一种银杏叶制备叶绿素铜钠盐的制备方法

摘要

本发明涉及一种银杏叶制备叶绿素铜钠盐的制备方法，主要歩骤是：提取及浓缩；皂化及铜代；碱性皂液下的6号溶剂油萃取除杂；脱银杏酸；成盐。本发明在用极性溶剂进行银杏黄酮浸提前或同时或后，以非极性溶剂为浸提溶剂进行叶绿素及其它油溶性物质的浸提；采用混合溶剂为溶媒进行皂化，有效避免了皂液中沉淀的存在与产生，从而使反应能够快速而完全地进行；采用碱性皂化及铜代同时进行的方法制备叶绿素铜钠盐，避免了酸化铜代时发生的叶绿素铜酸的酯化及变质。本发明所得产品吸光度比值＝3.2～3.6，络合铜>6％，氮含量>5.5％，银杏酸<50ppm。

说明书

技术领域

本发明涉及植物提取技术领域，尤其涉及一种快速、银杏酸含量低的银杏叶制备叶绿 素铜钠盐的制备方法。

背景技术

我国银杏叶资源丰富，但利用银杏叶进行综合开发的企业极少，大多仅利用来提取银 杏叶提取物，很少有企业对银杏叶中富含的其它物质加以综合利用。

巿场上销售的叶绿素铜钠盐，络合铜含量普遍<4.5％，按理论络合铜含量9％计算，其 叶绿素含量<50％，其它部分为有机酸钠盐。市售叶绿素铜钠盐大部分为蚕沙中提取制备，但 由于沙蚕中叶绿素需酸化铜代，而酸化铜代时叶绿素存在较多变质，形成一系列结构相近的 类叶绿素物质，反映在液相色谱上即为杂峰众多，叶绿素a铜钠盐及叶绿素b铜钠盐两大主 峰含量不突出，从而造成市售叶绿素铜钠盐的纯度普遍不高。

通过对烘干后银杏叶原料的液相分析得知，干银杏叶中几乎不含含镁叶绿素a，仅含 极少量含镁叶绿素b，而大部分以脱镁叶绿素的形式存在。这就说明以干银杏叶为原料制备 叶绿素铜钠盐不再需要酸化脱镁，且自然脱镁就反应条件而言最为温和，产生的叶绿素衍生 物最少。

中国专利CN102775414B公开了一种银杏叶下脚料制备叶绿素铜钠盐的工艺，主要步 骤为：(1)提取、浓缩；(2)皂化；(3)乙酸乙酯萃取除杂；(4)酸化铜代；(5)大孔树脂 除杂；(6)成盐。其不足之处在于：最后指标显示其络合铜含量较低；未指明银杏酸残留情 况。

发明内容

本发明的目的在于为了解决现有生产叶绿素铜钠盐产品成本较高、纯度较低的缺陷而 提供一种成本低、纯度高、方便快捷的银杏叶制备叶绿素铜钠盐的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种银杏叶制备叶绿素铜钠盐的制备方法，所述制备方法为在对银杏叶用极性溶剂浸提前或 同时或后，以非极性溶剂为浸提溶剂进行叶绿素的浸提，再采用混合溶剂为溶媒同时进行皂 化及铜代，然后进行脱银杏酸的方法制备叶绿素铜钠盐。

作为优选，所述制备方法的步骤如下：

a)提取及浓缩：银杏叶经粉碎后，用2-10倍于银杏叶质量的6号溶剂油在30-60℃下浸提1-6 小时，过滤，滤液减压浓缩至银杏叶质量的20％-50％；或者，银杏叶经粉碎后，用2-10倍于 银杏叶质量的混合溶剂在30-60℃下搅拌提取1-6小时，静置，分取6号溶剂油，减压浓缩至 银杏叶质量的20％-50％；

