体外培养肝样细胞的方法及采用该方法培养的优化后肝样细胞

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种获得优化后肝样细胞的体外培养方法以及采用该方法获得的优化后肝样细胞。所述体外培养方法包括采用三明治细胞培养法、无血清培养和诱导培养基。获得的优化后肝样细胞接近原代肝脏细胞的结构和功能，其药物转运体、胆酸转运体和/或胆酸合成酶的表达水平显著高于传统肝样细胞；其药物胆汁分泌指数(BEI)和内在胆汁清除率(CLb,int)显著高于传统肝样细胞；其出现药物转运体的极化表达。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种体外培养肝样细胞的方法以及采用该方法培养的优化后肝样细胞。 

背景技术

肝脏是决定药物代谢和毒性作用的主要器官，也是多种病毒性肝炎、肝脏肿瘤疾病的靶器官。目前，在制药工业界，原代肝细胞(包括人和动物原代肝细胞)因其药物代谢酶和药物转运体的表达和新药研发以及临床现象有比较好的相关性，被称为药物动力学研究的黄金标准，同时也是肝移植和生物反应器的宝贵资源(Sinz,Wallace et al.2008)。目前原代肝细胞的国际市场保守估计在20亿美元。但是，原代肝细胞不能传代，多种蛋白质表达下降，加上价格昂贵和供体依赖性，限制了它在科研和临床上的进一步使用。因此，无论是科研还是制药工业实践中迫切需要一种功能与肝细胞类似、可稳定传代、可靠且易得的功能性肝细胞。 

2010年的FDA白皮书首次指出，药物转运体在新药研发中具有和药物代谢酶同等重要的地位，并且规定了7种必须考察的药物转运体，其中有5种药物转运体在肝脏的代谢、解毒中起到重大作用(International Transporter,Giacomini et al.2010)。这一内容在2012年FDA药物相互作用指南中被确定了下来。 

但是，目前可以获得的类似肝脏细胞的细胞株有各种缺点，尤其是没有具备合适的药物转运体表达，无法用于肝脏相关的药物肝胆分布和代谢、毒性研究。例如，最通用的肝脏来源细胞株HepG2上面几乎没有重要的药物转运体表达，更不用说胆管类似结构了。目前公认最接近原代肝细胞的细胞株HepaRG，虽然药物代谢酶CYP3A4表达较为丰富并且可以诱导，但是其药物转运体表达仅仅有Pgp得到承认，而且通过免疫组化试验显示，不能达到极化表达(Andersson,Kanebratt et al.2012)(参见附图4)。 

近年来，许多体外试验证实可将胚胎干细胞或者诱导多功能干细胞分化为 肝样细胞，但是，这些技术受供体来源(来自于胚胎的ES细胞)和诱导产生过程高成本和复杂性(来源于人类上皮细胞的iPS细胞，需要进行转分化三部曲)所限，无法提供合适的肝样细胞用于药物研发(Jensen,Hyllner et al.2009)。虽然有多篇文献报道这些细胞具备了一定的药物代谢酶表达，但是对于药物转运体的表达鲜有报道，而且无法令人满意。目前国际上最新的直接转分化技术，可以将小鼠成纤维细胞分化成鼠源诱导肝样细胞(induced hepatocyte-like cell,iHep)。虽然iHep在形态、功能和应用上和现有细胞系相比有很多优点，但是，iHep在转运体的表达方面并没有显著提高(图1)。在药物转运体和胆酸合成分泌方面并不成熟，没有形成药物转运体的极化表达和可以检测的胆酸合成分泌能力。事实上，胆酸的合成分泌和药物的解毒能力是成熟肝细胞的重要标志。实验数据显示，在现有的iHep细胞中，药物转运体及胆酸相关的合成酶和转运体的表达量与其在小鼠原代肝细胞中的表达量相比极低，仅为5-10%(图1)。类似地，采用直接转分化技术也可以由人源非肝脏细胞获得人源诱导肝样细胞(human induced hepatocyte-like cell,HiHep)，但该细胞也同样具有上述缺陷。 

发明内容

技术问题 

2011年，Nature上发表论文，在世界上首次提出可以利用表观遗传学手段，直接将小鼠的鼠尾纤维细胞转分化成肝样细胞（Huang PY,He ZY,Ji SY,Sun HW,Xiang D,et al.(2011)Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors.Nature475:386-U142.）。相对于原代肝细胞，通过上述直接转分化技术产生的肝样细胞的来源不受供体资源的限制，理论上可以在保持遗传性状的基础上无限传代。它们不仅具有肝脏细胞的多项生理特征和功能，而且具有清楚的遗传背景和一定的药物代谢酶表达。因此具有取代原代肝细胞，成为用于药物研发和临床实践的新细胞模型的潜力。 

