一种利用固定化酶筛选I型17β羟类固醇脱氢酶抑制剂的方法

摘要

本发明提供了一种利用固定化酶筛选I型17β羟类固醇脱氢酶抑制剂的方法，属酶学与酶工程技术领域。I型17β羟类固醇脱氢酶(17β-HSD1)在治疗激素依赖性疾病中发挥重要作用。目前，研究17β-HSD1活性主要以底物放射性标记法为主，但是由于17β-HSD1游离酶容易失活，且17β-HSD1制备不易，每次新药筛选实验均需要新鲜胎盘来制备酶源，原材料获取不易，价格昂贵，给新药筛选工作带来困难。本发明，采用氨基修饰的硅球为载体，利用戊二醛交联法，固定从胎盘中提取的17β-HSD1，建立体外固定化17β-HSD1酶模型，以雄烯二酮为底物，使用高效液相色谱法检测产物，筛选17β-HSD1潜在抑制剂。该方法，克服了游离酶的不稳定性，操作简单，制作成本低廉，可重复利用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用固定化酶筛选I型17β羟类固醇脱氢酶抑制剂的方法，尤其是一种利用固定化酶，建立体外药物筛选的方法，属于酶学与酶工程技术领域。

背景技术

I型17β羟类固醇脱氢酶(17β-HSD1)是一类有氧化还原功能的酶，参与雌激素与雄激素代谢的关键酶，对其C17位置上的酮基和醇基之间的氧化还原反应起到调控作用，催化高活性激素与低活性激素之间的相互转化，即睾酮、雌二醇与雄烯二酮、雌酮之间的转化。17β-HSD1是性激素合成过程中最后步骤的催化酶，与乳腺癌、子宫内膜癌、子宫内膜异位症等关系密切，故在治疗激素依赖性疾病中发挥重要作用。(Design and validation of specific inhibitors of 17b-hydroxysteroid dehydrogenases for therapeutic application in breast and prostate cancer，and in endometriosis[J].Day JM，Tutill HJ，Purohit A，Reed MJ，Endocr Relat Cancer，2008，15：665-692.)

17β-HSD1分布广泛，主要存在于胎盘、肝脏、睾丸、前列腺等组织中。1957年Langer和Engel(Human placental estradiol-17beta dehydrogenase 1concentration，characterization and assay[J].Langer LJ，Engel LL，JBiol Chem，1958，233：583-588.)部分分离和纯化了胎盘17β-HSD1。1962年，Jarabak等(Purification of a 17β-hydroxysteroid dehydrogenase of human placenta and studies on its transhydrogenase function[J].Jarabak J，Adams JA，Williams-Ashman HG，Talalay P，JBiol Chem，1962，237：345-357.)从人胎盘组织分离、纯化了17β-HSD1，并对该酶的生物学特性进行了详细的描述。这是最早发现的17β-HSD1。17β-HSD1能影响雌激素的代谢，还原酶在组织中表达过多，或者氧化酶表达过少，均会导致组织中生成过多雌激素，引起局部组织的过度增生，导致疾病的发生，尤其是雌激素依赖性的疾病，如当今发病率较高的乳腺癌、子宫内膜癌等。如果有效地抑制17β-HSD1，不仅可以调控雌激素的合成，还可以在受体前的水平阻断刺激素的作用，因此，17β-HSD1抑制剂的研究，对于雌激素依赖性疾病的治疗意义重大。目前，针对17β-HSD1己筛选出一些特异性的抑制剂，例如黄酮类、香豆素类化合物等，并且在某些特定的动物疾病模型中初步验证了其疗效。

