磷酸甘油酸激酶1在制备类风湿关节炎诊断试剂中的应用

摘要

本发明公开了一种用于类风湿关节炎临床诊断的血液标志物—PGK1，并公开了一种用于类风湿关节炎临床诊断的试剂，包括抗PGK1抗体、HRP-IgG抗体，以及血液诊断试剂中的常规试剂，血液诊断试剂中的常规试剂包括碳酸盐缓冲液、PBST洗液、封闭液、显色液和终止液。本发明制备的检测试剂，具有敏感性强、特异性高等优点，可广泛用于临床类风湿性关节炎初步调查和健康普查，为临床诊断提供可靠依据。

说明书

技术领域

本发明涉及一种磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1，PKG1)在制备类风湿关 节炎诊断试剂中的应用。

背景技术

糖代谢主要是指葡萄糖降解的过程,其中包括糖酵解,有氧氧化和磷酸戊糖途径代谢。糖 代谢是体内的主要代谢途径之一。葡萄糖代谢不仅为身体活动提供能量,而且还通过复杂的信 号网络介导多种生理过程。糖代谢在很多疾病如糖尿病、中风、精神分裂症和药物滥用中发 挥重要的作用。

类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫性疾病。近年研究结果表明,葡萄糖代谢在RA发病 机制中起着重要的作用。Henderson.等人发现糖酵解途径的关键酶磷酸甘油醛脱氢酶和乳酸 脱氢酶在RA滑膜细胞中的活性水平增高。Ciurtin等人发现在RA患者滑液中乳酸明显升高 而葡萄糖浓度降低。酸性微环境可能破坏RA患者滑膜组织细胞异常分化。磷酸丙糖异构酶 (TPI)是一种异构化酶,可逆性的催化三磷酸甘油醛为磷酸二羟丙酮,这是糖酵解和糖异生中 的一个重要反应。利用蛋白质组学方法,我们发现TPI在RA患者滑膜中表达增高。上述发现 表明糖酵解活动增强可能在RA发病机制中起着重要的作用。然而,葡萄糖代谢对RA发病机理 的影响尚未得到足够的关注和彻底的研究。

PCR微列阵芯片(RT²Profiler^TMPCR Array)是高度可靠和敏感的技术,它结合了实时 荧光定量PCR技术和微列阵技术的灵敏性和快速性，可对信号转导途径、生理过程和疾病相 关过程中的一系列基因进行一次性分析。利用该技术确定葡萄糖代谢的关键酶以及它们的作 用，进一步的了解RA的发病机理，是目前研究的热点所在，而磷酸甘油酸激酶1与RA诊断 治疗的关系目前尚未见报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种新的类风湿关节炎临床诊断的血液标志物 —磷酸甘油酸激酶1(PGK1)。

本发明还提供了一种以磷酸甘油酸激酶1(PGK1)为标记物制备的用于类风湿关节炎诊断 的试剂。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明通过利用葡萄糖代谢RT²Profiler^TMPCR Array研究葡萄糖代谢与胶原诱导型关 节炎(CIA)大鼠和人类风湿性关节炎的关系，利用该新技术发现了与RA密切相关的葡萄糖代 谢基因。葡萄糖代谢RT²Profiler^TMPCR Array PCR包括84个在糖酵解和糖代谢途径中调节 酶促反应的关键基因，通过确定葡萄糖代谢的关键酶以及它们的作用,进一步了解RA的发病 机理。本发明同时使用实时荧光定量PCR、ELISA和免疫印迹(western blot)方法对PCR array 的结果进行验证。

本发明首次发现，与正常人血清相比，PGK1在类风湿性关节炎患者血清中的表达水平 明显增高，这提示PGK1在RA自身免疫紊乱中起到重要的作用，有助于进一步的了解RA的发 病机理。更重要的是，申请人发现PGK1是很好的潜在的类风湿关节炎临床诊断的血液标志物， 基于以上发现，本发明研发了敏感性强、特异性高的类风湿性关节炎诊断试剂及检测方法， 可广泛用于临床类风湿性关节炎初步调查和健康普查，为临床诊断提供可靠依据。