但是，该细胞株仅具备初步的药物转运体和胆酸代谢酶表达，而各种相关蛋白质并没有在细胞膜上极化分布。FDA2012年发布的药物相互作用指南上明确指出，只有药物转运体在肝细胞膜上极化表达，细胞才可能具备胆酸盐极化摄取、分泌能力，这是评价肝样细胞的重要特性。 

因此，在现有技术中，例如，无论是将胚胎干细胞或者诱导多功能干细胞分化为肝样细胞还是利用例如直接转分化技术获得的肝样细胞均没有形成药 物转运体的极化表达和/或可以检测的胆酸合成分泌能力。在本申请中，将采用现有技术(包括直接转分化技术和胚胎干细胞或多功能干细胞诱导分化技术)将动物源非肝脏细胞或人源非肝脏细胞获得的肝样细胞定义为传统肝样细胞，其没有形成药物转运体的极化表达和/或可以检测的胆酸合成分泌能力，在功能和形态上与原代肝细胞具有显著的差别。 

为提高现有技术（包括直接转分化技术和胚胎干细胞或多功能干细胞诱导分化技术）产生的传统肝样细胞中胆酸合成酶、胆酸转运体和药物转运体的表达和功能，本申请的发明人通过多次试验，产生了适用于现有技术（包括直接转分化技术和胚胎干细胞或多功能干细胞诱导分化技术）产生的传统肝样细胞的特殊体外培养方法。该方法有效刺激由现有技术（包括直接转分化技术和胚胎干细胞或多功能干细胞诱导分化技术）产生的传统肝样细胞的进一步分化、胆酸合成酶表达和相关药物转运体极化分布，从而使传统肝样细胞具备和原代肝细胞类似的胆汁摄取、分泌能力，药物转运体极化表达，从而可以用于相关科研工作。 

因此，本发明的一个目的为提供一种对采用现有技术获得的传统肝样细胞进行体外培养的方法。具体地，所述方法能够进一步促进传统肝样细胞的生长和分化并提高药物转运体、胆酸转运体和/或胆酸合成酶的表达水平和极化表达。 

本发明的另一个目的为提供一种优化后肝样细胞，所述优化后肝样细胞内胆酸合成酶、胆酸转运体和药物转运体的表达大幅度提高，并且功能接近原代肝细胞。 

技术方案 

本发明提供一种传统肝样细胞的体外培养方法，其包括： 

步骤1、采用三明治（sandwich）细胞培养法培养传统肝样细胞，即：将传统肝样细胞接种在含鼠尾胶原Ⅰ的24孔板上，加上普通培养基，培养细胞24-48小时后，铺上基质胶，形成三明治培养结构，继续培养24-48小时； 

步骤2、撤除原有普通培养基，换用诱导培养基继续培养3-5天，获得优化后肝样细胞； 

其中，所述诱导培养基为无血清培养基的基础上补加诱导剂，即普通培养 基撤除1%的胎牛血清，并且补加cAMP(环腺苷酸)、3MC(3-甲基胆蒽)、PB(苯巴比妥)、TCA(牛黄胆酸)和VPA（丙戊酸）中的至少一种核受体激动剂，上述各核受体激动剂在所述诱导培养基中的浓度范围分别为cAMP1-10μM、3MC1-10μM、PB10-200μM、TCA5-50μM和VPA0.2-4μM； 

优选地，所述诱导培养基含有选自cAMP、3MC、PB和TCA中的两种或三种，进一步优选地，所述诱导培养基含有浓度为2μM的cAMP和浓度为50μM的PB，或者含有浓度为2μM的cAMP、浓度为2μM的3MC和浓度为50μM的PB，或者含有浓度为2μM的cAMP、浓度为2μM的3MC、浓度为50μM的PB和浓度为20μM的TCA。 

更优选地，所述诱导培养基含有浓度为2μM的cAMP、浓度为50μM的PB和浓度为20μM的TCA。 

其中，所述传统肝样细胞没有形成药物转运体的极化表达和/或可以检测的胆酸合成分泌能力。 

优选地，所述传统肝样细胞转染了肝细胞核因子。 

优选地，所述传统肝样细胞为由胚胎干细胞或诱导多功能干细胞分化的肝样细胞；或者所述传统肝样细胞为利用直接转分化技术，由动物源非肝脏细胞获得的肝样细胞，例如，由鼠尾成纤维(TFF)细胞或者鼠胚胎成纤维(MEF)细胞获得的鼠源肝样细胞；或者，所述传统肝样细胞为利用直接转分化技术由人源非肝脏细胞，优选人类胚胎成纤维细胞获得的人源肝样细胞；（例如参照Huang PY,He ZY,Ji SY,Sun HW,Xiang D,et al.(2011)Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors.Nature475:386-U142.记载的方法形成）。 

