一种具有抗肿瘤活性的异恶唑羧酸类化合物及其合成方法

摘要

本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的异恶唑羧酸类化合物及其合成方法。该类化合物采用苯基异氰酸酯、乙酰乙酸乙酯及其衍生物、盐酸羟胺为原料，在甲苯作为溶剂下反应，合成了一类未见报道的异恶唑羧酸类化合物。该方法操作安全性高，反应条件温和，适用于工业化生产，经初步生物活性测试表明该类型化合物有较好的抗肿瘤活性，应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的异恶唑羧酸类化合物及其合成方法。

背景技术

肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病，抗肿瘤药物的作用机理以及药物的作用靶点是多种多样的，而由于肿瘤细胞易产生多药耐药往往导致治疗的失败。寻找有效安全、毒副作用小的抗肿瘤药物一直是肿瘤药物研发工作者孜孜以求的目标。

大量文献已证实异恶唑及其衍生物是一类重要的杂环化合物，不仅是有机合成中的重要合成子和中间体，同时还具有广谱药理活性和生物活性，其主要的药理活性有止痛、消炎、抗痨、抗惊厥、抗菌、抗神经兴奋和治疗阿尔茨海默病等。

异恶唑类化合物亦是含氧、氮杂环化合物生物活性研究的热点，受到化学家和药物学家的广泛关注。近年来不少药物学家将异恶唑环引入到目标化合物中来提高化合物的抗肿瘤活性，并取得了良好的效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的异恶唑羧酸类化合物及其合成方法。

本发明的实现过程如下：

结构通式（Ⅰ）所示化合物，

其中，R₁选自氢、硝基、烷氧基、卤素、苯基、取代苯基、低级烷基-环烷基、环烷基-低级烷基、取代或未取代的低级烷基或环烷基；

所述的低级烷基为C1～C10的烷基，所述取代的取代基为硝基、卤素、C1～C10的烷基或烷氧基。

上述R₁优选自氢、烷氧基、硝基、卤素、甲基。

结构通式（Ⅰ）所示化合物的合成方法，包括如下步骤，

（1）苯基异氰酸酯与乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸甲酯或乙酰乙酸异丙酯在80～120℃反应；

（2）然后加入盐酸羟胺，在80℃～120℃下反应；

（3）将步骤（2）反应所得的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，所得滤饼用冷水洗涤，得到异恶唑羧酸粗品。

上述步骤（1）在甲苯溶剂中反应，反应温度为80～120℃，优选为105～115℃，反应时间为2～2.5小时。

苯基异氰酸酯：乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸甲酯或乙酰乙酸异丙酯：盐酸羟胺的摩尔比为1:1:1～1:2.5:2.5，或为1:1:1.5～1:1.5:2，合成得到的异恶唑羧酸粗品使用乙醇进一步重结晶，可使用薄层色谱追踪，及时监测反应的进行程度。

上述步骤（2）反应温度为80～120℃，优选为105～115℃，反应时间为3～4小时。

结构通式（Ⅰ）所示化合物可用于制备治疗抗肿瘤活性药物。

本发明的优点及积极效果：

（1）操作安全性高，反应条件温和，适用于工业化生产，解决了现有技术产率低的问题；

（2）同时将羧基引入到异恶唑的化学结构中，可以提高其生物活性，改善其选择性，具有重要的理论价值和实际应用价值；

（3）用甲苯作为溶剂的条件下合成异恶唑羧酸类物质，甲苯与其他溶剂相比，收率高，且制备方法简便，易于工业化生产。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述,这些实施例仅是出于解释说明的目的，而不限制本发明的范围和实质。

本发明部分优选实施方案中的化合物结构式如下所示：

    

实施例1

5-((3-氟苯基)氨基)-3-甲基异恶唑-4-羧酸的制备

在反应器中加入1.37g(10 mmol)间氟苯异氰酸和1.56g(12mmol)乙酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上用电热套加热到110℃搅拌，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入1.04g(15mmol)盐酸羟胺继续回流反应3小时。将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后加水稀释，冷却至室温，然后过滤，用温水洗涤滤饼，得到5-((3-氟苯基)氨基)-3-甲基异恶唑-4-羧酸粗品。将该异恶唑羧酸粗品加入到反应器中，然后加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到得白色结晶性粉末（1.61克），总收率71.9%。

