蜘蛛香环烯醚萜部位在制备N-型钙通道抑制剂中的应用

摘要

本发明公开了一种蜘蛛香环烯醚萜部位在制备N-型钙通道抑制剂中的应用，属于药物领域。本发明提供了蜘蛛香环烯醚萜部位在N-型钙通道抑制中的作用，并证实了蜘蛛香环烯醚萜部位中对N-型钙通道抑制发挥作用的两种环烯醚萜成分；本发明也首次发现了环烯醚萜的酸性水解产物在N-型钙通道的抑制效果；因此本发明提供了蜘蛛香环烯醚萜部位作为一种新的N-型钙通道抑制剂的广阔应用前景，能应用于疼痛等相关疾病的保健治疗。

说明书

技术领域

本发明属于药物领域，特别涉及一种蜘蛛香环烯醚萜部位在制备N-型钙通 道抑制剂中的应用。

背景技术

N-type电压依赖性钙通道主要分布于疼痛传递与调控通路的神经元突触末 梢，参与疼痛介质(如谷氨酸和P物质)的释放和调节，在疼痛传递和调控过 程中具有重要作用(国外医学药学分册,34(2),93-98)。因此，阻断N-型钙通道可 以产生镇痛作用，特别是慢性疼痛和神经病理性疼痛。使用阿片类药物虽可缓 解疼痛，但存在呼吸抑制、便秘及成瘾等副作用。因此，寻找镇痛活性高且副 作用小的新型镇痛药物日益成为人们关注的课题。N-型钙通道被抑制，去甲肾 上腺素分泌减少，小肠平滑肌舒张，肠系膜血管舒张，能够起到很好的缓解腹 部疼痛。

蜘蛛香是败酱科缬草属植物蜘蛛香Valeriana jatamansi Jones的根茎，又名 马蹄香、鬼见愁、豆菜根、九转香、雷公七、小马蹄香、臭狗药、磨脚花、老 龙须、香草子、养血莲、臭药、乌参、大救驾、老虎七等。蜘蛛香为多年生草 本植物，主要分布在我国西南地区，资源丰富，《中国药典》1977年版和2010年 版均有收录，具有理气止痛、消食止泻、祛风除湿、镇静安神的功效，常用于 腹脘胀痛、食积不化、腹泻痢疾、风湿痹痛、腰膝酸软、失眠等。蜘蛛香作为 传统药用植物，除汉族外，在我国许多少数民族地区如蒙、藏、苗、维等也均 有悠久的应用历史(中国中药杂志,37(4),2174-2177)。

蜘蛛香的化学研究结果表明，其主要化学成分为环烯醚萜类、挥发油、黄 酮等。其中环烯醚萜类成分是蜘蛛香中主要的活性成分，前人报道这类化合物 具有中枢抑制如抗焦虑、抗抑郁作用，镇静、催眠及镇痛作用等。此外，蜘蛛 香还报道有心脏抑制作用、改善肠易激作用等。但前人的这些研究结果对于蜘 蛛香具体的作用机理及相关疾病的研究开展尚少，开展蜘蛛香活性部位的水解 反应并得到活性部位的报道更少。为此，本专利发明主要围绕蜘蛛香活性成分 类型、活性单体以及酸水解蜘蛛香提取物并得到具有抑制N-type钙通道活性药 用部位展开描述。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种蜘蛛香环 烯醚萜部位在制备N-型钙通道抑制剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供蜘蛛香环烯醚萜部位酸水解产物在制药和保健 上的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：蜘蛛香环烯醚萜部位在制备N-型钙 通道抑制剂中的应用。

所述的蜘蛛香环烯醚萜部位包含如式Ⅰ所示的环烯醚萜类成分，所述的环 烯醚萜类成分占蜘蛛香环烯醚萜部总质量30％以上；

其中，R₁、R₃为异戊酰基或取代异戊酰基，R₂、R₄为异戊酰基、取代异戊 酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、取代乙酰基、取代丙酰基或取代丁酰基；