更优选地，所述鼠源肝样细胞转染了肝细胞核因子4α(Hnf4α)；所述人源肝样细胞转染了肝细胞核因子4A(HNF4A)。 

另一方面，本发明提供一种优化后肝样细胞，其中，所述优化后肝样细胞 通过上述体外培养方法获得。 

所述优化后肝样细胞的药物转运体的表达水平为传统肝样细胞的一倍以上； 

所述优化后肝样细胞的胆酸转运体的表达水平显著高于传统肝样细胞； 

所述优化后肝样细胞的胆酸合成酶的表达水平显著高于传统肝样细胞； 

所述优化后肝样细胞的药物胆汁分泌指数(BEI)和内在胆汁清除率(CL_b,int)显著高于传统肝样细胞； 

所述优化后肝样细胞出现药物转运体极化表达。 

其中，所述胆酸转运体为Bsep、Mrp2和/或Ntcp；所述药物转运体为P-gp、Bcrp、Oatp1b2、Oatp1a1和/或Oatp1a4；所述胆酸合成酶为Cyp7a1。 

有益效果 

为提高直接转分化产生的传统肝样细胞内胆酸合成酶、胆酸转运体和药物转运体的表达和功能，本申请采用了包括如下特征的体外培养方法：在将Hnf4α/HNF4A转染传统肝样细胞并表达后，采用三明治培养法进行培养，之后采用无血清培养基并加入核受体诱导因子对传统肝样细胞激活、优化。 

采用本申请所述体外培养方法获得的优化后肝样细胞具有以下优势特征：(1)药物转运体和内源胆汁转运体及其相关的核受体的mRNA水平与它们在原代肝细胞的mRNA水平基本接近；(2)在体外可以形成胆小管并且具有分泌功能；(3)优化后肝样细胞和原代肝细胞对于药物的胆汁分泌速率的相关性很好。 

Hnf4α/HNF4A显著地增加了鼠源/人源肝样细胞中Bsep、Mrp2、Ntcp、Cyp7a1的mRNA表达量。 

和传统的肝样细胞的培养法不同，本申请所述的体外培养方法采用无血清培养，使得肝样细胞中肝脏药物转运体的mRNA的表达水平得到明显改善，尤其是胆酸摄取转运体Ntcp和外排转运体Bcrp的表达水平显著提高。 

本申请所述的体外培养方法采用三维细胞培养法(三明治细胞培养法)，使 得肝样细胞中肝脏药物转运体的mRNA的表达水平显著提高。 

在无血清培养基中添加cAMP、PB和/或TCA等很大程度上提高了肝脏主要的胆酸转运体Bsep、Mrp2和Ntcp的mRNA的水平。此外，cAMP、PB和/或TCA等对肝脏中的药物转运体(P-gp、Bcrp、Oatp1a1/4和Oatp1b2)的mRNA水平有很大的提高作用。胆酸合成酶Cyp7a1的mRNA水平在cAMP的诱导下可被提高4倍。这些药物转运体、胆酸转运体和胆酸合成酶表达的增加是肝样细胞对于药物和内源性物质代谢分布能力提高的重要标志。 

这一工作将为表观遗传学和直接转分化技术的实际应用奠定基础，使新型肝样细胞用于新药研发成为可能。 

附图说明

图1A-图1F显示了不同实验条件和不同诱导因子对鼠源传统肝样细胞中胆酸合成酶(Cyp7a1)和多种胆酸转运体的基因表达水平的影响。 

图2A-图2G显示了不同实验条件和不同诱导因子对鼠源传统肝样细胞中多种药物转运体的基因表达水平或对BEI(%)的影响。 

图3A-图3B显示了对实施例1中获得的鼠源优化后肝样细胞中的药物外排转运体和摄取转运体（3A）以及相关核受体（3B）的基因表达水平的影响。其中，以鼠尾纤维细胞和小鼠肝脏细胞为对照。 

图4为对HepaRG细胞进行免疫组化染色后，在电镜下获得的图像。HepaRG细胞是目前唯一受FDA承认的肝样细胞株，可以用于肝脏药物代谢酶诱导研究。但是，从图4可以看出，该细胞株药物代谢酶(CYP3A4，图4C)表达尚可，但是重要的药物和胆酸转运体(图4A：P-gp，图4B，MRP2)表达很不充分，仅仅在部分细胞有表达，而且不均匀。 