一种用于类风湿关节炎临床诊断的试剂，包括抗PGK1抗体、HRP-IgG抗体，以及血液诊 断试剂中的常规试剂。

所述血液诊断试剂中的常规试剂包括碳酸盐缓冲液、PBST洗液、封闭液、显色液和终止 液。

所述PBST洗液为含有Tween-20的PBS溶液，溶液中Tween-20的体积分数为0.1％，溶 液的pH为7.4。

所述封闭液是质量百分数为0.5％的牛血清蛋白(BSA)溶液。

所述显色液包括显色液A和显色液B，其中，显色液A含有过氧化氢，为供氢体(DH2)； 显色液B含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，用于显色。

所述终止液为2M的H₂SO₄溶液。

该血液诊断试剂的定性检测方法可以为间接ELISA法或胶体金法。定量检测方法为双抗 体夹心ELISA法。

具体的，定性检测方法为间接ELISA法时，其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球 蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体，具体步骤如下：

(1)将待检测血样用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释10倍后，加至空白酶标板中，37℃温 育2h；

(2)弃去孔内液体，PBST洗液洗板三次(所述PBST洗液是指PBS溶液加上Tween-20， PBS溶液的pH为7.4，Tween-20的浓度为0.1％，体积百分数)；

(3)每孔加封闭液(0.5％BSA，质量百分数)200μL/孔，37℃温育1h；

(4)弃去孔内液体，PBST洗液洗板三次；

(5)每组加抗PGK1抗体稀释液(1:2000稀释)100μL/孔，37℃温育1h；

(6)弃去孔内液体，PBST洗液洗板三次；

(7)每孔加HRP-IgG抗体稀释液(1:3000稀释)100μL，37℃温育1h；

(8)弃去孔内液体，PBST洗液洗板五次；

(9)每孔加显色液A、B【显色剂A(含过氧化氢)为供氢体(DH2)，显色剂B(含TMB， 3,3',5,5'-四甲基联苯胺)】各50μL，37℃显色10min。

(10)每孔加50μL终止液(2M H₂SO₄溶液)终止显色，振匀，用酶标仪检测OD_450nm值；

(11)计算：以阴性血清(正常人血清)为对照，检测阴性血清OD_450nm均值(是以多份阴 性血清为对照检测出来再平均的值)；将OD_450nm值代入公式，P/N值＝待测血样OD_450nm值/阴性血 清OD_450nm均值，计算得到待检测血样的P/N值；

(12)判断：若待检测血样的P/N值大于或等于2.1，则该待检测血样的检测结果为阳 性，该待检测血样所属的患者有可能患有类风湿关节炎，可作为临床诊断的依据之一。

上述所涉及的抗体，为通过常规方法制备得到。上述所涉及的各种试剂，均为现有技术 中已有的常规试剂。

定性的检测方法也可为胶体金法，其检测原理为：采用双抗体夹心法和胶体金免疫技术， 在胶体金垫上预加入抗PGK1抗体胶体金结合物，在硝酸纤维素膜的检测线和对照线上分别包 被有抗PGK1抗体。当进行检测时，如为阳性样本，样本中的PGK1可与金标抗PGK1抗体结合 形成复合物，由于层析作用复合物沿试纸向前移动，再与检测线预包被的抗体结合形成“金 标抗体-PGK1-抗体”复合物而凝集显色。硝酸纤维膜上同时包被有一条质控线作为对照，故 当出现一条红色质控线和一条红色反应线时判为阳性。当待检标本中无PGK1抗原时，只出现 一条红色质控线判为阴性。作为质控，不管结果为阳性或阴性，都会出现一条红色质控线。 若无红线(或只有反应线)出现，则检测无效。具体的检测方法为：

(1)用洁净的容器收集少量样本(血清样本按常规方法静脉采集；采集的样本在五天内 检测，需放置4℃保存，五天以上需放置-20℃保存，避免反复冻融；如果样本出现浑浊或沉 淀，应离心或过滤澄清后再检测)；打开内包装，取出检测试纸。

