基于内吗啡肽2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型杂交肽及其合成方法和应用

摘要

本发明提供了基于内源阿片肽内吗啡肽2和神经肽FF受体拮抗剂RF9通过Lys化学连接而构建的分叉型杂交肽EKR和RKE。体外功能性检测表明：EKR和RKE都能激活Mu阿片受体，均为阿片类激动剂；体内活性检测发现，侧脑室注射EKR和RKE都能引起显著的中枢镇痛活性，其镇痛作用的EC50值分别为6.127(5.372，6.989)nmol和4.523(4.043，5.058)nmol，并且在有效镇痛剂量范围内(5，10，20nmol)，侧脑室注射EKR和RKE都不引起阿片类镇痛药物常见的便秘副作用。因此，EKR和RKE能介导低副作用的镇痛活性，具有用于临床疼痛治疗的潜在应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生化技术领域，涉及一类基于内源阿片肽——内吗啡肽2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型杂交肽及其合成方法。本发明同时还涉及上述分叉型杂交肽EKR和RKE在受体激动、痛觉调节、耐受和成瘾、便秘等方面的药理学活性。

背景技术    

疼痛在临床医学治疗和病人生活质量提高等方面都具有重要意义。目前，临床最广泛应用的阿片类镇痛药物常伴随一些副作用，如镇痛耐受、便秘和成瘾等，从而大大限制了其临床应用。因此，研究和开发低副作用的高效镇痛新药具有广阔的应用前景。

研究表明，在保持阿片药物镇痛活性的同时有效减少其副作用的策略主要有以下三种：一、以其母体为模板，通过化学修饰来筛选出受体选择性较高和具有优势构象的类似物，从而达到保持较高生物活性并降低其副作用目的，如高选择性阿片类配体的筛选。二、通过阿片类物质与其它药物的联合使用，使它们发挥镇痛增效作用，从而降低阿片药物的给药剂量来减少其副作用，如大麻和阿片的联合注射 (Pain, 2003, 303:308)。三、基于阿片肽与其它系统的配体而构建全新的多靶标药物，使其同时作用于多个作用位点，在发挥阿片镇痛活性的同时通过其他系统的调节作用来降低其副作用。目前，人们在阿片类嵌合肽研究方面已取得了一定的进展，如内吗啡肽2（EM-2）和速激肽P物质构成的杂合肽ESP7 (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A, 2000, 97:7621) 、基于EM-2和NPFF的嵌合肽EN-9（ZL201110097843.4）和基于阿片肽Biphalin和神经肽FF的嵌合肽BN-9（ZL201210098832.2）。

众所周知，EM-2是从哺乳动物脑内提取到的内源性阿片肽之一，其对Mu阿片受体具有极高的选择性和亲和性，同时又能激活Kappa阿片受体 (Nature , 1997, 499:502)。而神经肽FF被认为是内源的阿片调节肽 (Curr. Top. Med. Chem, 2005, 5:341)。NPFF在不同水平的注射表现出或原阿片或抗阿片的活性 (Eur. J. Pharmacol. 1998, 167:172)。尤其是NPFF系统在阿片的耐受和成瘾方面具有显著的调节作用，如NPFF系统的选择性拮抗剂RF9能完全抑制长期使用阿片类引起的痛觉过敏和阻止伴随的镇痛耐受的产生 (Proc Natl Acad Sci U. S. A. 2006, 466:471和Br J Pharmacol. 2012, 165:424)。在以上研究基础上，本实验室基于EM-2与RF9而构建全新的分叉型杂交肽，以期同时具有阿片受体激动剂和NPFF拮抗剂的药理学功能，这样可能在保持EM-2镇痛活性的同时尽量减少其阿片耐受等副作用。

发明内容

本发明的主要目的是针对现有镇痛药物中存在的问题，提供一种副作用低、镇痛效果好的基于内源阿片肽EM-2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型杂交肽EKR和RKE；