b)皂化及铜代：向歩骤a)所得浓缩液中加入80％-100％的异丙醇，所加的量为银杏叶质量 的20％-100％，搅拌取样，若溶液中沉淀物明显，可补加6号溶剂油，直至溶液无明显沉淀 为宜；向溶解后的混合溶液中加入30％(w/w)液碱及20％(w/w)硫酸铜溶液，液碱加入量 为银杏叶质量的4％-8％，硫酸铜溶液的加入量为银杏叶质量的1.6％-4％；将此皂化液置40-60 ℃条件下反应0.5-20小时，以液相色谱法检测确定反应终点，得到皂液；

c)碱性皂液下的6号溶剂油萃取除杂：将步骤b)反应完全的皂液冷却，并向其中加水，使 6号溶剂油与异丙醇分层，所加水量为异丙醇用量的1-2倍，然后使用6号溶剂油进行多次萃 取，直至6号溶剂油层接近无色；

d)脱银杏酸：向歩骤c)经6号溶剂油除杂后的皂液中加入6号溶剂油，6号溶剂油加入量 为除杂后的皂液量的0.5-3倍；搅拌下加入硫酸；冷却后静置分层，分取含叶绿素铜酸的6 号溶剂油层，6号溶剂油层经离心分离得叶绿素铜酸，将叶绿素铜酸以不含银杏酸的6号溶 剂油反复洗涤；

取经过6号溶剂油洗涤后的叶绿素铜酸，加入30％-40％(v/v)异丙醇水溶液及液碱使溶解； 加入不含银杏酸的6号溶剂油，6号溶剂油加入量为异丙醇水溶液量的0.5-3倍；搅拌下加入 硫酸，使pH<4；冷却后静置分层，经离心分离得叶绿素铜酸，即得符合银杏酸质量要求的叶 绿素铜酸；

e)成盐：将歩骤d)所得叶绿素铜酸溶于丙酮-乙醇混合溶液中，所用混合溶液中乙醇所占比 例为0％-50％，使用量为叶绿素铜酸湿品质量的10-100倍，中低速搅拌下加入5％(w/w)乙 醇钠；过滤得叶绿素铜钠盐，再以有机溶剂淋洗滤渣，然后干燥，干燥温度60-80℃，即得叶 绿素铜钠盐成品。

在本技术方案中，通过对醇提法生产银杏黄酮的方法加以改进，使得在提取银杏黄酮 的同时，提取银杏叶中的叶绿素，进而制备稳定性较好的叶绿素铜钠盐；或者，通过对未经 高温浸煮工艺提取银杏黄酮后的叶渣进行脱镁叶绿素的浸提，进而制备稳定性较好的叶绿素 铜钠盐。而浸提时机的选择完全取决于银杏黄酮的提取方法，如果是水提法制黄酮，通常需 加热浸提，这对脱镁叶绿素亦可造成热分解，此时必须在黄酮浸提前进行叶绿素的浸提。由 于提取黄酮与提取叶绿素的溶剂极性不同，且脂溶性物质对银杏黄酮而言为杂质，所以在银 杏黄酮提取前或同时进行叶绿素的提取对银杏黄酮提取将产生有益的影响。

异丙醇水溶液可以有效减轻6号溶剂油萃取分层时产生的乳化现象。

由于叶绿素铜钠盐易溶于水，使用乙醇钠可以减少水份的引入，从而提高结晶收率。

作为优选，步骤a)中所用混合溶剂为乙醇和6号溶剂油，乙醇和6号溶剂油的质量 比为4:1～1:4。

作为优选，步骤d)中加入异丙醇水溶液量为叶绿素铜酸湿品重量的30-100倍，液碱 加入量为叶绿素铜酸湿品重量的0.5-1倍。

作为优选，步骤d)中冷却后静置分层后，分取含叶绿素铜酸的6号溶剂油层，再加 入6号溶剂油层0.5-1.5倍量的10-40％异丙醇水溶液洗3-4次，再离心分离。

作为优选，步骤e)中乙醇钠加入量为叶绿素铜酸湿品质量的0.5-5倍。

作为优选，步骤a)中极性溶剂为水、甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或几种，非极性 溶剂为6号溶剂油、正己烷及沸程为60-100℃的混合烷烃中的一种。