所述的取代异戊酰基、取代乙酰基、取代丙酰基和取代丁酰基中所述的取 代基团为H、乙酰基、丙酰基、丁酰基或异戊酰基中的一种。

所述的环烯醚萜类成分包括式Ⅱ所示的valtrate hydrine B8；

所述的环烯醚萜类成分包括式Ⅲ所示的valeriandoid J；

所述的蜘蛛香环烯醚萜部位优选通过以下制备方法获得：蜘蛛香乙醇回流渗 滤，回收乙醇得水混悬液，再以乙酸乙酯提取浓缩得蜘蛛香环烯醚萜部位，环烯 醚萜类成分占总质量30％以上。

所述的蜘蛛香环烯醚萜部位优选为通过以下具体制备方法获得：取蜘蛛香药 材粉末1000克，加入95％乙醇3500ml置回流装置内回流3h，冷却后滤出乙醇液， 残渣加入乙醇3000ml再次回流2h，滤出乙醇提取液合并到第一次乙醇滤液中， 得乙醇提取液约6000ml，浓缩乙醇提取液至水混悬液，加入乙酸乙酯萃取得蜘蛛 香环烯醚萜部位，环烯醚萜类成分占总质量30％以上。

所述的蜘蛛香来源于败酱科植物蜘蛛香Valeriana jatamansi Jones的干燥根 茎及根。

作为优选的实施方式，所述的蜘蛛香环烯醚萜部位通过环烯醚萜部位的酸水 解产物进行应用。

所述的酸为盐酸。

所述的蜘蛛香环烯醚萜部位酸水解产物在制药及保健上的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明提供了一种蜘蛛香环烯醚萜部位在N-型钙通道抑制中的作用，并证实了 蜘蛛香环烯醚萜部位中对N-型钙通道抑制发挥作用的两种环烯醚萜成分；本发 明也首次发现了环烯醚萜的酸性水解产物在N-型钙通道的抑制效果；因此本发 明提供了蜘蛛香环烯醚萜部位作为一种新的N-型钙通道抑制剂的广阔应用前 景，能应用于疼痛等相关疾病的保健治疗。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于 此。

实施例1

本实施例提供了一种蜘蛛香环烯醚萜部位的制备方法，步骤如下：

取蜘蛛香药材粉末1000克，加入95％乙醇3500ml置回流装置内回流3h， 冷却后滤出乙醇液，残渣加入乙醇3000ml再次回流2h，滤出乙醇提取液合并到 第一次乙醇滤液中，得乙醇提取液约6000ml，浓缩乙醇提取液至水混悬液，加 入乙酸乙酯萃取得蜘蛛香环烯醚萜部位，该蜘蛛香环烯醚萜部位能有效抑制N type钙通道。所述的蜘蛛香环烯醚萜部位加入适当赋形剂、粘合剂、崩解剂压 制成片，得片剂1000粒。

实施例2

本实施例提供了一种环烯醚萜部位的水解产物获取方法，具体步骤如下：

上述实施例1中所得蜘蛛香环烯醚萜部位，加入0.01M的盐酸水溶液1000ml 混溶，旋转搅拌反应1h，停止反应后即用0.01M的NAOH中和至PH＝7，再以 乙酸乙酯萃取，浓缩得环烯醚萜部位的水解产物，该水解产物能有效抑制N type 钙通道。

实施例3

实施例1中蜘蛛香环烯醚萜部位的活性物质鉴定验证

上述实施例1中所得蜘蛛香环烯醚萜部位，取50g用100g硅胶(200-300 目)拌样，上10倍量硅胶柱(0.5kg，200-300目)，流动相为石油醚:丙酮＝50:1～0:1， 洗脱得7个组份(Fr 1-7)。组份4(Fr.4，2.8g)继续以硅胶柱层析(石油醚：丙酮＝ 20:1～1:1梯度洗脱)，得4个组份(sub Fr.4.1～4.4)。其中第二个亚组份(sub Fr.4.2， 0.8克)经MCI胶(60％～90％甲醇梯度洗脱)、凝胶sephadex LH-20(甲醇)、反相 ODS(甲醇:水＝50:50～90:10)纯化得到化合物valeriandoid J(化合物1，如式Ⅱ 所示，5mg)。组份6(Fr.6，5.3g)用近似方法得到valtrate hydrine B8(化合物2， 如式Ⅲ所示，0.23克)。这两个环烯醚萜单体具有很好的N type钙通道抑制活性。