本发明的另一目的是提供上述分叉型杂交肽EKR和RKE的合成方法。

本发明还有一个目的，就是提供上述分叉型杂交肽EKR和RKE在受体激动、痛觉调节、耐受和成瘾、便秘等方面的药理学活性，以期在制备镇痛药物中得到应用。

（一）基于内源阿片肽EM-2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型杂交肽

本发明基于内源阿片肽EM-2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型杂交肽EKR和RKE，是以内源阿片肽EM-2和神经肽NPFF系统的拮抗剂RF9为化学模板，以Lys作为化学连接子而构建的分叉型杂交肽。其结构为下式结构之一：

（二）基于阿片肽内吗啡肽2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型杂交肽的合成

分叉型杂交肽的合成方法，包括以下工艺步骤：

. EKR、RKE的合成

.树脂预处理

Rink-Amide-MBHA树脂在二氯甲烷中搅拌，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂；

.脱除Fmoc基团保护

在溶胀、抽干溶剂的树脂中，加入六氢吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)、DMF的混合溶液，搅拌反应5 min后抽干，重复3次；最后加入DMF洗涤，茚检，得到脱除Fmoc基团保护的树脂；

所述混合溶液中，六氢吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、DMF的体积比为1:1:98。

. 连接子Lys的缩合

依次将N-(9-芴甲氧羰酰基)-N'-甲基三苯甲基-L-赖氨酸（Fmoc-Lys(Mtt)-OH）、N-羟基苯并三氮唑（HOBt）、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐（HBTU）完全溶解于DMF中，再加入二异丙基乙胺（DIEA）后混匀得混合溶液；然后加至步骤.所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60 min，抽干溶剂；用DMF重复洗涤、抽干，茚检后按步骤.的工艺脱除Fmoc基团保护，得到脱除Fmoc保护基团的肽树脂。

Fmoc-Lys(Mtt)-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐以等摩尔完全溶解于DMF中。

二异丙基乙胺的摩尔量为N-(9-芴甲氧羰酰基)-N'-甲基三苯甲基-L-赖氨酸量的2倍。

N-(9-芴甲氧羰酰基)-N'-甲基三苯甲基-L-赖氨酸量为脱除Fmoc基团保护的树脂摩尔量的2~4倍。

.主链延长

ERK的主链延长：将步骤.所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤.、步骤.的工艺依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH和Boc-Tyr(tBu)-OH的缩合和脱Fmoc基团保护，并保留Boc-Tyr(tBu)-OH的Boc保护基团，得到肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe- Phe-Lys(Mtt)-Resin。

RKE的主链延长：将步骤.所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤.、步骤.的工艺依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、1-金刚烷酸的缩合和脱Fmoc基团保护，得到肽树脂1-金刚烷酰基化-Phe-Arg(Pbf)-Lys(Mtt)-Resin。

.  Lys侧链Mtt保护基团的脱除

将步骤.得到的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys(Mtt)-Resin或1-金刚烷酰基化-Phe-Arg(Pbf)-Lys(Mtt)-Resin抽干溶剂后，加入体积浓度1%~1.5%的TFA/DCM溶液，搅拌90~120s后抽干，重复50次；最后加入DMF冲洗，得到脱除Lys侧链Mtt基团保护的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe- Phe-Lys-Resin或1-金刚烷酰基化-Phe-Arg(Pbf)-Lys-Resin。

.  侧链延长

EKR侧链延长：将步骤.所得肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys-Resin按步骤.、步骤.的工艺依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、1-金刚烷酸的缩合和脱Fmoc基团保护，得到的肽树脂为Lys侧链连有1-金刚烷酰基化-Phe-Arg(Pbf)-结构的Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys-Resin。

RKE侧链延长：将步骤.所得肽树脂1-金刚烷酰基化-Phe-Arg(Pbf)-Lys-Resin按步骤.、步骤.的工艺依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH和Boc-Tyr(tBu)-OH的缩合和脱Fmoc基团保护，得到的肽树脂为Lys侧链连有Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-结构的1-金刚烷酰基化-Phe-Arg(Pbf)-Lys-Resin。