目前，测定17β-HSD1酶活的方法，常采用底物放射性标记法(Insulin-like growth factor type I and insulin-like growth factor type II stimulate oestradiol-17βhydroxysteroid dehydrogenase(reductive)activity in breast cancer cells[J].Singh A，Reed MJ，JEndocrinol，1991，129：R5-R8.)，但这种方法使用了放射性的物质，给后处理和人员防护带来隐患。除上述缺点外，以游离芳香化酶为模型还存在以下明显缺陷：(1)酶源来之不易，由于没有商品化的芳香化酶供应，每次筛选试验均需要寻找新鲜人胎盘来制备微粒体作为芳香化酶的酶源，原材料获取困难；(2)人工提取的游离酶保存条件严苛，易失活；(3)游离芳香化酶在有机溶剂中不溶解，而许多待筛选小分子化合物并不溶于水，必须加入有机溶剂或乳化剂，从而影响酶活性；(4)游离芳香化酶在反应过程中易聚集，使酶分子与底物分子不能充分接触，催化效率低下，导致筛选试验失败；(5)游离芳香化酶活性不稳定，容易受环境因素如温度，酸碱度等影响而失活。(6)反应后的酶与产物分离困难，无法回收再利用。由于以上原因，常常给173-HSD1潜在抑制剂的筛选研究带来挑战。

酶催化反应具有高效、专一以及反应条件温和等优点，但是酶催化反应的实际应用仍受到许多因素的限制，如酶不稳定、容易失活，难以重复回收利用等。为克服以上缺点，人们发展了固定化酶(Immobilized enzyme，IE)的方法。目前，固定化酶技术己在食品工业、精细化学品工业、医药等行业得到广泛应用，其发展理论是基于胞内酶是在细胞内起作用，类似于用包埋方法制成的固定化酶，因此固定化酶在一定程度上可以认为是为了使酶在更接近于其体内状态下进行反应。固定化酶与游离酶相比，具有许多优点：1)极易与底物、产物分离；2)可以在较长时间内进行反复使用，成本降低；3)能够提高酶的稳定性；4)可以提高催化 效率等(Developments in immobilized-enzyme technology[J].Powell LW，Biotechnol Genet Eng Rev，1984，2：409-438.)。到目前为止，尚未见国内外关于17β-HSD1的固定化的研究报道。

酶的固定化方法根据机理不同常分为吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法和微囊法等。本发明以氨基修饰的硅球为载体，采用戊二醛交联法固定17β-HSD1，得到的固定化酶稳定性提高，且可重复利用5次。本发明，通过固定化17β-HSD1，模拟体内环境，体外筛选有效的17β-HSD1抑制剂，操作简单有效。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用固定化酶筛选117β-HSD1抑制剂的方法。主要是以氨基修饰的硅球为载体，利用戊二醛交联固定从胎盘中提取的17β-HSD1。

为了实现上述目的，本发明所述一种利用固定化酶筛选117β-HSD1抑制剂的方法，包括如下步骤：

1)17β-HSD1的提取

所有步骤均在0～4℃冰块上进行。胎盘除去绒毛膜和大血管，用50mM PBS(pH＝7.4，内含1％KCl)，清洗后用剪刀剪碎，用50mM PBS(内含0.25M蔗糖)进行匀浆。离心2500×g30min，弃去沉淀，上清液离心60000×g 60min以沉淀线粒体成分。再次弃去沉淀，上清液中加入一定量重结晶的硫酸铵固体后，沉淀蓄积，离心后弃去上清，将沉淀重悬浮于50mMPBS(内含1mM EDTA和1mM盐酸半胱氨酸)，并于-80℃保存。

2)氨基修饰硅球的制备

取200mg硅胶，加入10～30mL浓度为5％～10％的盐酸，于90℃回流10～12h，洗涤至中性，100℃干燥过夜，得到活化硅胶。取50mg活化硅胶，加入无水甲苯和3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，在氮气保护下，90℃回流18～24h。将键合上APTES的硅胶用甲苯和丙酮依次洗涤，于105℃干燥过夜。

