4,4’-联吡啶桥联四核铂配合物在制备抗端粒酶阴性肿瘤药物中的应用

摘要

本发明公开了4,4’-联吡啶桥联四核铂配合物在制备抗端粒酶阴性肿瘤药物中的应用，能够有效抑制端粒酶阴性肿瘤细胞的增殖。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及4,4’-联吡啶桥联四核铂配合物在制备抗端粒酶阴性肿 瘤药物中的应用。

背景技术

端粒(telomere)是真核生物染色体末端的一种特殊结构，由重复单位的DNA及结合其 上的蛋白质组成，其作用是保持染色体结构和功能的完整性。伴随着细胞每一次分裂，端粒 都会缩短一点。正常人类细胞的端粒缩短到一定程度后，细胞就会凋亡，从而失去分裂增殖 能力。大约80％的癌细胞通过表达端粒酶(telomerase)维持端粒长度的稳定，获得无限分裂 的能力；另外大约20％的癌细胞不表达端粒酶(端粒酶阴性肿瘤细胞)，它们通过被称为ALT (Alternative Lengthening of Telomeres)的旁路途径机制延伸端粒，从而维持端粒长度。由于 端粒酶在人类的正常组织细胞中不存在，它是特异的抗癌靶标。端粒酶阴性肿瘤的特征包括： 占人体肿瘤细胞的20％左右；该肿瘤细胞缺乏(或检查不到)端粒酶活性；该肿瘤细胞采用 ALT(Alternative Lengthening of Telomeres)机制延伸端粒；该肿瘤细胞中富含环状的端粒 DNA(C-Circle DNA或T-Circle DNA)；在绝大部分的该肿瘤细胞中有可观察到的APB (Associated Promyelocytic leukaemia Body)。

越来越多的研究表明，采用ALT机制的癌细胞具有更强的侵润、转移能力，目前对该类 癌症的治疗成功率极低，急需开发针对ALT肿瘤的治疗药物及方法。另外，最新的研究表明， 靶向端粒酶的药物可以让肿瘤细胞激活ALT机制，因此，抑制ALT机制也是以端粒酶为靶 标的癌症治疗的内在需求和终极方案。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效抑制端粒酶阴性肿瘤细 胞增殖的途径。

为此，本发明提供了以下式(I)的4,4’-联吡啶桥联四核铂配合物在制备抗端粒酶阴性肿 瘤药物中的应用：

以上式(I)化合物为已知的，阴离子为硝酸根(NO₃^-)离子，具有极高的水溶性，热稳定 性良好。

根据本发明所述的应用，所述端粒酶阴性肿瘤为骨肉瘤。

根据本发明所述的应用，所述药物含有药学上可接受的载体或赋形剂。

实验证明，式I化合物4,4’-联吡啶桥联四核铂配合物对于多种端粒酶阴性肿瘤细胞，包 括但不限于例如人骨肉瘤等，均有显著抑制肿瘤细胞增殖的效用。

附图说明

图1为细胞增殖曲线。

图2为β-半乳糖苷酶染色实验结果。

图3为流式细胞法检测细胞凋亡的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的应用范围。

本实施例中，以人骨肉瘤为例说明式I化合物(4,4’-联吡啶桥联四核铂配合物)在抑制 端粒酶阴性肿瘤细胞增殖方面的效用，但应理解的是，虽然仅以人骨肉瘤为例说明其用于制 备抗端粒酶阴性肿瘤的药物的用途，但本发明所称的“端粒酶阴性肿瘤”细胞指缺乏(或检 查不到)端粒酶活性、不表达端粒酶的肿瘤细胞，包括但不限于例如人骨肉瘤、胶质瘤等。 实验证明，式I化合物(4,4’-联吡啶桥联四核铂配合物)对于多种端粒酶阴性肿瘤细胞，包 括但不限于例如人骨肉瘤等，均有显著抑制肿瘤细胞增殖的效用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