. EKR和RKE的肽链从树脂上的切割

将步骤.所得肽树脂用DCM、MeOH交替洗，充分抽干溶剂后，加入切割剂，于室温下切割反应2~3小时；过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的乙醚析出沉淀；吸出上清液弃之，加水充分溶解沉淀后将乙醚从水相中分离除去，水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末。

所述切割剂是由三氟乙酸、三异丙基硅烷、水以95:2.5:2.5的体积比混合形成的溶液；

切割剂的加入量为每克肽树脂加入10~25ml的切割剂。

. EKR和RKE的脱盐和纯化

以体积浓度15~20%乙酸溶液为流动相，过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱；利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得脱盐的肽化合物；再用反相高效液相色谱柱对脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰。

上述合成的EKR和RKE的质谱和色谱分析检测结果如表1所示：

注：体系1：梯度洗脱体系1为：10-100% 乙腈/水(0.1% TFA) (30 分钟完成)，流速为：1 mL/min，检测波长为220 nm，分析色谱柱为：XBridge ^TM BEH 130 Prep C₁₈，4.6 mm×250mm；体系2：梯度洗脱体系2为：10-80%乙腈/水(0.1% TFA) (30 分钟完成)，流速为：1 mL/min，检测波长为220 nm，分析色谱柱为：XBridge ^TM BEH 130 Prep C₁₈，4.6 mm×250mm。

通过质谱结果分析说明，所合成的分叉型杂交肽EKR和RKE与设计的化合物结构一致。色谱检测结果表明，所合成的分叉型杂交肽EKR和RKE在两种不同体系的梯度洗脱时，在体系1中的保留时间分别为18.585和18.596分钟；在体系2中的保留时间分别为21.272和21.375。

（三）分叉型杂交肽EKR和RKE的活性实验

下面通过体外和在体实验说明本发明的分叉型杂交肽EKR和RKE在受体激动、痛觉调节、耐受和成瘾、便秘等方面的药理学活性。

分叉型杂交肽EKR和RKE在盐水中不能充分溶解，以下实验中所用的溶解试剂体积比为二甲基亚砜:聚氧乙烯蓖麻油:水=1:1:18的混合溶剂。空白对照组为以上混合溶剂。

1、体外cAMP功能检测实验

稳定表达Mu、Delta和Kappa阿片受体的HEK293细胞中，EKR和RKE对Forskolin引起的细胞内环磷酸腺苷 (cAMP) 的积累的调节来检测EKR和RKE对三种受体的激动活性。

（1）cAMP功能检测实验方法

稳定表达Mu、Delta和Kappa阿片受体的HEK293细胞接种于24孔板中，每孔12万个细胞，培养24小时。实验开始时，吸出培养基，每孔加入500 μl预热的含1 mM IBMX的无血清培养基，37 ℃孵育10 min。然后，每孔再加入待测药物与10 μM forskolin（终浓度）各10 μl，37℃共孵育30 min。孵育结束后，将每孔中的溶液全部吸出，每孔加入500μl 0.2 N盐酸，室温下孵育30 min以裂解细胞。裂解完成后，每孔加入10 N的NaOH 溶液10 ul中和用于裂解的盐酸溶液，将每孔中的溶液用移液枪吹打均匀后转移到离心管中，12000 rpm离心2 min。每管吸取50μl的上清液至干净的离心管中，再加入100 μl 60 ug/μl的PKA，而空白对照组中加入100 μl TE cAMP缓冲液。以上离心管中每管再加入50 μl 0.5 μCi [H³]cAMP，迅速混匀后，4 ℃孵育大于2小时。孵育结束后，每管再加入100 μl活性炭悬浮液，涡旋震荡均匀后冰浴放置1 min，5000 rpm离心4 min。每管吸取离心后的上清液200 μl加入到24孔板中，每孔再加入700 μl闪烁液，之后用胶膜封闭24孔板，放置3小时后将其置于闪烁仪上测量。