白结晶粉末，M.P.166.0℃；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.0(1H,s),10.3(1H,s). 7.76(1H.d),7.42(1H,d),7.19(1H,t),6.61(1H,d),2.35(3H.s);¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):169.5,163.8,158.9,144.2,131.2,113.6,110.7,104.7,100.4,13.5;HRMS(ESI)for(M+H)⁺:calcd：236.0595 found 236.0599。

实施例2

5-((4-氯苯基)氨基)-3-甲基异恶唑-4-羧酸的制备。

在反应器中加入1.53g(10 mmol)4-氯苯异氰酸酯和1.3g(10mmol)乙酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上用电热套加热到80℃搅拌，回流反应3小时。然后在该反应体系中加入1.04g(15mmol)盐酸羟胺继续回流反应6小时。将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后加水稀释，冷却至室温，然后过滤，用温水洗涤滤饼，得到5-((4-氯苯基)氨基)-3-甲基异恶唑-4-羧酸粗品。将5-((4-氯苯基)氨基)-3-甲基异恶唑-4-羧酸粗品加入到反应器中，然后加入30mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到得类白色结晶性粉末（1.82克），总收率75.8%。

类白色结晶粉末，M.P.192.3℃；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.0(1H,s), 9.8(1H,s)，7.68(2H,d),7.25(2H,d),2.37(3H.s);

¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):169.5,163.8,158.9,143.2,129.8,127.8,124.1,122.3,100.6,10.5;HRMS(ESI)for(M+H)⁺:Calcd:252.0301,found 252.0309。

实施例3

3-甲基-5(间-甲苯基氨基)异恶唑-4-羧酸的制备。

在反应器中加入1.33g(10 mmol)3-甲基苯异氰酸酯和1.3g(10mmol)乙酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上用电热套加热到120℃搅拌，回流反应1小时。然后在该反应体系中加入0.7g(10mmol)盐酸羟胺继续回流反应2小时。将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后加水稀释，冷却至室温，然后过滤，用温水洗涤滤饼，得到3-甲基-5(间-甲苯基氨基)异恶唑-4-羧酸粗品。将该异恶唑羧酸粗品加入到反应器中，然后加入30mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到得白色结晶性粉末（1.62克），总收率73.4%。

白色结晶粉末，M.P.171.5℃；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.0(1H,s),9.90(1H,s),7.45(2H,d),7.09(1H,t)，6.61(1H,d)，2.35(3H.s);¹³C-NMR(75MHz,DMSOd₆)δ(ppm):169.5,158.9,142.5,139.3,129.6,121.1,119.2,114.9,100.6,21.4,11.5;HRMS(ESI)for(M+H)+:Calcd:232.0846,found 232.0850。

实施例4

3-甲基-5-((3-硝基苯基)氨基)异恶唑-4-羧酸的制备。

在反应器中加入1.64g(10 mmol)3-硝基苯异氰酸酯和3.12g(24mmol)乙酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上用电热套加热到105℃搅拌，回流反应2.5小时。然后在该反应体系中加入1.73g(25mmol)盐酸羟胺继续回流反应4小时。将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后加水稀释，冷却至室温，然后过滤，用温水洗涤滤饼，得到3-甲基-5-((3-硝基苯基)氨基)异恶唑-4-羧酸粗品。将该异恶唑羧酸粗品加入到反应器中，然后加入乙醇30mL进行重结晶，过滤，干燥得到得棕色结晶性粉末（1.27克），总收率51.0%。

   

棕色结晶粉末，M.P.212.0℃。¹H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.0(1H,s),10.05(1H,s)，8.04(1H,d),7.8-7.4(3H,m),2.35(3H.s);13C-NMR(75MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):169.5,158.8,148.8,143.5,130.5,123.9,109.4,100.6,10.5;HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:263.0543,found 263.0539。