(2)依据产品型号进行操作：

①检测条：将检测条标有MAX字样的一端浸入样本中30秒(注意：液面不要没过MAX线) 取出平放于台面上。

②检测卡：在检测卡标有“S”字样的加样孔中，用滴管滴加4滴样本(约100μl)。

(3)待检测条质控线(C线)出现后计时，20分钟内观察结果，20分钟以后观察结果 无效。

检验结果的解释：

(1)阴性结果：仅出现质控线(C线)。

(2)阳性结果：出现两条线，即质控线(C线)和检测线(T线)。

(3)无效结果：无线出现，或仅出现检测线(T线)，须重新检测。

定量检测时，采用双抗体夹心ELISA法检测PGK1，配制系列浓度的标准品，然后绘制标 准品浓度与OD_450nm值或OD_630nm值的标准曲线，并得到线性回归方程，然后将待检测血样的OD_450nm值或OD_630nm值代入标准曲线，求得样品中的浓度。具体步骤为：

(1)包被：将PGK1单克隆抗体用包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释成1μg/mL，加 至空白酶标板中，100μL/孔，4℃饱和湿度下放置过夜；

(2)洗板：弃去孔内液体，每孔加入PBST洗液300μL(所述PBST洗液是指PBS溶液 加上Tween-20，PBS溶液的pH为7.4，Tween-20的浓度0.1％，体积百分数)，浸泡15秒， 甩弃液体。连续洗板三次；

(3)封闭：每孔加封闭液(0.5％BSA，质量百分数)200μL/孔，37℃温育1h；

(4)洗板三次，同步骤(2)；

(5)设定：留一孔作空白对照，暂不加任何液体；另设PGK1标准品7孔，各加100μL 标准品；

(6)加样：将待检测血样用PBST稀释10倍后，按顺序加至反应孔中，室温孵育1.5h；

(7)洗板三次，同步骤(2)；

(8)加酶：每个孔加入100μL HRP标记的PGK1单克隆抗体稀释液(1/3000)(不包括 空白对照)，室温孵育45min；

(9)洗板三次，同步骤(2)；

(10)显色：每孔依次加入显色液A、B【显色剂A(含过氧化氢)为供氢体(DH2)，底 物B就是显色剂B(含TMB，3,3',5,5'-四甲基联苯胺)】各50μL(包括空白对照)，震荡混 匀，室温避光显色10分钟；

(11)终止：每孔加入终止液(2M H₂SO₄溶液)各50μL(包括空白对照)，震荡混匀终止 反应；

(12)测定：用空白对照孔调零，并于30分钟内用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值； 也可用双波长450nm/630nm测定各孔OD值；

(13)计算：以系列标准品浓度值的对数值为横坐标(X轴)，以标准品OD值的对数值 为纵坐标(Y轴)，建立(log-log)标准曲线，计算待测样本的PGK1含量。

本发明的有益效果：

本发明通过检测出PGK1在类风湿性关节炎患者血清中的高表达，提供了一种新的类风湿 关节炎临床诊断的血液标志物—磷酸甘油酸激酶(PGK1)基因，进一步的，以该检测标志物 制备的检测试剂，具有敏感性强、特异性高等优点，可广泛用于临床类风湿性关节炎初步调 查和健康普查，为临床诊断提供可靠依据。

附图说明

图1为CIA大鼠和正常对照组的滑膜组织中ENO1,HK2，PGK1,PCK1和PDK4基因表达水平 的PCR array实验的结果比较；

图2为CIA大鼠的滑膜组织与正常对照组大鼠的滑膜组织中ENO1、HK2、PCK1、PDK4和PGK1 的mRNA水平实时定量PCR检测结果比较；

图3为人RA滑膜组织与OA滑膜组织中ENO1、HK2、PCK1、PDK4和PGK1的mRNA水平实时定 量PCR检测结果比较；

图4为使用免疫印迹半定量分析PGK1、ENO1、HK2和PDK4在RA滑膜组织与OA滑膜组织中蛋 白表达的结果比较；

图5为使用ELISA方法分析RA患者与正常组血清中ENO1、HK2PDK4和PGK1水平的结果比较；

图6为实施例2中使用ELISA方法分析PGK1血清水平的检测结果。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明， 并不对其内容进行限定。