（2）计算cAMP的抑制值

cAMP的抑制效应用药物对Forskolin诱导的胞内cAMP积累的抑制百分比 (% control)表示，% control =( Forskolin处理的cAMP含量-待测药物与Forskolin共处理的cAMP含量)/ (Forskolin处理的cAMP含量-溶剂处理的cAMP含量)。相关的% control数据用平均值±标准误（Means ± S.E.M.）表示。药物剂量效应关系用非线性回归模型统计，利用统计软件GraphPad Prism 5.0版本，分别绘制了EKR和RKE在体外cAMP功能检测中的量效曲线。实验结果见图1和图2。

在稳定表达Mu阿片受体的HEK293细胞系中，EKR和RKE都能够剂量依赖地抑制forskolin引起的cAMP积累，其EC₅₀分别为4.63（2.08-10.26）μM和2.91（1.35-6.27）μM。说明EKR和RKE对Mu阿片受体都具有激动活性。在稳定表达Delta阿片受体的HEK293细胞系中，只有EKR能激活Delta阿片受体，剂量依赖地抑制forskolin引起的cAMP积累，其EC₅₀为3.56（1.27-9.99）μM。EKR和RKE对Kappa阿片受体都没有激动活性。

2、EKR和RKE的镇痛实验

通过侧脑室注射药物后，利用小鼠光热甩尾实验进行在体痛觉调节活性的检测和比较，以吗啡作为阳性对照药物组。

（1）小鼠的侧脑室给药

侧脑室水平痛觉检测实验用小鼠，需提前进行小鼠的侧脑室埋管手术，以保证药物注射位点的准确性。利用脑立体定位仪进行小鼠的侧脑室埋管。昆明系雄性小鼠，体重21±2 g；脑立体定位仪为江湾I型。小鼠用戊巴比妥钠麻醉（i.p，80mg/kg小鼠体重）后，将小鼠头部手术区剪去毛发，置于脑立体定位仪上固定后，手术区用碘伏消毒，沿矢状缝切开头皮，露出颅骨，找到前囟位置。从前囟向后3 mm，向左/右1 mm，即为侧脑室的上方位置。自制不锈钢管（24-gauge的一段，上面接一小段PE-10管）按上述位置向下插入3 mm，即为侧脑室。一段不锈钢琴弦（28-gauge）插入到上述钢管中，以防止脑脊液外溢和外界杂物感染及堵塞钢管。用医科牙托粉和胶水固定钢管，凝固后，缝合伤口。手术后，小鼠恢复4天，第5天开始后续实验。实验中涉及到的手术器械、不锈钢管等均需在手术前消毒。药物溶解在生理盐水中，在-20℃保存，使用前解冻。

（2）痛觉检测实验

使用昆明系雄性小鼠，利用光热甩尾仪来检测药物对痛觉作用的影响。环境温度控制在22±1 ℃，实验动物可自由进食、饮水。小鼠侧脑室每次注射4 μl药物。给药前先测定基础甩尾潜伏期（3-5秒），过于敏感或迟钝的小鼠弃去不用。记录给药之后第5，10，15，20，30，40，50，60分钟的甩尾潜伏期。为防止烫伤，将10秒设为最长甩尾潜伏期，甩尾时间超过10秒均以10秒来计。

（3）计算药物镇痛作用的MPE和EC₅₀值

痛觉调节作用利用最大可能效应MPE（maximum possible effect）值来评价，MPE（％）＝ 100×[(给药后的痛阈－基础痛阈)/(10秒－基础痛阈)]。相关的MPE数据用平均值±标准误（Means ± S.E.M.）表示，不同药物浓度处理的组间差异用单因素方差分析（one-way ANOVA的Dunnett检验）来进行数据的统计和分析，^***P < 0.001 表示药物处理组的MPE值与生理盐水组之间存在显著性差异。实验结果见图3、4。

EC₅₀值表示药物产生50%最大镇痛效应时的药物剂量。利用统计学软件GraphPad Prism 5.0版本，分别绘制了EKR和RKE在侧脑室给药时的最大镇痛效应时间点的MPE（％）值的量效曲线（见图5），并计算出它们在侧脑室注射诱导镇痛的EC₅₀值和95%的置信区间，相关数据如表2所示：