实施例5

 5-((3,4-二甲氧基苯基)氨基)-3-甲基异恶唑-4-羧酸的制备。

在反应器中加入1.79g(10 mmol)3,4-二甲氧基苯异氰酸酯和1.56g(12mmol)乙酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上用电热套加热到115℃搅拌，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入1.04g(15mmol)盐酸羟胺继续回流反应3小时。将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后加水稀释，冷却至室温，然后过滤，用温水洗涤滤饼，得到5-((3,4-二甲氧基苯基)氨基)-3-甲基异恶唑-4-羧酸粗品。将该异恶唑羧酸粗品加入到反应器中，然后加入乙醇30mL进行重结晶，过滤，干燥得到得白色结晶性粉末（1.72克），总收率65.3%。

白色结晶粉末，M.P.237.8℃；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.0(1H,s),10.2(1H,s),

7.13(1H,d),6.65(1H,d),6.08(1H,s),3.85(6H,s),2.35(3H,s);¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):169.5,158.9,150.8,139.9,135.8,114.2,112.9,106.1,100.6,56.3,13.5;HRMS(ESI)for(M+H)⁺:calcd:278.0902,found 278.0905。

实施例6

5-((3,4-二氯苯基)氨基)-3-甲基异恶唑-4-羧酸的制备。

在反应器中加入1.87g(10 mmol)3,4-二氯苯异氰酸酯和1.95g(15mmol)乙酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上用电热套加热到110℃搅拌，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入1.4g(20mmol)盐酸羟胺继续回流反应3小时。将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后加水稀释，冷却至室温，然后过滤，用温水洗涤滤饼，得到5-((3,4-二氯苯基)氨基)-3-甲基异恶唑-4-羧酸粗品。将该异恶唑羧酸粗品加入到反应器中，然后加入乙醇30mL进行重结晶，过滤，干燥得到得浅黄色结晶性粉末（1.31克），总收率48.3%。

 

浅黄色结晶粉末，M.P.206.2℃。¹H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.0(1H,s),9.85(1H,s)，7.56(1H,t),7.32(1H,d),6.76(1H,d),2.40(3H.s);¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):169.5,158.8,141.7,131.9,129.2,123.5,121.4,120.4,100.7,10.5;HRMS(ESI)for(M+H)⁺:calcd:285.9913,found 285.9917。

实施例7

5-((3,5-二甲氧基苯基)氨基)-3-甲基异恶唑-4-羧酸的制备。

在反应器中加入1.79g(10 mmol)3,5-二甲氧基苯异氰酸酯和1.56g(12mmol)乙酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上用电热套加热到110℃搅拌，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入1.04g(15mmol)盐酸羟胺继续回流反应3小时。将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后加水稀释，冷却至室温，然后过滤，用冷水洗涤滤饼，得到5-((3,5-二甲氧基苯基)氨基)-3-甲基异恶唑-4-羧酸粗品。将该异恶唑羧酸粗品加入到反应器中，然后加入乙醇30mL进行重结晶，过滤，干燥得到得白色结晶性粉末（1.63克），总收率61.6%。

 

白色结晶粉末，M.P.197.5℃。¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):11.0(1H,s),9.00(1H,s),

5.76(3H,m),3.85(6H,s),2.35(3H,s);¹³C-NMR(75MHz,DMSOd₆)δ(ppm):169.5,160.7,158.8,144.5,100.6,91.9,90.5,55.9,10.5;HRMS(ESI)for(M+H)⁺:calcd:278.0905,found 278.0902。