实施例1：PGK1作为新的类风湿关节炎临床诊断的血液标志物的发现与验证

1.1II型胶原诱导型关节炎(CIA)大鼠模型的建立：

由北京大学动物科学健康科学实验中心(中国,北京)获取雄性Wistar大鼠(n＝20,每只鼠 重150-200克)。这些老鼠被随机分成两组,CIA组和控制组。所有实验组老鼠，尾根部皮内 注射含有500μg牛胶原蛋白II(美国SIGMA-ALDRICH)的CFA溶液。并于14天后,使用同样的 方法再次注射。对照组用相同的方式给与BSA替代II型胶原蛋白进行尾根部注射。根据每 个腕跗骨关节临床表现对CIA大鼠进行临床评分，评估标准如下:0＝正常,1＝轻微水肿和红 斑,2＝明显水肿,3＝关节僵硬。用四个腕跗骨关节的总评分来衡量，每周测量一次。每只老 鼠最高12分。收集两侧膝关节滑膜组织,并立即放入-80℃冰箱保存,以供将来使用。滑膜组 织用于PCR array和实时荧光定量PCR。控制组是用牛血清白蛋白(BSA)按相同步骤进行的。

1.2RA滑膜和外周血的收集

收集行膝关节置换手术的RA患者(n＝8；7名女性,年龄50-68岁,平均55岁)的滑 膜组织。所有患者均符合ACR(美国风湿病学院)对RA的诊断标准。RA患者的疾病持续时间 三到九年,并且有典型的关节破坏((Larsen classIV-V)。病人c反应蛋白(CRP,12-320毫 克/升,平均值59毫克/升),抗-CCP抗体(16-470U/ml,平均值290.4U/ml)和类风湿因子 (RF,40-320U/ml,平均值171.2U/ml)水平升高。从膝关节置换手术的OA患者中收集OA 滑膜组织样本(n＝8；2名女性,年龄28-47岁，平均35岁)。RA和OA患者在手术前应用非 甾体类抗炎药(DMARDs)控制病情,这有助于减少关节疼痛和肿胀,降低僵硬程度。收集的滑膜 样本立即就被储存在-80℃冰箱直到使用。滑膜收集于2014年1月到2014年6月，山东省千 佛山医院。滑膜组织被应用于实时荧光定量和免疫印迹分析。

从RA患者中按标准静脉穿刺术得到血液标本(n＝120,75名女性,年龄在20–75岁)。关 节慢性炎症至少3年,红细胞沉降率(ESR,19到22毫米/小时,平均44毫米/小时)、c反应蛋 白(8-196U/毫升,平均29.1U/毫升)和类风湿因子(10.5-2090U/毫升)水平升高。应用甲氨 蝶呤和来氟米特联合治疗至少两个月。120位(80位女性；24-58岁,平均40.2岁)健康献血 者。血液样本放入EDTA-K2真空采血试管。

所有病人参与者均书面知情同意参加本研究。研究协议是经山东省千佛山医院医学伦理 委员会同意。

1.3提取RNA和进行PCR array

使用Rneasy mini试剂盒从大鼠滑膜组织提取总RNA。为了减少个体差异,从10个老鼠 的滑膜组织中取同样数量构成一个样本池(每个老鼠取100ng)。首先使用Revert Aid第一 链cDNA试剂盒将RNA合成为cDNA。接下来,cDNA与适当的RT2SYBR GREEN染料混合。混合 物能平均分配到PCR array的各个孔中。使用5个管家基因进行标准化，并采取比较Ct值的 方法算出基因表达的相对水平。PCR矩阵的原始数据数据进行了处理和分析在 http://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php。变化阈值设置为2.0。

1.4实时定量聚合酶链反应

如上所述在大鼠滑膜组织和人类RA患者的滑膜组织中提取总的RNA。提取的总RNA用 RNA PCR试剂盒(TaKaRa,日本)进行逆转录。反应总量为10ul,包含1ul的cDNA、5ul SYBR GREEN实时PCR反应混合液(ToYoBo、日本)和各1UL的上下游引物。PCR扩增循环进行如下: 95℃,10秒，一个循环，95℃，5秒和60℃，31秒，40个循环。每个样品同时进行两个反 应。一个反应来确定目标基因的mRNA水平，另一个确定GAPDH水平。PCR产物经熔解曲线分 析。目的基因mRNA的相对表达水平通过GAPDH mRNA水平进行确定。用于定量RT–PCR的上 下游引物，如表1和表2所示:

表1.目标基因扩增的引物序列(大鼠)