溶剂组为空白对照组，侧脑室注射EKR和RKE的药物浓度均分别为2.5、5、10和20 nmol。每组动物数均为8只。如图3所示，小鼠侧脑室注射EKR能剂量依赖地产生镇痛作用。EKR在脊髓以上水平的镇痛作用能持续50分钟，并在药物注射后15分钟达到最大镇痛效应。同样，侧脑室注射RKE也能引起剂量依赖的镇痛作用，该作用在药物注射后15分钟达到最强，并能持续50分钟（如图4所示）。结果表明，EKR和RKE在侧脑室注射时诱导较强的中枢镇痛活性。

3、EKR和RKE的镇痛耐受实验

小鼠侧脑室连续八天注射药物，利用光热甩尾法检测它们的镇痛耐受现象，进一步探讨本发明的化合物EKR和RKE在镇痛耐受方面的药理学活性，并比较它们与吗啡在镇痛耐受方面的不同。

（1）小鼠的痛觉耐受实验方法

昆明系雄性小鼠，侧脑室连续注射药物八天，每天注射一次，利用光热甩尾仪来检测药物连续注射对痛觉作用的影响。环境温度控制在22±1 ℃，实验动物可自由进食、饮水。小鼠侧脑室每次注射4 μl药物。第一天药物注射前测定基础甩尾潜伏期（3-5秒），过于敏感或迟钝的小鼠弃去不用。实验中记录给药之后相关药物最大镇痛效应时间点的甩尾潜伏期，如侧脑室注射EKR和RKE的记录时间点为给药后15分钟；空白溶剂对照组与吗啡及EKR和RKE的时间记录保持一致，吗啡为30min时间点，EKR和RKE为15min时间点。为防止小鼠尾巴烫伤，将10秒设为最长甩尾潜伏期。

（2）耐受实验数据统计

实验数据用MPE（maximum possible effect）表示，MPE（%）＝100×[(给药后的痛阈－基础痛阈)/(10秒－基础痛阈)]。药物的镇痛耐受作用利用相关药物最大镇痛效应时间点的MPE值来进行比较。MPE数据用平均值±标准误（Means ± S.E.M.）来表示，小鼠八天镇痛作用的差异用单因素方差分析（one-way ANOVA的Bonferroni检验）进行统计， ^***P < 0.001表示与第一天注射此药物的镇痛作用相比有显著性差异。实验结果如图6-8所示。

每组小鼠为8只，溶剂组为空白对照组，侧脑室注射EKR和RKE的药物剂量分别为较高的剂量，即10和20 nmol，而吗啡为与EKR和RKE有相当镇痛作用的2和4nmol。图6-8的实验数据表明，小鼠侧脑室连续八天注射空白对照溶剂后，小鼠都不产生镇痛活性。与空白溶剂对照组相比，第一天侧脑室注射各种剂量的EKR、RKE及吗啡后都显著地延长了小鼠的甩尾潜伏期。在小鼠侧脑室连续注射EKR和RKE八天的过程中，镇痛作用MPE（%）值从第五天开始出现了显著下降，并持续至第八天。与第一天相比，第五天至第八天的差异性均为极显著（如图6、7所示）。但是，对照组吗啡在给药后的第四天就开始产生耐受作用，并在连续注射八天的过程中，吗啡镇痛耐受的进程急速，至第八天时其镇痛作用基本消失（如图8所示）。而相对来说，EKR和RKE镇痛耐受的进程较为缓慢，从第五天起才开始出现镇痛耐受现象，并在第八天仍保持50%左右的镇痛作用（与第一天相比较）。

上述实验结果表明，与吗啡相比，EKR和RKE的镇痛耐受进程缓慢，并且在连续注射的第8天仍保持近50%的镇痛活性。因此，EKR和RKE的镇痛耐受副作用低于吗啡，具有临床疼痛治疗应用的潜在价值。