作为优选，步骤e)中有机溶剂为丙酮-乙醇混合溶液、乙醇、丙酮、异丙酮、丙酮- 异丙醇混合溶液中的一种。

本发明的有益效果是：

1)在进行银杏黄酮浸提前或同时或后，以6号溶剂油为浸提溶剂进行脱镁叶绿素及其它油溶 性物质的浸提；

2)采用混合溶剂为溶媒进行皂化，避免皂液中沉淀的产生，从而使反应能够快速而完全地进 行；

3)采用碱性皂化及铜代同时进行的方法制备叶绿素铜钠盐，避免酸化铜代时发生的叶绿素铜 酸的酯化及变质；

4)获取叶绿素的同时可以得到银杏叶聚异戊烯醇原料；

5)通过溶剂萃取法脱除银杏酸；

6)银杏叶相比于其它原料的资源优势；

7)本发明所得产品(405nm±nm)>900，吸光度比值＝3.2～3.6，络合铜>6％，氮含量>5.5％， 银杏酸<50ppm；

8)本发明以银杏叶为原料，通过综合利用，大大降低了生产成本，提高了产品的竞争力，增 加经济效益，且本发明的产品纯度高，质量稳定，步骤简单，适用于大规模工厂化生产。

附图说明

图1是实施例1皂化前色谱图。

图2是实施例1皂化60分钟后的色谱图。

图3是实施例1银杏酸测定色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。

如未特另声明,所有溶剂浓度均为体积分数。

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

取0.5Kg烘干银杏叶，经液相分析含脱镁叶绿素0.3％，粉碎，加6号溶剂油1.5L30℃下静置 浸泡1小时，过滤，滤渣用1L6号溶剂油冲洗；此浸提液经液相分析含脱镁叶绿素1.35g；浓 缩此浸提液至银杏叶质量的20％，加入80％异丙醇200mL，6号溶剂油200mL，摇匀，转移 至棕色1000mL广口瓶，置60℃水浴中，加入32mL30％(w/w)液碱，16mL20％(w/w)硫酸 铜水溶液，摇匀后静置皂化0.5水时；向皂液中加水400mL，转移入避光良好的分液漏斗中 静置分层；弃去中间层及上层，转移下层至连续液液萃取器中，用6号溶剂油萃取其中油溶 性杂质至6号溶剂油流出液色浅；取下层皂液层，加6号溶剂油400mL，搅拌下加入98％硫 酸9mL，使水相pH<4，冷却后静置分层，弃去水相；分取6号溶剂油层，经过滤得叶绿素 铜酸固体；叶绿素铜酸固体用不含银杏酸的6号溶剂油400mL洗涤两次；所得叶绿素铜酸加 30％异丙醇50ml，液碱1mL，搅拌溶解，然后加6号溶剂油100mL，搅拌酸析，离心分离； 分离所得叶绿素铜酸再以20％异丙醇100mL洗涤3次，离心分离得脱银杏酸叶绿素铜酸，用 含30％乙醇的丙酮溶液50mL溶解叶绿素铜酸，加入5％(w/w)乙醇钠10mL，过滤其中析出的 叶绿素铜钠盐，再用10mL乙醇冲洗滤渣，得叶绿素铜钠盐湿品；将此湿品置70℃真空烘箱 中干懆即得叶绿素铜钠盐成品0.95g。

按美国药典USP35叶绿素铜钠盐方法检测，成品质量：(405nm±nm)＝1055，吸光 度比值＝3.34，络合铜＝7.1％，氮含量＝6.3％，银杏酸＝20ppm。