实施例8

5-((3,5-二氯苯基)氨基)-3-甲基异恶唑-4-羧酸的制备。

在反应器中加入1.87g(10 mmol)3,5-二氯苯异氰酸酯和1.56g(12mmol)乙酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上用电热套加热到110℃搅拌，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入1.04g(15mmol)盐酸羟胺继续回流反应3小时。将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后加水稀释，冷却至室温，然后过滤，用冷水洗涤滤饼，得到5-((3,5-二氯苯基)氨基)-3-甲基异恶唑-4-羧酸粗品。将该异恶唑羧酸粗品加入到反应器中，然后加入乙醇30mL进行重结晶，过滤，干燥得到得灰白色结晶性粉末（1.83克），总收率68.7%。

 

灰白色结晶性粉末，M.P.235.8℃；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):11.0(1H,s),

8.96(1H,s),7.06(1H,s),6.70(2H,s),2.35(3H,s);¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):169.5,158.9,145.4,129.9,119.4,114.9,100.6,10.5;HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:285.9911,found 285.9915。

实施例9

5-((3,5-二甲基苯基)氨基)-3-甲基异恶唑-4-羧酸的制备。

在反应器中加入1.47g(10 mmol)3,5-二甲基苯异氰酸酯和1.56g(12mmol)乙酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上用电热套加热到110℃搅拌，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入1.04g(15mmol)盐酸羟胺继续回流反应3小时。将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后加水稀释，冷却至室温，然后过滤，用冷水洗涤滤饼，得到5-((3,5-二甲基苯基)氨基)-3-甲基异恶唑-4-羧酸粗品。将该异恶唑羧酸粗品加入到反应器中，然后加入乙醇30mL进行重结晶，过滤，干燥得到得白色结晶性粉末（0.75克），总收率33.0%。

白色结晶粉末，M.P.198.4℃。¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):11.0(1H,s),9.90(1H,s),7.30(2H,s),6.73(1H,s),2.35(3H,s);¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):169.5,158.9,142.4,139.2,120.9,118.1,100.6,21.8,10.5;HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:246.1007,found 246.1010。

实施例10

 5-((4-甲氧基苯基)氨基)-3-甲基异恶唑-4-羧酸的制备。

在反应器中加入1.49g(10 mmol)4-甲氧基苯异氰酸酯和1.95g(12mmol)乙酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上用电热套加热到110℃搅拌，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入1.04g(15mmol)盐酸羟胺继续回流反应3小时。将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后加水稀释，冷却至室温，然后过滤，用冷水洗涤滤饼，得到5-((4-甲氧基苯基)氨基)-3-甲基异恶唑-4-羧酸粗品。将异恶唑羧酸粗品加入到反应器中，然后加入乙醇30mL进行重结晶，过滤，干燥得到得白色结晶性粉末（1.04克），总收率44.0%。

  

白色结晶粉末，M.P.194.0℃。¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):11.0(1H,s),9.90(1H,br),7.56(2H,d),7.04(2H,d),3.85(3H,s),2.35(3H,s);¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):169.5,158.9,153.5,137.3,121.8,115.3,100.6,55.9,11.0;HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:248.0796,found 248.0801。

实施例11

5-((3,4-二甲基苯基)氨基)-3-甲基异恶唑-4-羧酸的制备。

在反应器中加入1.47g(10 mmol) 3,4-二甲基苯异氰酸酯和1.56g(15mmol)乙酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上用电热套加热到110℃搅拌，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入1.04g(15mmol)盐酸羟胺继续回流反应3小时。将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后加水稀释，冷却至室温，然后过滤，用冷水洗涤滤饼，得到5-((3,4-二甲基苯基)氨基)-3-甲基异恶唑-4-羧酸粗品。将该异恶唑羧酸粗品加入到反应器中，然后加入乙醇30mL进行重结晶，过滤，干燥得到得灰色结晶性粉末（1.18克），总收率50.6%。

灰色结晶粉末，M.P.211.7℃。¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):11.0(1H,s),9.95(1H,s),7.50(1H,s),7.16(1H,d),6.87(1H,d),2.35(3H,s);¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):169.5,158.9,139.5,136.2,130.1,117.5,115.9,100.6,19.9,11.2;HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:246.1005,found 246.0998。