图5为小鼠肝脏细胞、传统肝样细胞和实施例1获得的优化后肝样细胞在荧光显微镜下观察有无CDF在形成的胆管区域分泌汇集的图像。可以看出，小鼠肝脏细胞和实施例1获得的优化后肝样细胞都有CDF在形成的胆管区域汇集，而传统肝样细胞未观察到此现象。 

图6为荧光共聚焦显微镜照片。第一排和第三排为小鼠肝脏细胞的照片，其中，重要胆酸和药物转运体Bsep、Mrp2、Pgp和Bcrp沿着胆管结构极化表达； 第二排和第四排为实施例1获得的优化后肝样细胞的照片，其中，Bsep、Mrp2、Pgp和Bcrp同样出现极化表达。可以看出，小鼠肝脏细胞和实施例1获得的优化后肝样细胞的照片形态十分接近。 

图7为DPDPE（脑啡肽）、d8-TCA（同位素标记牛磺胆酸）、瑞舒伐他汀和甲氨蝶呤四种化合物在优化前后的肝样细胞和小鼠原代肝细胞内在胆汁清除率的相关性。 

图8为实施例2获得的人源优化后肝样细胞的药物转运体的基因表达水平(图8a)和BEI(%)(图8b)。 

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步说明本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。 

实施例1 鼠源优化后肝样细胞的获得 

步骤1、利用直接转分化技术产生传统鼠源肝样细胞 

1)分子克隆和慢病毒的产生 

首先构建目的基因的载体：多克隆位点插入到带有报告基因GFP的慢病毒载体pWPI的PmeI限制性酶切位点，目的基因Gata、Hnf1α、Foxa3这三个转录因子的cDNA分别连接到这样修饰好的载体上，之后构建好的三个含转录因子的pWPI载体分别和两个包装质粒psPAX2、pMD2.G加到293T细胞中。48小时后，收集含有慢病毒的上清并用0.45?μm的过滤器过滤，分装到EP管中，-80℃冻存。 

2)鼠尾成纤维(TFF)细胞或者鼠胚胎成纤维(MEF)细胞的培养： 

鼠尾成纤维细胞首先是从2个月大的小鼠身上切下5cm尾巴，去掉真皮，切碎至1cm左右，放到铺有胶原Ⅰ的6cm平板中生长，培养基为含10%FBS的DMEM，体积为5ml。5天之后，成纤维细胞转移到新的铺有胶原Ⅰ的6cm平板中。一般鼠尾成纤维细胞第7到9代用于慢病毒的转染。 

鼠胚胎成纤维细胞是首先获得13.5天的鼠胚胎，头和内脏去除，剩余组织切碎，0.25%胰蛋白酶在37℃的条件下消化15min，之后细胞转移到铺有胶 原Ⅰ的6cm平板中生长，培养基仍是含10%FBS的DMEM，体积为5ml。一般鼠胚胎成纤维细胞第3代用于慢病毒的转染。 

3)慢病毒的转染以及成熟传统肝样细胞的获得 

第一天在铺有胶原Ⅰ的6cm平板上铺1.5×10⁵个鼠尾成纤维细胞或者鼠胚胎成纤维细胞，第二天按照流式细胞仪测的病毒滴度加入三个转录因子Gata、Hnf1α、Foxa3，并同时加入polybrene(聚凝胺，终浓度达到8μg/ml或4μg/ml)，第三天换新鲜培养基，培养基仍为含10%FBS的DMEM，第四天换新鲜培养基，培养基为普通培养基，之后两天换一次普通培养基，转染14-21天，获得成熟的传统肝样细胞。注：普通培养基配方：DMEM/F121:1基础培养基（Hyclone）含0.1μM地塞米松，20μg/LTGF-α,10μg/L EGF,4.2mg/L胰岛素,3.8mg/L人转铁蛋白，5μg/L亚硒酸盐和1%的胎牛血清。 

步骤2、转染肝细胞核因子4α(Hnf4α) 

将目的基因肝细胞核因子4α(Hnf4α)的cDNA连接到带有报告基因GFP的慢病毒载体pWPI中，将构建好的含Hnf4α的pWPI载体和包装质粒psPAX2、pMD2.G感染293T细胞。48小时后，收集含有慢病毒的上清并用0.45μm的过滤器过滤，分装到EP管中。使用流式细胞仪检测好病毒滴度，最后进行转染步骤1获得的传统肝样细胞。 

步骤3、采用三明治细胞培养法培养步骤2获得的转染了Hnf4α的传统肝样细胞。 

首先将形成的传统肝样细胞消化分离，然后将传统肝样细胞接种在含鼠尾胶原Ⅰ的24孔板上，密度为1×10⁶个/cm²，加上500μl普通培养基，培养细胞24小时后，铺上基质胶，形成三明治培养结构，继续培养24小时。普通培养基的配方：DMEM/F121:1基础培养基含0.1μM地塞米松，20μg/L TGF-α,10μg/L EGF,4.2mg/L胰岛素,3.8mg/L人转铁蛋白，5μg/L亚硒酸盐和1%的胎牛血清。 