实施例2

取0.5Kg烘干银杏叶，经液相分析含脱镁叶绿素0.3％，粉碎，加60％乙醇1.5L，6号溶剂油 1.5L，45℃搅拌浸提4小时，静置分层，下层补加6号溶剂油1.5L，搅拌30分钟后静置分层； 合并6号溶剂油相即得脱镁叶绿素浸提液；此浸提液经液相分析含脱镁叶绿素1.41g；浓缩此 浸提液至银杏叶质量的45％，加入90％异丙醇200mL，6号溶剂油200mL，摇匀，转移至棕 色1000mL广口瓶，置50℃水浴中，加入32mL30％(w/w)液碱，16mL20％(w/w)硫酸铜水溶液， 摇匀后静置皂化2水时；向皂液中加水400mL，转移入避光良好的分液漏斗中静置分层；弃 去中间层及上层，转移下层至连续液液萃取器中，用6号溶剂油萃取其中油溶性杂质至6号 溶剂油流出液色浅；取下层皂液层，加6号溶剂油400mL，搅拌下加入98％硫酸9mL，使水 相pH<4，冷却后静置分层，弃去水相；分取6号溶剂油层，经过滤得叶绿素铜酸固体；叶绿 素铜酸固体用不含银杏酸的6号溶剂油400mL淋洗；所得叶绿素铜酸加30％异丙醇50ml， 液碱1mL，搅拌溶解，然后加6号溶剂油100mL，搅拌酸析，离心分离；分离所得叶绿素铜 酸再以20％异丙醇100mL洗涤4次，离心分离得脱银杏酸叶绿素铜酸；用丙酮溶液50mL溶 解叶绿素铜酸，加入5％(w/w)乙醇钠10mL，过滤其中析出的叶绿素铜钠盐，再用10mL丙酮 -异丙醇混合溶液冲洗滤渣，得叶绿素铜钠盐湿品；将此湿品置60℃真空烘箱中干懆即得叶绿 素铜钠盐成品0.93g。

按美国药典USP35叶绿素铜钠盐方法检测，成品质量：(405nm±nm)＝1020，吸光 度比值＝3.41，络合铜＝6.8％，氮含量＝6.2％，银杏酸＝42ppm。

实施例3

取0.5Kg烘干银杏叶，经液相分析含脱镁叶绿素0.3％，粉碎，加6号溶剂油1.5L，60℃下静 置浸泡6小时，过滤，滤渣用1L6号溶剂油冲洗；此浸提液经液相分析含脱镁叶绿素1.37g； 浓缩此浸提液至干，加入100％异丙醇100mL，6号溶剂油200mL，摇匀，转移至棕色1000mL 广口瓶，置40℃水浴中，加入32mL30％(w/w)液碱，16mL20％(w/w)硫酸铜水溶液，摇匀后 静置皂化20小时；向皂液中加水200mL，转移入避光良好的分液漏斗中静置分层；弃去中间 层及上层，转移下层至连续液液萃取器中，用6号溶剂油萃取其中油溶性杂质至6号溶剂油 流出液色浅；取下层皂液层，加6号溶剂油400mL，搅拌下加入98％硫酸9mL，使水相pH<4， 冷却后静置分层，弃去水相；分取6号溶剂油层，经过滤得叶绿素铜酸固体；叶绿素铜酸固 体用不含银杏酸的6号溶剂油400mL淋洗；所得叶绿素铜酸加30％异丙醇50ml，液碱1mL， 搅拌溶解，然后加6号溶剂油100mL，搅拌酸析，离心分离；分离所得叶绿素铜酸再以20％ 异丙醇100mL洗涤3次，离心分离得脱银杏酸叶绿素铜酸；然后用含50％乙醇的丙酮溶液 50mL溶解叶绿素铜酸，加入5％(w/w)乙醇钠10mL，过滤其中析出的叶绿素铜钠盐，再用10mL 丙酮-乙醇混合溶液冲洗滤渣，得叶绿素铜钠盐湿品；将此湿品置80℃真空烘箱中干懆即得叶 绿素铜钠盐成品0.87g。

按美国药典USP35叶绿素铜钠盐方法检测，成品质量：(405nm±nm)＝1046，吸光 度比值＝3.30，络合铜＝7.1％，氮含量＝6.4％，银杏酸＝38ppm。