4、EKR和RKE胃肠运动调节作用的检测

（1）小鼠的在体胃肠运动检测方法

昆明系雄性小鼠，体重20 ± 2 g。侧脑室埋管恢复4天后用于胃肠运动检测。在体胃肠运动检测选用常用的碳粉检测法（Peptides，2000，21: 295）。具体的实验过程为：胃肠运动实验前小鼠禁食16小时（禁食期间可随意饮水），然后侧脑室注射药物，15分钟后将预先准备好的活性炭悬浮液（一种含5%活性炭和10%阿拉伯树胶的生理盐水悬浮液）以每10克体重0.1 ml的体积经口灌注到胃。活性炭悬浮液灌注30分钟后，颈部脱臼处死动物，然后仔细地取出从幽门到盲肠段的动物小肠。测量幽门到盲肠的小肠总长度以及活性炭悬浮液移动的最远距离。

（2）在体胃肠运动实验数据统计

胃肠运动实验结果用胃肠运动百分比来评价，每只小鼠的胃肠运动百分比通过活性炭悬浮液移动距离除以小肠总长度之后的百分比来计算。相关的数据用胃肠运动百分比的平均值±标准误（Means ± S.E.M.）来表示，不同药物浓度处理的组间差异用单因素方差分析（one-way ANOVA的Bonferroni检验）进行数据统计和分析。实验结果如图9所示。

在图9中，溶剂组为空白对照组，EKR和RKE的药物浓度分别为5、10和20nmol，每组小鼠数为8-10只。实验结果表明，空白溶剂对照组的胃肠运动百分比为64%，侧脑室注射5、10和20nmol的EKR的胃肠运动百分比分别为76%、68%和58%。而侧脑室注射5、10和20nmol的RKE的胃肠运动百分比分别为75%、70%和53%。与溶剂组相比，EKR和RKE对小鼠的胃肠运动几乎无影响。因此，在有效镇痛剂量范围内，EKR和RKE无便秘的副作用。

综上所述，本发明分叉型杂交肽EKR和RKE具有较强的中枢镇痛活性，并具有中枢副作用较低的优点，即在有效镇痛剂量范围内，基本无便秘的副作用，且镇痛耐受进程缓慢。因此，在高效、低副作用镇痛药物制备中有潜在的应用价值。

附图说明

图1为体外EKR和RKE对表达Mu阿片受体的HEK293细胞中Forskolin诱导的cAMP积累的抑制作用；

图2为体外EKR对表达Delta阿片受体的HEK293细胞中Forskolin诱导的cAMP积累的抑制作用；

图3为小鼠侧脑室注射EKR所产生的剂量依赖性镇痛作用的时效曲线；

图4为小鼠侧脑室注射RKE所产生的剂量依赖性镇痛作用的时效曲线；

图5为小鼠侧脑室EKR和RKE所产生的镇痛作用的量效曲线；

图6为小鼠连续八天侧脑室注射EKR所引起的镇痛作用的变化；

图7为小鼠连续八天侧脑室注射RKE所引起的镇痛作用的变化；

图8为小鼠连续八天侧脑室注射吗啡所引起的镇痛作用的变化；

图9为小鼠侧脑室注射EKR和RKE对胃肠运动的影响。

图10为EKR的合成路线图

图11为 RKE的合成路线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明中基于阿片肽内吗啡肽2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型杂交肽EKR和RKE的合成方法作进一步说明。