步骤4、优化培养获得优化后肝样细胞(鼠源) 

步骤3后，撤除原有普通培养基，换用诱导培养基，即在普通培养基撤除1%胎牛血清的基础上，加上核受体激动剂：cAMP(2μM)、PB(50μM)和TCA (20μM)，继续培养3-5天，获得优化后肝样细胞。 

实施例2 人源优化后肝样细胞的获得 

除了用人类胚胎成纤维细胞（来源孕妇胎盘样本）代替鼠尾成纤维(TFF)细胞或者鼠胚胎成纤维(MEF)细胞，并使用肝细胞核因子4A(HNF4A)转染人类胚胎成纤维细胞（来源孕妇胎盘样本）外，采用与实施例1类似的方法获得人源优化后肝样细胞。 

实施例3 对不同浓度和不同种类的核受体激动剂组合进行实验研究。 

首先在基于传统肝样细胞的基础上获得转染了Hnf4α的肝样细胞(步骤同实施例1中的步骤1-3)。然后换用含有不同浓度和不同组合核受体激动剂的诱导培养基进行优化选择，分别尝试了单一一种核受体及其浓度，多种核受体激动剂组合及其浓度，最后获得最优选的核受体激动剂的组合和浓度。具体结果如下表1、2、3所示。 

表1：单一一种核受体激动剂及其浓度范围 

表2：多种核受体激动剂组合及其应用浓度 

表3 最优选的核受体激动剂组合及其应用浓度 

实验实施例功能学和基因表达测试以确认细胞优化成功 

在细胞优化完成之后(通常需要3-5天时间)，分别从基因表达和功能学角度验证优化过程是否成功： 

一、通过定量PCR(QPCR)方法测定药物转运体、胆酸转运体、胆酸合成酶的表达 

首先用Trizol抽提细胞的总RNA，按照RNA抽提的试剂盒抽提RNA。将提取的总RNA稀释一定的倍数后，用紫外分光光度计测定260nm和280nm两个波长处的光吸收值，然后按以下公式来计算提取得到的总RNA的浓度：[RNA浓度(μg/ml)]=A260×40×稀释倍数，260nm和280nm两处读数的比值(A260/A280)，可反映核酸的纯度，一般A260/A280在1.8-2.0之间。2μg RNA通过逆转录体系反应生成cDNA，逆转录反应条件为：37℃15min，85℃5s，之后保持在10℃。通过SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行定量PCR操作，Pgp、Bcrp、Mrp2、Ntcp、Bsep等引物根据要求进行设计合成，之后进入仪器ABI7500定量PCR系统进行测定。 

测定重要药物转运体、胆酸转运体等的表达和传统细胞相比是否有显著提高，2/3测定对象表达提高在50%以上为合格。 

I.参见图1A-图1F，在每幅坐标图中，第一组直方图标(最左侧三个直方图标)表示鼠尾纤维细胞(TTF)、原代肝细胞(PriHep)和采用实施例1步骤1获得的鼠源传统肝样细胞的胆酸合成酶(Cyp7a1)和多种胆酸转运体的基因表达水平；第二组(中间三个直方图标)表示采用实施例1步骤1获得的鼠源传统肝样细胞分别进行三明治培养（即，仅进行实施例1的步骤1和步骤3）、无血清培养（即，进行实施例1步骤1后，采用普通培养基中撤除1%的胎牛血清的无血清培养基，培养48小时）以及传统肝样细胞成熟后再进行6周的长期普通培养（即，进行实施例1步骤1后，采用普通培养基再培养6周）。然后分别测定在这三种培养条件下的胆酸合成酶(Cyp7a1)和多种胆酸转运体的基因表达水平；第三组(最右侧6个直方图标)表示采用实施例1步骤1获得的鼠源传统肝样细胞在诱导培养基（在无血清培养基中分别加入各核受体激动剂2μM cAMP、2μM3MC、50μM PB、20μM TCA或1mM VPA）或者是转染Hnf4α后培养3-5天时间，测定胆酸合成酶(Cyp7a1)和多种胆酸转运体的基因表达水平。 

从图1的结果可以看出： 

(1)对于传统肝样细胞，如三明治培养、无血清培养或6星期的长期培养的培养条件均能提高其肝脏胆酸转运体(Bsep，Mrp2，Ntcp)和胆酸合成酶(Cyp7a1)的mRNA表达(图1A-图1D)； 