实施例4

取0.5Kg烘干银杏叶，经液相分析含脱镁叶绿素0.3％，粉碎，加60％乙醇2.4L，6号溶剂油 0.6L，45℃搅拌浸提4小时，静置分层，下层补加6号溶剂油1.5L，搅拌30分钟后静置分层； 合并6号溶剂油相即得脱镁叶绿素浸提液；此浸提液经液相分析含脱镁叶绿素1.41g；浓缩此 浸提液至银杏叶质量的45％，加入90％异丙醇200mL，6号溶剂油200mL，摇匀，转移至棕 色1000mL广口瓶，置50℃水浴中，加入32mL30％(w/w)液碱，16mL20％(w/w)硫酸铜水溶液， 摇匀后静置皂化2水时；向皂液中加水400mL，转移入避光良好的分液漏斗中静置分层；弃 去中间层及上层，转移下层至连续液液萃取器中，用6号溶剂油萃取其中油溶性杂质至6号 溶剂油流出液色浅；取下层皂液层，加6号溶剂油400mL，搅拌下加入98％硫酸9mL，使水 相pH<4，冷却后静置分层，弃去水相；分取6号溶剂油层，经过滤得叶绿素铜酸固体；叶绿 素铜酸固体用不含银杏酸的6号溶剂油400mL淋洗；所得叶绿素铜酸加30％异丙醇50ml， 液碱1mL，搅拌溶解，然后加6号溶剂油100mL，搅拌酸析，离心分离；分离所得叶绿素铜 酸再以20％异丙醇100mL洗涤4次，离心分离得脱银杏酸叶绿素铜酸；用丙酮溶液50mL溶 解叶绿素铜酸，加入5％(w/w)乙醇钠10mL，过滤其中析出的叶绿素铜钠盐，再用10mL丙酮 -异丙醇混合溶液冲洗滤渣，得叶绿素铜钠盐湿品；将此湿品置60℃真空烘箱中干懆即得叶绿 素铜钠盐成品0.93g。

按美国药典USP35叶绿素铜钠盐方法检测，成品质量：(405nm±nm)＝1020，吸光 度比值＝3.41，络合铜＝6.8％，氮含量＝6.2％，银杏酸＝42ppm。

实施例5

取0.5Kg烘干银杏叶，经液相分析含脱镁叶绿素0.3％，粉碎，加60％乙醇0.6L，6号溶剂油 2.4L，45℃搅拌浸提4小时，静置分层，下层补加6号溶剂油1.5L，搅拌30分钟后静置分层； 合并6号溶剂油相即得脱镁叶绿素浸提液；此浸提液经液相分析含脱镁叶绿素1.41g；浓缩此 浸提液至银杏叶质量的45％，加入90％异丙醇200mL，6号溶剂油200mL，摇匀，转移至棕 色1000mL广口瓶，置50℃水浴中，加入32mL30％(w/w)液碱，16mL20％(w/w)硫酸铜水溶液， 摇匀后静置皂化2水时；向皂液中加水400mL，转移入避光良好的分液漏斗中静置分层；弃 去中间层及上层，转移下层至连续液液萃取器中，用6号溶剂油萃取其中油溶性杂质至6号 溶剂油流出液色浅；取下层皂液层，加6号溶剂油400mL，搅拌下加入98％硫酸9mL，使水 相pH<4，冷却后静置分层，弃去水相；分取6号溶剂油层，经过滤得叶绿素铜酸固体；叶绿 素铜酸固体用不含银杏酸的6号溶剂油400mL淋洗；所得叶绿素铜酸加30％异丙醇50ml， 液碱1mL，搅拌溶解，然后加6号溶剂油100mL，搅拌酸析，离心分离；分离所得叶绿素铜 酸再以20％异丙醇100mL洗涤4次，离心分离得脱银杏酸叶绿素铜酸；用丙酮溶液50mL溶 解叶绿素铜酸，加入5％(w/w)乙醇钠10mL，过滤其中析出的叶绿素铜钠盐，再用10mL丙酮 -异丙醇混合溶液冲洗滤渣，得叶绿素铜钠盐湿品；将此湿品置60℃真空烘箱中干懆即得叶绿 素铜钠盐成品0.93g。

按美国药典USP35叶绿素铜钠盐方法检测，成品质量：(405nm±nm)＝1020，吸光 度比值＝3.41，络合铜＝6.8％，氮含量＝6.2％，银杏酸＝42ppm。

