

<160>  5    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  297

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  1

 

Met Arg Arg Asp Pro Val Met Ala Ile Asp Ser Lys Ile Leu Glu Asn

1               5                   10                  15     

 

 

Asn Lys Ser Ala Asp Lys Ile Leu Asn Ser Ser Asp Leu Asn Gly Ser

            20                  25                  30         

 

 

Asn Ile Ile Ser His Ser Ile Lys Asn Asn Lys Lys Asp Gly Glu Asn

        35                  40                  45             

 

 

Glu Pro Lys Asp Asp Ser Glu Asn Trp Glu Gly Leu Gly Ile Leu Gln

    50                  55                  60                 

 

 

Lys Thr Arg Arg Met Ile Ser Leu Ile Thr Val Glu Pro Ile Leu Ala

65                  70                  75                  80 

 

 

Cys Tyr Val Met Pro Ser Val Leu Ala Ala Leu Ala Thr Gln Asn Leu

                85                  90                  95     

 

 

Tyr Leu Glu Lys Ala Cys Arg Val Asn Leu Arg Phe Glu His His Val

            100                 105                 110        

 

 

Cys Asp Ala Leu Thr Arg Arg Glu Thr Thr Asn Tyr Thr Phe Glu Glu

        115                 120                 125            

 

 

Glu Ala Val Gln Thr Leu Val Ala Ser Val Thr Gly Trp Lys Thr Val

    130                 135                 140                

 

 

Leu Gln Ser Phe Leu Pro Cys Phe Ile Leu Ile Phe Leu Gly Ala Tyr

145                 150                 155                 160

 

 

Ser Asp Arg Val Gly Gln Arg Lys Phe Cys Met Leu Leu Pro Ile Val

                165                 170                 175    

 

 

Gly Glu Phe Leu Thr Ser Ile Gly Leu Ile Val Asn Thr Tyr Phe Phe

            180                 185                 190        

 

 

Tyr Glu Leu Pro Val Glu Val Ala Ala Val Thr Glu Ala Ile Phe Pro

        195                 200                 205            

 

 

Ala Leu Thr Gly Gly Trp Phe Thr Met Phe Met Gly Val Phe Ser Tyr

    210                 215                 220                 

 

 

Ile Gly Asp Val Thr Thr Glu Glu Gln Arg Thr Leu Arg Ile Gly Ile

225                 230                 235                 240

 

 

Val Asn Leu Phe His Ser Val Gly Val Pro Val Gly Ala Ala Leu Ser

                245                 250                 255    

 

 

Gly Ile Leu Val Arg Lys Ile Gly Leu Tyr Gly Val Phe Ser Val Ser

            260                 265                 270        

 

 

Ala Thr Leu Tyr Ile Leu Ser Phe Met Tyr Gly Phe Phe Arg Ile Lys

        275                 280                 285            

 

 

Glu Val Lys Lys Ile Asp Pro Ser Val

    290                 295        

 

 

<210>  2

<211>  894

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

atgagacgcg acccagttat ggcgatcgat agcaaaattt tggaaaacaa caagtctgca     60

 

gataaaatac ttaatagcag tgacttaaat ggaagtaaca taattagtca tagtattaag    120

 

aacaacaaaa aagacgggga aaatgaaccc aaagatgatt ccgagaactg ggaagggctc    180

 

gggattttgc aaaaaacaag gcgtatgatt tctctaatta ctgttgaacc tattttggct    240

 

tgttacgtaa tgccatcggt attagccgca ttagccacac agaatctata tttagaaaaa    300

 

gcttgtcgag tcaatctgag gtttgaacac cacgtgtgtg atgcacttac gagacgagaa    360

 

acaacaaatt acactttcga agaagaagcc gtccaaacat tagtggcttc tgtaacaggc    420

 

tggaagactg ttctacaatc gttcttgcct tgcttcatat taatattcct cggagcgtac    480

 

agtgaccgag ttgggcaaag gaaattttgc atgctccttc caatcgtagg ggagttcctc    540

 

acaagcatcg gtctcattgt gaacacatac ttcttctacg agttgcccgt tgaggttgcg    600

 

gccgtgacag aagcaatatt ccccgcatta accggaggct ggttcacgat gtttatgggg    660

 

gtgtttagtt acattggtga cgttacgacc gaagaacaac ggactttaag gataggaatt    720

 

gtgaatttgt ttcattccgt gggagtacct gttggggctg cgctcagcgg gattttagtg    780

 

aggaaaatcg gattatacgg tgtgttttcc gttagtgcta ctttgtacat actaagcttc    840

 

atgtatggat tcttcaggat caaggaggtt aaaaaaattg atccatctgt gtaa          894

 

 

<210>  3

<211>  60

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

atgccgaatt attcatacac ccccaccatc gggcgtactt acgtgtacga caataaatat     60

 

 

<210>  4

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

ggaattcatg agacgcgacc cagtt                                           25

 

 

<210>  5

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

ccgctcgagt tacacagatg gatcaat                                         27