仪器：高效液相色谱仪（HPLC）为Waters公司的Delta 600；分析柱：XBridge ^TM BEH 130 Prep C₁₈，4.6 mm×250mm；制备柱：XBridge ^TM BEH 130 Prep C₁₈，19 mm×250mm。质谱仪为Mariner ESI-TOF MS, Applied Biosystems, CA。手动固相多肽合成仪，由本实验室设计后由玻璃工制作（合成仪的设计原理具体参考Chen WC和White PD所编的《Fmoc solid phase peptide synthesis》中第14页图4，并在其基础上作了部分改进，即用以机械搅拌方式替代鼓氮气法，从而达到反应溶液充分混合的目的）。试剂：树脂为Rink-Amide-MBHA-Resin（1% DVB，200 ~400 mesh，取代值S = 0.4mmol/g resin），购自天津南开和成公司。N-α-Fmoc/ N-α-Boc保护的氨基酸（Fmoc-Aa/Boc-Aa）、N-羟基苯并三氮唑（HOBt）、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐（HBTU）、二异丙基乙胺（DIEA）和三异丙基硅烷（TIS）购自吉尔生化（上海）有限公司。1-金刚烷酸（Aca）为本实验室合成。茚三酮为上海试剂三厂产品。二氯甲烷（DCM）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、六氢吡啶（哌啶）、甲醇（MeOH）和吡啶都购自天津第二试剂厂，三氟乙酸（TFA）、苯酚和吡啶均为天津试剂一厂产品；以上有机试剂使用前均经过重蒸处理。

实施例1、 EKR的合成

（1）树脂预处理：称取800 mg取代值为0.43 mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂加入合成仪中，再加入DCM后搅拌30 min，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂。

（2）脱除Fmoc基团保护：在溶胀、抽干溶剂的树脂中，加入六氢吡啶、DBU、DMF的混合溶液（三者的体积比为1:1:98），搅拌5 min后抽干，重复3次后抽干。最后加入的DMF，搅拌3 min后抽干，重复4次，得到脱除Fmoc基团保护的树脂样品。

（3）茚检：按以下顺序加入试管中：树脂样品、0.1 ml试剂、0.2ml试剂、0.1 ml试剂，沸水浴3-10 min后观察。溶液、树脂均为蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全。用于茚检的三种试剂的配方为：试剂 80 g苯酚/20ml乙醇；试剂 2.0 ml的0.001 M氰化钾（水）/ 98ml吡啶；试剂 5 g 茚三酮/100 ml乙醇。

（4）连接子Lys的缩合：在小烧杯中用DMF依次将N-(9-芴甲氧羰酰基)-N'-甲基三苯甲基-L-赖氨酸（Fmoc-Lys(Mtt)-OH）、N-羟基苯并三氮唑（HOBt）、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐（HBTU）以1:1:1的摩尔比完全溶解，再加入Fmoc-Lys(Mtt)-OH两倍量的二异丙基乙胺（DIEA）后充分混匀，得混合溶液；将混合溶液和步骤（2）得到的脱除Fmoc基团保护的树脂加入到合成仪中，在氩气保护下搅拌反应60 min，抽干溶剂。加入的DMF，搅拌3 min后抽干，重复3次，得肽树脂样品；按照步骤（3）进行茚检，茚检溶液为淡黄、树脂为无色表示缩合完全。按照步骤（2）脱除Fmoc保护基团，再按照步骤（3）茚检，溶液、树脂均为蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全。

（5）主链缩合：将步骤（4）所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤（2）、步骤（3）的工艺依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH和Boc-Tyr(tBu)-OH的缩合和脱Fmoc基团保护，并保留Boc-Tyr(tBu)-OH的Boc保护基团，得到肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys(Mtt)-Resin。

（6）Lys侧链Mtt保护基团的脱除：步骤（5）得到的树脂抽干溶剂后，加入1%-1.5%的TFA/DCM溶液，搅拌2 min后抽干，重复50次后抽干。最后加入DMF，搅拌3 min后抽干，重复4次，得到脱除Mtt基团保护的肽树脂样品Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys-Resin。

（7）侧链缩合：将步骤（6）所得Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys-Resin的肽树脂按步骤（2）、步骤（3）的工艺依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、1-金刚烷酸的缩合和脱Fmoc基团保护，得到的肽树脂样品为Lys侧链连有1-金刚烷酰基化-Phe-Arg(Pbf)-结构的Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys-Resin。