(2)当在诱导培养基中加入如cAMP（2μM）、3MC（2μM）、PB（50μM）、TCA（20μM）或VPA（1mM）的核受体激活剂时，胆酸转运体Bsep、Mrp2、Ntcp表达都提高(图1A-图1C)，而胆酸合成酶(Cyp7a1)mRNA表达在cAMP诱导下提高了4倍左右而单独使用PB或TCA的诱导作用并不明显(图1D)。 

(3)在BEI实验中(图1E和图1F)，如三明治培养、无血清培养或6星期的长期培养的培养条件以及cAMP或TCA等的诱导以及转录因子Hnf4α的转染表达，都能够显著提高CLF(Bsep底物)、D8-TCA(Bsep和Mrp2底物)的BEI(%)值，说明CLF、d8-TCA的外排增加，从而进一步说明不同培养条件和不同诱导因子对传统肝样细胞中的多种胆酸转运体的基因表达水平的影响。 

II.参见图2A-图2E，与图1类似，在图2的每幅坐标图中，第一组直方 图标(最左侧三个直方图标)表示鼠尾纤维细胞(TTF)、原代肝细胞(PriHep)和采用实施例1步骤1获得的鼠源传统肝样细胞的药物转运体的基因表达水平；第二组(中间三个直方图标)表示采用实施例1步骤1获得的鼠源传统肝样细胞分别进行三明治培养(即，仅进行实施例1的步骤1和步骤3)、无血清培养(即，进行实施例1步骤1后，采用普通培养基中撤除1%的胎牛血清的无血清培养基，培养48小时)或传统肝样细胞成熟后再进行6周的长期普通培养（即，进行实施例1步骤1后，采用普通培养基再培养6周），然后测定药物转运体的基因表达水平；第三组(最右侧6个直方图标)表示采用实施例1步骤1获得的鼠源传统肝样细胞在诱导培养基（普通培养基中分别加入各核受体激动剂2μM cAMP、2μM3MC、50μM PB、20μM TCA或1mM VPA）或者转染Hnf4α后培养3-5天，测定药物转运体的基因表达水平。 

从图2的结果可以看出： 

(1)对于传统肝样细胞，三明治培养和无血清培养能够显著提高外排转运体Pgp、Bcrp和摄取转运体Oatp1b2、Oatp1a1/4的mRNA表达。诱导剂cAMP、PB、TCA均能提高Pgp、Bcrp、Oatp1b2、Oatp1a1/4的mRNA表达，但VPA和3-MC对各药物转运体的基因表达水平影响不明显。 

(2)转录因子Hnf4α也能极大提高外排和摄取转运体的mRNA表达。另外，BEI实验结果(图2F和图2G)显示三明治培养和无血清培养以及诱导剂cAMP、PB、TCA和Hnf4α能够提高瑞舒伐他汀(Bcrp底物)和甲氨蝶呤(Bcrp底物)的BEI(5)值。 

III.参见图3A结果可见，从基因表达水平来看，实施例1获得的优化后肝样细胞中，各种所测的肝脏重要的药物转运体、胆酸转运体的表达水平极大提高，和原代肝细胞具有可比性。参见图3B结果可见，所测的核受体和外排与摄取转运体mRNA表达也显著提高。 

二、药物转运体、胆酸转运体共定位研究 

实验对象为实施例1获得的优化后肝样细胞。 

实验步骤：室温条件下，4%甲醛固定细胞1h；PBS洗涤三次，每次5min；0.25%Triton(溶于3%BSA-PBS溶液中)通透细胞，室温15min；PBS洗涤三次，每次5min；3%BSA-PBS封闭，室温1h；吸掉封闭液，加一抗P-19(鼠抗Bsep， 1:100)和M2-Ⅲ-6(鼠抗Mrp2，1:40)，4℃孵育16小时或过夜；PBS洗涤三次，每次5min；吸掉PBS后，加二抗FITC-抗鼠lgG(1:300)和TRITC-抗鼠lgG(1:400)，避光室温孵育1h；PBS洗涤三次，每次5min；吸掉PBS，加2.5%的二氮杂二环辛烷(9:1甘油/PBS配制)封闭封固并盖上盖玻片，在共聚焦激光显微镜下观察Bsep和Mrp2共定位情况。对于P-gp和Bcrp的共定位，步骤流程和Bsep、Mrp2共定位类似，只是一抗为CD44(鼠抗P-gp，1:200)和鼠抗CD338(1:100)。结果显示优化后肝样细胞中转运体有一定的共定位。 