实施例6

取0.5Kg烘干银杏叶，经液相分析含脱镁叶绿素0.3％，粉碎，加60％乙醇1.2L，6号溶剂油 1.8L，45℃搅拌浸提4小时，静置分层，下层补加6号溶剂油1.5L，搅拌30分钟后静置分层； 合并6号溶剂油相即得脱镁叶绿素浸提液；此浸提液经液相分析含脱镁叶绿素1.41g；浓缩此 浸提液至银杏叶质量的45％，加入90％异丙醇200mL，6号溶剂油200mL，摇匀，转移至棕 色1000mL广口瓶，置50℃水浴中，加入32mL30％(w/w)液碱，16mL20％(w/w)硫酸铜水溶液， 摇匀后静置皂化2水时；向皂液中加水400mL，转移入避光良好的分液漏斗中静置分层；弃 去中间层及上层，转移下层至连续液液萃取器中，用6号溶剂油萃取其中油溶性杂质至6号 溶剂油流出液色浅；取下层皂液层，加6号溶剂油400mL，搅拌下加入98％硫酸9mL，使水 相pH<4，冷却后静置分层，弃去水相；分取6号溶剂油层，经过滤得叶绿素铜酸固体；叶绿 素铜酸固体用不含银杏酸的6号溶剂油400mL淋洗；所得叶绿素铜酸加30％异丙醇50ml， 液碱1mL，搅拌溶解，然后加6号溶剂油100mL，搅拌酸析，离心分离；分离所得叶绿素铜 酸再以20％异丙醇100mL洗涤4次，离心分离得脱银杏酸叶绿素铜酸；用丙酮溶液50mL溶 解叶绿素铜酸，加入5％(w/w)乙醇钠10mL，过滤其中析出的叶绿素铜钠盐，再用10mL丙酮 -异丙醇混合溶液冲洗滤渣，得叶绿素铜钠盐湿品；将此湿品置60℃真空烘箱中干懆即得叶绿 素铜钠盐成品0.93g。

按美国药典USP35叶绿素铜钠盐方法检测，成品质量：(405nm±nm)＝1020，吸光 度比值＝3.41，络合铜＝6.8％，氮含量＝6.2％，银杏酸＝42ppm。

本发明皂化终点的液相检测方法如下：

取皂液1ml，置25ml容量瓶中，以80％甲醇定容，并加入50％硫酸0.5ml，摇匀，过滤，即 得供试品溶液；

色谱条件：柱尺寸：L＝0.25m,Φ＝4.6mm；固定相：辛基硅烷硅胶色谱(C8柱,粒径:5μm)； 流动相：流动相A：0.01％磷酸水溶液；流动相B：0.01％磷酸乙腈溶液。

梯度表：

柱温：35℃；流量：1.0ml/min；检测器：紫外检测器，检测波长＝407nm；进样量：10～20μL。

图1为皂化前色谱图，图2为皂化60分钟后色谱图，其中保留时间4.55917min、 5.98000min峰分别为叶绿素B及A的铜酸。终点判定方法：当色谱图中不含或含极微量图1 中所示各峰时，可认为皂化反应已达终点。

本发明叶绿素铜钠盐中银杏酸含量测定方法如下：

供试品溶液：取本品1.0g，加水15ml，异丙醇15ml，超声溶解。再加石油醚(60～90，下同) 10ml，剧烈振摇下加50％硫酸12滴，离心，取石油醚层清夜，即得。

对照溶液：取10.0mg白果新酸(C13)对照品，加25ml甲醇溶解。取该溶液2ml， 并用甲醇稀释至10ml。

色谱条件：柱尺寸：L＝0.25m,Φ＝4.6mm；固定相：辛基硅烷硅胶色谱(C8柱,粒 径:5μm)；流动相：流动相A：0.01％磷酸水溶液；流动相B：0.01％磷酸乙腈溶液。

梯度表：

柱温：35℃；流量：1.0ml/min；检测器：紫外检测器，检测波长＝210nm；进样量：20μL； 定量方法：外标法。

图3是银杏酸测定色谱图，银杏酸测定色谱图，其中2^#～6^#为银杏酸各成份峰。

银杏酸控制方法：依上法检测银杏酸，直至其含量小于规定要求。