3)固定化酶的制备

100mg氨基化修饰的硅球置于原地烧瓶中，加入10～20mL浓度为1％～2.5％戊二醛溶液，搅拌5～12h，洗涤至无戊二醛气味，于50～70℃下干燥过夜，保存于冰箱中待用。取50mg交联硅球，加入PBS缓冲液和浓度为4.8mg/mL的17β-HSD1提取液，在4～25℃下搅拌8～12h，洗涤至不含游离酶，于25～35℃下干燥过夜，并保存于0～4℃中。

4)固定化酶活性的测定

取所述固定化酶温孵底物雄烯二酮30min～24h，离心取上清液，利用高效液相色谱法测定各时间点产物睾酮的含量，制备酶促曲线，计算酶促反应动力学系数，作为阴性对照。

5)17β-HSD1抑制剂的筛选

取所述固定化酶，加入待筛选化合物，温孵底物雄烯二酮30min～24h，离心取上清液，利用高效液相色谱法测定各时间点产物睾酮的含量，制备酶促曲线，计算酶促反应动力学系数，并与阴性对照比较。计算加入不同浓度化合物下的抑制率和IC₅₀值，评价抑制作用。

其中，步骤1)中所述，50mM磷酸盐缓冲液PBS(pH＝7.4)组分为：磷酸氢二钠的含量为19.332g/L，磷酸二氢钠的含量为1.976g/L，其余为水。

步骤2)中所述，10～30mL浓度为5％～10％的盐酸，优选20mL浓度为10％的盐酸。

步骤2)中所述，硅球粒径为5～50μm。

步骤2)中所述，加入甲苯为3～10mL，APTES为20～30μL，优选5mL甲苯，25μLAPTES。

步骤3)中所述，戊二醛交联反应体系pH为7.4，由于戊二醛见光分解，反应搅拌时避光。

步骤3)中所述，加入10～20mL浓度为1％～2.5％戊二醛溶液，优选10mL浓度为2.5％的戊二醛溶液。

步骤3)中所述，加入PBS为0.5～1mL，17β-HSD1提取液为50～100μL，优选PBS为1mL，17β-HSD1为100μL。

步骤3)中所述，酶固定化反应在4～25℃下搅拌8～12h，优选25℃下搅拌搅拌12h。

步骤4)与步骤5)中所述，酶的温孵条件为：pH＝8.0，温度为37～45℃，雄烯二酮浓度为30～40μM，加入体积为100～150μL，NAPDH浓度为20～25mg/mL，加入体积为10～20μL。

步骤4)与步骤5)中所述，高效液相色谱测定条件：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈：0.1％甲酸水溶液(70∶30)，检测波长为240nm，柱温为25～35℃，流速为1.0mL/min，进样体积为20μL。

步骤4)与步骤5)中所述，空白为不加入NAPDH的温孵体系。 

步骤5)中所述，抑制率计算公式为：I(％)＝(A₁-A₂)/A1×100％，A₁为不加入抑制剂时产物的峰面积，A2为加入抑制剂后产物的峰面积。以抑制剂浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，制定回归曲线，计算IC50值。

本发明提供了一种体外温孵筛选17β-HSD1抑制剂的方法，摒弃了用传统的游离酶进行活性药物筛选的方法，将胎盘中提取的17β-HSD1固定于氨基修饰的硅球上，提高的酶的耐受性。

由于酶被固定于载体，呈固体粉末状态，易与底物、产物溶液体系分离，可以通过高效液相色谱直接检测底物与产物含量的变化，并且，固定化酶可通过离心回收再利用。

具体实施方式

实施例1：固定化酶的制备

1)17β-HSD1的提取

所有步骤均在0～4℃冰块上进行。胎盘除去绒毛膜和大血管，用50mM PBS(pH＝7.4，内含1％KCl)，清洗后用剪刀剪碎，用50mM PBS(内含0.25M蔗糖)进行匀浆。离心2500×g 30min，弃去沉淀，上清液离心60000×g 60min以沉淀线粒体成分。再次弃去沉淀，上清液中加入一定量重结晶的硫酸铵固体后，沉淀蓄积，离心后弃去上清，将沉淀重悬浮于50mM PBS(内含1mM EDTA和1mM盐酸半胱氨酸)，并于-80℃保存。