实施示例4

实施例1～3获得产物的N-型钙通道抑制活性验证

将实施例1～3获得的蜘蛛香环烯醚萜部位、环烯醚萜部位的酸水解产物以 及分离得到的化合物1(valeriandoid J，简写为zjv27)和化合物2(valtrate hydrine  B8，简写为zjv31)进行N type钙通道抑制活性筛选，所得结果如表1所示：

表1各提取物的N-型钙通道抑制活性检测结果

编号 名称 浓度 抑制率 1 蜘蛛香环烯醚萜部位 0.01mg/ml 35％ 2 环烯醚萜部位的酸水解产物 0.01mg/ml 84％ 3 valeriandoid J(化合物1) 10um 48％ 4 valtrate hydrine B8(化合物2) 10um 47％

由表1中结果可以看出，蜘蛛香环烯醚萜部位、环烯醚萜部位的酸水解产 物以及分离得到的化合物1和化合物2对N-型钙通道均具有较高的抑制活性， 其中，环烯醚萜部位的酸水解产物的抑制活性最高，达到84％的抑制率。

将所得蜘蛛香环烯醚萜部位、酸水解产物以及分离得到的化合物zjv27和 zjv31进行N type钙通道抑制活性筛选，实验过程如下：

蛙卵制备：

在室温条件下，解剖非洲爪蟾的腹中下部，取出卵巢，并剪成4～4mm的小 块，放于OR2(82.4mM NaCl，2.5mM KCl，1mM MgCl₂，and 5mM hepes， PH 7.6with NaOH)含有一定浓度的胶原蛋白酶A，随后摇床上以180rmp的速 度消化2～3h，得到独立的去除了卵黄膜的IV-V期大小均一的蛙卵，用ND96(96 mM NaCl，2.5mM KCl，1mM MgCl₂，5mM Hepes，1.8mM CaCl₂，100units/mL penicillin，and 100μg/mL streptomycin，PH 7.6with NaOH)液中清洗，并放于 18℃恒温培养箱中待用。

mRNA的注射及培养：

通过分子生物学方法体外合成N type钙通道的mRNA，然后利用显微注射 仪以50.6nl的注射量注射入蛙卵，并将其放于18°培养箱中培养3～4天。

化合物及初提物的活性测试：

经培养3～4天后，蛙卵细胞膜上有N type钙通道的电流表达，利用双电极电 压钳测试化合物及初提物对N type钙通道的作用。测试的具体步骤如下：

1、在室温的条件下，将卵放在测试浴槽中，将电压电极及电流电极轻轻破 膜插入蛙卵，造成电极与蛙卵胞质相通。其中电极的电阻在0.3～1兆欧之间。浴 槽里放入记录N type钙通道的钡离子溶液(50mM NaOH,2mM KCl,5mM Hepes,1.8mM BaCl₂,40mM Ba(OH)₂.用甲烷磺酸调PH至7.4，溶液需过滤后 使用。)

2、快速钳制，钳制电压为-80mv，采样频率为10kHz，低频滤波为10kHz， 记录电压-30mv至70mv，间隔为10mv，记录时长为50ms，得到N type钙通 道电流。

3、将初提物用乙醇提取并用乙酸乙酯萃取后得到蜘蛛香环烯醚萜部位，0.01 mg/ml对N type钙通道在20mv时的抑制率为48％；将环烯醚萜部位用HCl水 解1h后得到酸水解产物，0.01mg/ml对N type钙通道在20mv时的抑制率为 67％。

4、分离得到的两个化合物zjv 27和zjv 31在10μM时对N type钙通道的 抑制率分别为48％和47％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。