（8）EKR的肽链从树脂上的切割

肽链的氨基酸残基全部缩合完成后，Boc和tBu保护基团在切割剂TFA的酸性条件下可脱除，因此，最后无需脱除直接进行切割。按照DCM 3 min×2次，MeOH 3 min×1次；DCM 3 min×1次，MeOH 3 min×2次的操作交替洗树脂。移开搅棒，将合成仪密封（胶塞），彻底抽干（至少2小时）。将干燥的肽树脂置于反应器中，加入切割剂（由TFA:TIS:水以95:2.5:2.5的体积比混合而成，每克肽树脂加入18ml的切割剂），于室温下切割反应2.5小时（每15分钟搅拌一次，每次搅拌1分钟）。过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的乙醚析出沉淀，振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。静置后将上清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗将乙醚从水相中分离除去，合并水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末。EKR的粗肽粉末为205.5mg，产率为51.3 %。

（9） EKR脱盐和纯化

将全部粗产物分批溶于20%乙酸溶液中，将溶液过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱（2.0×25cm）, 流动相为体积浓度20%乙酸溶液。利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥。再用反相高效液相色谱（HPLC）C₁₈柱（XBridge ^TM BEH 130 Prep C₁₈，19 mm×250mm）对上述脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰。纯化后的EKR的样品纯度在98％以上，其合成的总产率分别为26.7 %。质谱和色谱分析检测结果如表1所示。EKR的合成路线图见图10。

实施例二、 RKE的合成

（1）树脂预处理：称500 mg取代值为0.4 mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂加入合成仪中，处理工艺同实施例1。

（2）脱除Fmoc基团保护：同实施例1。

（3）茚检：同实施例1。

（4）连接子Lys的缩合：同实施例1。

（5）主链缩合：将步骤（4）所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤（2）、步骤（3）的工艺依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、1-金刚烷酸的缩合和脱Fmoc基团保护，得到肽树脂样品1-金刚烷酰基化-Phe-Arg(Pbf)-Lys(Mtt)-Resin。

（6）Lys侧链氨基Mtt保护基团的脱除：步骤（5）得到的树脂抽干溶剂后，加入1%-1.5%的TFA/DCM溶液，搅拌2 min后抽干，重复50次后抽干。最后加入DMF，搅拌3 min后抽干，重复4次，得到脱除Mtt基团保护的肽树脂样品。茚检溶液为蓝色、树脂带红色。

（7）侧链缩合：将步骤（6）所得肽树脂1-金刚烷酰基化-Phe-Arg(Pbf)-Lys-Resin按步骤（2）、步骤（3）的工艺依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH和Boc-Tyr(tBu)-OH的缩合和脱Fmoc基团保护，得到的肽树脂样品为Lys侧链连有Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-结构的1-金刚烷酰基化-Phe-Arg(Pbf)-Lys-Resin。

（8）RKE的肽链从树脂上的切割

肽链的氨基酸残基全部缩合完成后，Boc和tBu保护基团在切割剂TFA的酸性条件下可脱除，因此，最后无需脱除直接进行切割。按照DCM 3 min×2次，MeOH 3 min×1次；DCM 3 min×1次，MeOH 3 min×2次的操作交替洗树脂。移开搅棒，将合成仪密封（胶塞），彻底抽干（至少2小时）。将干燥的肽树脂置于反应器中，加入切割剂（由TFA:TIS:水以95:2.5:2.5的体积比混合而成，每克肽树脂加入18ml的切割剂），于室温下切割反应2.5小时（每15分钟搅拌一次，每次搅拌1分钟）。过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的乙醚析出沉淀，振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。静置后将上清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗将乙醚从水相中分离除去，合并水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末。RKE的粗肽粉末为155.7mg，产率为66.9 %。

（9）RKE的脱盐和纯化

将全部粗产物分批溶于20%乙酸溶液中，将溶液过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱（2.0×25cm），流动相为体积浓度20%乙酸溶液。利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥。再用反相高效液相色谱（HPLC）C₁₈柱（XBridge ^TM BEH 130 Prep C₁₈，19 mm×250mm）对上述脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰。纯化后的RKE的样品纯度在98％以上，其合成的总产率分别为42.1%。质谱和色谱分析检测结果如表1所示。RKE的合成路线图见图11。