具体地，参见图6，实施例1获得的优化后肝样细胞首次具备了和原代肝细胞类似的重要药物转运体的极化表达(例如，外排型药物转运体Bsep，Mrp2表达于胆小管侧)，这一特征在原代肝细胞中才有体现。而在目前最好的肝样细胞模型HepaRG中都没有发现这一特征(参见图4)。通过对比可以明显看出，采用本申请所述的体外培养方法获得的优化后肝样细胞明显优于现有的最好肝样细胞模型HepaRG，和原代肝细胞体外培养模型具备可比性。 

三、优化后肝样细胞的功能测定 

实验对象为实施例1获得的优化后肝样细胞。 

I.检测优化后肝样细胞是否形成有功能的胆管结构。 

实验步骤：在实施例1的步骤4后，用诱导培养基培养的第6天，一式三份的细胞用每孔1毫升的温热的加Ca²⁺或不加Ca²⁺的HBSS洗两次。洗涤后，加入1毫升的加Ca²⁺或不加Ca²⁺的HBSS，细胞在37℃下温育15分钟。从每个孔中吸出培养液，并用0.5毫升含有底物(5μM CDF，2.5μM CLF以及2.5μM d8TCA)的培养液在37℃下温育细胞10分钟。温育后，弃去培养液，用冰冷的常规PBS洗涤细胞3次。将细胞平板在-80℃储存。CDF(5-(and-6)-carboxy-2’,7’-dichloro-fluorescein，荧光素)用于检测胆管的形成，在细胞优化完成之后，细胞的形态和CDF在胆管的聚集可以分别通过相差显微镜和荧光显微镜进行评估。 

图5为在荧光显微镜下观察有无CDF聚集的图像，其中，小鼠肝脏细胞有明显的CDF聚集，传统肝样细胞无明显CDF聚集，优化后肝样细胞出现了较明显的CDF聚集，结果表明采用本申请所述的体外培养方法获得的优化后肝样细胞在体外能够形成与原代肝细胞类似的胆管结构。 

II.内在胆汁清除率（CL_b,int）的测定 

实验对象为实施例1步骤1获得的传统肝样细胞和实施例1步骤4后获得的优化后肝样细胞。 

实验步骤：在实施例1的步骤4后，用诱导培养基培养的第6天，一式三份的细胞用每孔1毫升的温热的加Ca²⁺或不加Ca²⁺的HBSS洗两次。洗涤后，加入1毫升的加Ca²⁺或不加Ca²⁺的HBSS，细胞在37℃下温育15分钟。从每个孔中吸出培养液，并用0.5毫升含有底物(2.5μM DPDPE，2.5μM d8-TCA，2.5μM瑞舒伐他汀和2.5μM甲氨蝶呤)的培养液在37℃下温育细胞10分钟，收集0分钟和10分钟培养液并冻存在-80℃冰箱，并在温育后立即用冰冷的常规PBS洗涤细胞3次，将细胞平板放在-80℃储存。 

注：内在胆汁清除率（CL_b,int）计算公式： 

CL_b,int=（A_{plus_Ca++}-A_{minus_Ca++}）/AUC_0-10min

其中A_{plus_Ca++}代表所测化合物在加Ca²⁺处理的细胞中的累积量，A_{minus_Ca++}代表所测化合物在不加Ca²⁺处理的细胞中的累积量，AUC_0-10min=温育时间×(C_m,0min+C_m,10min)/2，C_m,0min和C_m,10min分别代表所测化合物在0分钟（温育起始）和10分钟（温育时间）的浓度。 

参见图7，实验结果证明优化后肝样细胞和原代肝细胞对于药物的内在胆汁清除率（CL_b,int）有很好的相关性，说明优化后肝样细胞比未优化的肝样细胞越发接近原代肝细胞。 

III.胆汁分泌指数BEI(%)和内在胆汁清除率(CL_b,int)的测定。 

本申请的发明人还选择重要的工具药物，通过同位素法或液相串联质谱分析药物蓄积情况，计算选定药物的胆汁分泌指数BEI(%)[计算BEI的公式为BEI(%)=（A_{plus_Ca++}-A_{minus_Ca++}）/A_{plus_Ca++}×100%，其中A_{plus_Ca++}代表所测化合物在加Ca²⁺处理的细胞中的累积量，A_{minus_Ca++}代表所测化合物在不加Ca²⁺处理的细胞中的累积量]和内在胆汁清除率(CL_b,int)。(结果参见下表4) 