表2.目的基因引物序列(人)

1.5酶联免疫吸附试验(ELISA)

使用人类ENO1酶联免疫试剂盒(Cusabio,中国)测量血清中ENO1的含量。用人PGK1酶联 免疫试剂盒(Cusabio,中国)测定血清中PGK1的含量,使用人类HK2酶联免疫试剂盒(Cusabio, 中国)测定HK2的含量,并使用人类PDK4酶联免疫试剂盒(Cusabio,中国)测定血清中PDK4的 含量。实验根据制造商提供的的步骤执行。1000xg离心30分钟后,收集血清，并储存在-80℃ 冰箱到使用。每孔加100ul样本,37℃孵育2小时。甩干液体,每孔加生物素标记物100ul， 并于37℃孵育1小时。应用PBST清洗5次，甩干,每孔加100ul TMB并于37℃孵育1小时。 再次洗涤,然后每孔加50ul终止液。用酶标仪在450nm处读取OD值(美国BioTek)。

1.6免疫印迹分析

取100ug滑膜组织应用细胞裂解液使其裂解。12000xg，4℃离心30分钟。收集上清, 用BCA蛋白质分析试剂盒(Beyotime生物技术,中国)检测蛋白浓度。使用抗-PGK1抗体按 1:1000稀释，进行免疫印迹分析,抗-ENO1抗体1:1000倍稀释,抗-HK2抗体1:1000倍稀释， 抗i-PDK4抗体1:500倍稀释。以浓度为12％SDS PA GE凝胶电泳分离,半干法将蛋白从 SDS PA GE凝胶转移至PVDF膜,在5％脱脂奶粉中室温封闭1h,加入上述一抗和内参蛋白 GAPDH(ZSJQ-BIO,中国)。4℃孵育过夜,TBST充分漂洗后加入二抗(辣根酶标记的羊抗兔IgG, 稀释度为1∶5000),TBST充分漂洗后经DAB显色。每个样本用Quant5.2软件进行图像量 化。

2.1筛选CIA大鼠的葡萄糖代谢的关键基因

从CIA大鼠和正常对照组的滑膜组织中提取总RNA，用大鼠糖代谢PCR Array试剂盒进 行分析。对比CIA大鼠和BSA鼠滑膜组织之间84个与葡萄糖代谢有关的基因表达水平。在 CIA大鼠滑膜组织中发现5个基因的表达水平相较于对照组至少成四倍的变化。其中ENO1, HK2，PGK1基因在滑膜组织中表达上调,PCK1、PDK4在滑膜组织中表达下调。结果如图1和 表3所示。

表3.CIA滑膜组织中不同基因的表达水平

2.2检测目的基因在CIA滑膜组织和RA滑膜组织中的表达

用实时荧光定量PCR检测转录水平的ENO1,HK2、PCK1、PGK1和PDK4。将CIA大鼠的滑 膜组织与正常对照组大鼠的滑膜组织相比，ENO1,HK2、PGK1mRNA水平显著升高,而PCK1 和PDK4mRNA水平下降，实时荧光定量PCR结果如图2所示。此外,人RA滑膜组织与OA滑膜 组织相比，ENO1和PGK1mRNA表达水平显著提升。PDK4水平下降。而HK2和PCK1在RA滑膜 组织中没有明显变化。实时荧光定量PCR结果如图3所示。

使用免疫印迹半定量分析翻译水平的PGK1，ENO1,HK2和PDK4在RA滑膜组织中的表达。 RA滑膜组织与OA滑膜组织相比，ENO1,HK2和PGK1的表达水平显著增高。而PDK4的变化 不显著。结果显示在图4中。

2.3检测RA患者血清中ENO1、HK2PDK4和PGK1的水平

应用三明治夹心ELISA法来测量ENO1,HK2,PDK4、PGK1在RA患者血液中的水平。在 RA患者血清中PGK1水平显著增加。其中30.2％的RA组患者的PGK1水平高于正常组平均值的 2.1倍。ENO1在RA中水平升高,但与正常组相比没有显著差异。PDK4和HK2在RA患者血清 和健康患者血清之间的表达量没有显著改变。结果如图5所示。