实施例12

3-甲基-5-((3,4,5-三氟苯基)氨基)-异恶唑-4-羧酸的制备

在反应器中加入1.73g(10 mmol)3,4,5-三氟苯异氰酸酯和1.95g(15mmol)乙酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上用电热套加热到110℃搅拌，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入1.04g(15mmol)盐酸羟胺继续回流反应3小时。将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后加水稀释，冷却至室温，然后过滤，用冷水洗涤滤饼，得到3-甲基-5-((3,4,5-三氟苯基)氨基)-异恶唑-4-羧酸粗品。将该异恶唑羧酸粗品加入到反应器中，然后加入乙醇30mL进行重结晶，过滤，干燥得到得红色结晶性粉末（1.62克），总收率62.5%。

红色结晶粉末，M.P.206.5℃。¹H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.0(1H,s),10.05(1H,s),6.34(2H,t),2.35(3H,s);¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):169.5,158.9,151.7,141.3,130.2,102.1,100.6,11.5;HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:272.0408,found 272.0412。

实施例13

本发明化合物的抗肿瘤活性测试

对本发明的化合物进行了肿瘤细胞增殖抑制试验，试验方法采用常规的MTT法。

细胞株选用：人胰腺癌SW-1990细胞，人膀胱癌T-24细胞,人乳腺癌MCF-7细胞,人肺癌A-549细胞,人肝癌HepG2细胞。培养液为DMEM+15%NBS+双抗。

样品液的配制：用DMSO(Merck)溶解后，加入PBS(-)配成的100 μmol/L的溶液或者均匀的混悬液，然后用DMSO的PBS(-)稀释，最终浓度分别为0.1，1，10，20，40，60，80, 100 μmol/L。将上市的抗肿瘤药物阿糖胞苷(Ara-C)以同样的条件配成对照品溶液。

细胞培养：贴壁生长肿瘤细胞细胞培养于含10% 灭活新生牛血清和青霉素、链霉素(各100万U/L)的1640培养液中，置于37℃，5% CO₂，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。细胞贴壁生长，每2～3 天传代1 次，传代时首先倒出培养液，PBS洗2次，胰酶消化后，加入新鲜的培养液吹打均匀，调整细胞至适当浓度移入新的培养瓶中，添加培养液至适量。取对数生长期细胞用于实验。

 MTT法检测细胞活性及IC50的测定：

实验原理：活细胞线粒体中脱氢酶能将黄色的MTT还原成不溶于水的蓝紫色产物甲臜(MTT formazan)，并沉积在细胞中，生成的量与活细胞数目成正比，而死细胞没有这种功能。DMSO能溶解蓝紫色结晶物，颜色深浅与所含的量成正比，因此用酶标仪测定的光吸收值可反映细胞存活率。

实验方法：取对数生长期细胞，消化、计数，以 2×104/mL 的密度接种于 96 孔培养板中，每孔100 μl。培养 24小时后，将待测化合物以0.1，1，10，20，40，60，80,100 μmol/L浓度处理细胞。实验组每个浓度设5个复孔，以含0.4% DMSO的培养液作对照。药物作用 48小时后，去上清，每孔加入100 μl MTT(2-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-3,5-二苯基-2H-四唑氢溴酸盐)(1mg/mL)，继续培养 4小时，弃上清，每孔加入100μl DMSO，振荡混匀，用酶标仪在570 nm处测定吸光度值，采用 IC₅₀ 计算软件求出半数抑制浓度(IC₅₀)。

试验结果详见表1，其中，样品是指相应实施例中制备的异恶唑羧酸类化合物，样品编号对应制备实施例中所得到的化合物的具体编号。

 化合物12、8在所测试的5种细胞株中均表现出了良好的抗肿瘤活性，化合物6、2次之，在不同的细胞株中也表现出了良好的抗肿瘤活性。以上实验结果表明，本发明的化合物具有良好的抗肿瘤活性，特别是部分异恶唑羧酸类化合物的活性在特定细胞株中抗肿瘤活性优于或接近于阿糖胞苷，因此本发明可以用于制备抗肿瘤药物。