表4重要工具药物在不同细胞模型上胆汁分泌能力比较 

其中，传统肝样细胞为实施例1的步骤1后获得的，优化后肝样细胞为实施例1步骤4后获得的； 

以传统肝样细胞组作为对照组，对实验结果进行统计学分析(ANOVA,SPSS)； 

**代表具有极其显著性差异(p<0.01) 

四、对人源优化后肝样细胞的检测 

采用与上述类似的实验操作对实施例2获得的优化后人源肝样细胞进行药物转运体基因表达水平和BEI(%)的测定。 

从图8的结果可以看出： 

(1)实施例2获得的人源肝样细胞能够表达多种重要药物转运体，比如P-gp、MRP2、MRP3、BSEP、NTCP、OATP等，这些转运体的mRNA表达水平和人原代肝细胞(PHH)相近(图8a，mRNA水平在人肝细胞的80%左右)。 

(2)实施例2获得的人源肝样细胞具备胆汁分泌能力。化合物DPDPE、TCA和CLF在人源肝样细胞中的BEI达到原代人肝细胞的50%以上(图8b)。 

因此，无论是从基因表达还是功能角度，采用本申请所述的体外培养方法优化获得的人源肝样细胞与人原代肝细胞都具有可比性，有望成为替代人原代肝细胞的细胞株。 

基于上述实验结果，可以得出这样的结论，采用本申请所述的体外培养方法获得的优化后肝样细胞(包括多种属来源的肝样细胞)可以用于新药研发、人工肝装置种子细胞、体外肝炎细胞模型等多个科研领域。 

此外，需要说明的是，尽管在实施例中采用直接转分化技术获得了传统肝样细胞，并在此基础上进行激活和进一步的诱导培养，但是，本领域技术人员根据上述公开内容可以想到本申请所述的体外培养技术同样适用于现有技术中采用其他方法获得的其他传统肝样细胞，例如ES，iPS来源获得的肝样细胞。 

尽管本申请以小鼠成纤维细胞的体外培养和检测作为示例性实施例，但本申请所述的方法不局限于小鼠细胞产生的肝样细胞，还适用于优化由多个种属非肝脏细胞(例如，成纤维细胞)产生的肝样细胞，例如人源非肝脏细胞或大鼠源非肝脏细胞。本申请亦提供了由人源成纤维细胞产生的肝样细胞在应用本申请所述的优化培养方法之后产生良好的药物胆汁分泌指数（BEI）和基因表达水平(接近原代人肝细胞等参数)作为佐证。 

说明书中英文缩写： 

iHep，induced hepatocyte-like cell,诱导肝样细胞； 

HiHep，human induced hepatocyte-like cell，人源诱导肝样细胞； 

Hnf4α，hepatocyte nuclear factor4α，肝细胞核因子4α； 

CDF,5-(and-6)-carboxy-2’,7’-dichloro-fluorescein，荧光素底物; 

CLF,cholyl-lysyl-fluorescein，荧光素底物; 

DPDPE,[D-Pen^2,5]Enkephalin hydrate，脑啡肽; 

d8-TCA,d8-sodium taurocholate acid，同位素标记牛磺胆酸; 

TCA,taurocholic acid，牛磺胆酸; 

PB,phenobarbital，苯巴比妥; 

MTX,methotrexate，甲氨蝶呤; 

cAMP，N6,2’-O-Dibutyryladenosine3’,5’-cyclic monophosphate sodium salt，这里专指二丁酰环腺苷酸钠盐，简称为环腺苷酸； 

3-MC,3-methylcholanthrene，3-甲基胆蒽; 

VPA,valproic acid，丙戊酸; 

CL_bile,int,intrinsic biliary clearance，内在胆汁清除率; 

BEI,biliary excretion index，胆汁分泌指数; 

BA,bile acid，胆酸; 

SCMH,sandwich-culture mouse hepatocyte，三明治小鼠肝细胞培养； 

TTF,tail-tip fibroblasts，鼠尾纤维细胞; 

PriHep，primary hepatocyte，原代肝细胞； 

FBS，fetal bovine serum，胎牛血清； 

Mrp2,multidrug resistance-associated protein2，多药耐药相关蛋白2; 

Bsep,bile salt efflux protein，胆酸外排蛋白; 

Ntcp,sodium taurocholate cotransporting polypeptide，钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白； 

P-gp,p-glycoprotein，p-糖蛋白； 

Cyp7a1,cholesterol7-alpha hydroxylase，胆固醇7-羟化酶； 

PXR，pregnane X receptor，孕酮受体； 

FXR，farnesoid X receptor，法尼酯X受体； 

AhR，aryl hydrocarbon receptor，芳香烃受体； 

CAR，constitutive androstane receptor，组成型雄烷受体； 

PPARγ：peroxisome proliferator-activated receptor alpha，过氧化物酶体增殖物激活受体； 

Nrf2：NF-E2related factor-2，核因子E2相关因子2； 

ES cell，embryonic stem cell，胚胎干细胞； 

iPS cell，induced pluripotent stem cell，诱导多功能干细胞。