肺纤维母(MRC-5，正常细胞)细胞株、人宫颈癌(HeLa、端粒酶阳性)细胞株、人骨肉瘤 (U2OS和SAOS2、端粒酶阴性)细胞株购自中国典型物种保藏中心(CTCC)。

1.2 实验方法

1)将MRC-5、HeLa、U2OS和SAOS2细胞分别接种于10cm²的细胞培养皿中，接种密 度为1×10⁶/皿，等细胞6小时贴壁后，小心换掉培养基，加入10mL含有相应浓度式I化合 物(4,4’-联吡啶桥联四核铂配合物)的培养基或者等体积的含0.1％DMSO的培养基。该操 作每隔2天重复一次。

2)增殖过程中，每次传代时均需使用细胞计数器对每皿细胞进行计数，然后再从中取部 分细胞重新接种，接种密度仍为1×10⁶/皿，直到培养皿中细胞总数<1×10⁶个无法接种为止。

3)取增殖结束的细胞分别进行β-半乳糖苷酶染色实验以及流式细胞凋亡实验。

4)β-半乳糖苷酶染色实验：a)细胞培养终止后，直接倒掉培养基，然后用1×PBS润洗 3遍；b)往细胞中加入固定液，常温下固定15min；c)弃去固定液后，再用1×PBS润洗3 遍，每次5min；d)具体的染色操作过程按照碧云天的X-gal染色试剂盒上提供的方法进行 操作；e)加入染色液，37℃并隔离CO₂孵育过夜；f)染色结束后，继续用1×PBS润洗3遍， 将细胞置于10×显微镜下观察、照相。

5)流式细胞凋亡实验：a)收集好所有的细胞(包括浮起来的细胞)，贴壁的细胞用0.25％ 胰蛋白酶消化法收集，离心，并用1×PBS润洗2遍，弃去上清液，保留沉淀(细胞)；b)收 集好的细胞用Fluor 488annexin V and PI进行双染，具体的染色操作过程按照Alexa 488annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit试剂盒上提供的方法进行操作；c)染色好后的 细胞悬浮液直接用流式细胞仪进行测试，实验数据由FlowJo软件进行处理拟合。

2 结果

2.1 细胞增殖曲线

细胞培养第32天时，4个细胞的增殖曲线如图1所示。实验结果表明，多个浓度的配合 物(式I化合物4,4’-联吡啶桥联四核铂配合物)并不会对正常细胞(MRC-5)及端粒酶阳性 细胞(HeLa)的增殖造成影响，但是却可以显著的降低端粒酶阴性细胞(U2OS和SAOS2) 的增殖。

2.2 β-半乳糖苷酶染色实验

细胞衰老时β-半乳糖苷酶SA-β-Gal活性水平上升，通过检测细胞内β-半乳糖苷酶的水平 (Senescenceβ-Galactosidase Staining)能迅速确定衰老细胞的数量。如图2所示，端粒酶阴性的 人骨肉瘤(SAOS2)细胞在经过化合物(式I化合物4,4’-联吡啶桥联四核铂配合物)处理后 出现了明显的衰老现象。

2.3 流式细胞法检测细胞凋亡

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早 期，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧，因此可以通过检测细胞外表面PS 的存在确定细胞是否处于细胞凋亡早期。Annexin V与PS有高度亲和力，可用于确定凋亡细 胞的数量。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋 亡细胞的完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞，PI能够穿过细胞膜并使细胞核染色。将 Annexin V与PI匹配使用，就可鉴定出处于不同凋亡时期的细胞。在双变量流式细胞仪的散 点图上，左下象限显示活细胞，右下象限为早期凋亡细胞，左上象限是中期凋亡细胞，右上 象限是凋亡晚期细胞。

由以上实验结果可见，式I化合物4,4’-联吡啶桥联四核铂配合物能够有效抑制端粒酶阴 性肿瘤细胞的增殖，抑制肿瘤生长，可用于制备有效抗端粒酶阴性肿瘤的药物。