3.结果分析

本实施例应用大鼠糖代谢RT²Profiler PCR Array来检测CIA大鼠滑膜中糖酵解的相关 基因。PCR array检测到CIA滑膜组织中5个基因表达异常。其中ENO1,HK2、PGK1表达上 调,PDK4和PCK1表达下调。这个结果通过实时荧光定量PCR在CIA大鼠滑膜组织中得到了验 证。

此外,通过检测RA患者滑膜组织，发现ENO1和PGK1mRNA水平增加。PDK4的表达水平 减少。通过免疫印迹分析方法，证明了蛋白水平的ENO1,HK2和PGK1的表达增高。上述结果 表明,CIA大鼠和人类RA患者中ENO1和PGK1增加了转录和翻译。此外,夹心ELISA检测到 PGK1在RA患者的血液中表达升高。

结果表明，PGK1在类风湿性关节炎患者滑膜组织和血液中高表达，而PGK1有可能参与 血管生成和异常增殖,而这正是RA的两个重要特征，因此，PGK1可以作为一种很好的潜在 的血液标志物，用于类风湿关节炎临床诊断。

实施例2：用于类风湿关节炎临床诊断的诊断试剂及检测方法

以PGK1作为类风湿性关节炎血液标志物，制备用于类风湿关节炎临床诊断的诊断试剂， 对患者的血液进行检测。从RA患者中按标准静脉穿刺术得到血液标本(n＝120,75名女性, 年龄在20–75岁)。关节慢性炎症至少3年,红细胞沉降率(ESR,19到22毫米/小时,平均44 毫米/小时)、c反应蛋白(8-196U/毫升,平均29.1U/毫升)和类风湿因子(10.5-2090U/ 毫升)水平升高。应用甲氨蝶呤和来氟米特联合治疗至少两个月。120位(80位女性；24-58 岁,平均40.2岁)健康献血者。血液样本放入EDTA-K2真空采血试管。

诊断试剂的组成包括：碳酸盐缓冲液、PBST洗液、封闭液、显色液和终止液。

其中，PBST洗液为含有Tween-20的PBS溶液，溶液中Tween-20的体积分数为0.1％，溶 液的pH为7.4。

封闭液是质量百分数为0.5％的牛血清蛋白(BSA)溶液。

显色液包括显色液A和显色液B，其中，显色液A含有过氧化氢，为供氢体(DH2)；显 色液B含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。

终止液为2M的H₂SO₄溶液。

具体检测方法为：

(1)将待检测血样用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释10倍后，加至空白酶标板中，37℃温 育2h；

(2)弃去孔内液体，PBST洗液洗板三次(所述PBST洗液是指PBS溶液加上Tween-20， PBS溶液的pH为7.4，Tween-20的浓度为0.1％，体积百分数)；

(3)每孔加封闭液(0.5％BSA，质量百分数)200μL/孔，37℃温育1h；

(4)弃去孔内液体，PBST洗液洗板三次；

(5)每组加抗PGK1抗体稀释液(1:2000稀释)100μL/孔，37℃温育1h；

(6)弃去孔内液体，PBST洗液洗板三次；

(7)每孔加HRP-IgG抗体稀释液(1:3000稀释)100μL，37℃温育1h；

(8)弃去孔内液体，PBST洗液洗板五次；

(9)每孔加显色液A、B【显色剂A(含过氧化氢)为供氢体(DH2)，显色剂B(含TMB， 3,3',5,5'-四甲基联苯胺)】各50μL，37℃显色10min。

(10)每孔加50μL终止液(2M H₂SO₄溶液)终止显色，振匀，用酶标仪检测OD_450nm值；

(11)计算：以阴性血清(正常人血清)为对照，检测阴性血清OD_450nm均值(是以多份阴 性血清为对照检测出来再平均的值)；将OD_450nm值代入公式P/N值＝待测血样OD_450nm值/阴性血 清OD_450nm均值，计算得到待检测血样的P/N值；血清水平PGK1的ELISA检测结果见图6。

(12)判断：若待检测血样的P/N值大于或等于2.1，则该待检测血样的检测结果为阳 性。

结果：120例待检测的RA患者血样中，阳性例数为120例，说明本发明的诊断试剂可以 用于类风湿关节炎的临床诊断，诊断结果准确、可靠。