2)氨基修饰硅球的制备

取粒径为5μm的硅胶200mg，加入20mL浓度为10％的盐酸，于90℃回流12h，洗涤至中性，100℃干燥过夜，得到活化硅胶。取50mg活化硅胶，加入5mL无水甲苯和25μL3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，在氮气保护下，90℃回流24h。将键合上APTES的硅胶用甲苯和丙酮依次洗涤3次，于105℃干燥过夜。

3)酶的固定化 

100mg氨基化修饰的硅球，置于圆底烧瓶中，加入10mL浓度为2.5％戊二醛溶液，于pH＝7.4的条件下，避光搅拌12h，洗涤至无戊二醛气味，于60℃下干燥过夜，保存于冰箱中待用。取50mg交联硅球，加入1mL PBS缓冲液和浓度为4.8mg/mL的17β-HSD1提取液100μL，在25℃下搅拌12h，洗涤至不含游离酶，于30℃下干燥过夜，并保存于0～4℃中。

实例2：固定化酶的酶学性质

1)酶促反应最适反应条件

取适量的固定化酶和游离酶，分别加入150μL浓度35μM的雄烯二酮，20μL浓度25mg/mL的NAPDH，于37℃温孵8h，测定产物睾酮的含量。其最适反应pH为8.0，最适反应温度为40℃。重复使用5次以后，固定化酶失活。

2)酶促反应动力学研究

取所述固定化酶20mg，依次加入200μL浓度25mg/mL的NAPDH，1500μL浓度35μM的雄烯二酮，震荡混匀后，平均分装成10管，于pH＝8.0的磷酸盐缓冲体系下，37℃温孵0min，15min，30min，1h，2h，4h，6h，10h，12h，24h，离心取上清液，利用高效液相色谱法测定各时间点产物的含量，制备酶促曲线，计算酶促反应动力学系数Vm和Km。

高效液相色谱测定条件：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈：0.1％甲酸水 溶液(70：30)，检测波长为240nm，柱温为30℃，流速为1.0mL/min，进样体积为20μL，检测时间为6min，雄烯二酮的保留时间为3.85min，睾酮的保留时间为3.15min。

实例3：芹菜素对固定化酶抑制性的研究

1)芹菜素酶促抑制曲线

取所述固定化酶20mg，依次加入200μL浓度25mg/mL的NAPDH，1500μL浓度35μM的雄烯二酮，100μL浓度400nM的芹菜素，震荡混匀后，平均分装成10管，于pH＝8.0的磷酸盐缓冲体系下，37℃温孵0min，15min，30min，1h，2h，4h，6h，10h，12h，24h，离心取上清液，利用高效液相色谱法测定各时间点产物的含量(扣除相应空白)，制备酶促曲线，计算酶促反应动力学系数V_m和K_m。

2)芹菜素IC₅₀值的测定

取所述固定化酶160mg，依次加入160μL浓度25mg/mL的NAPDH，1200μL浓度35μM的雄烯二酮，震荡混匀后，平均分装成8管，分别标号0～7，0号管加入20μLPBS缓冲液，1～7号管分别加入20μL浓度为5μM，2μM，1μM，500nM，250nM，100nM，50nM的芹菜素，再次震荡混匀后，于37℃温孵8h，测定产物睾酮的含量，计算不同浓度芹菜素的抑制率，其计算公式为：I(％)＝(A₁-A₂)/A₁×100％，A₁为不加入抑制剂时产物的峰面积，A₂为加入抑制剂后产物的峰面积。以抑制剂浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，制定回归曲线，计算IC₅₀值。

实例4：大黄素对固定化酶抑制性的研究

1)大黄素酶促抑制曲线

取所述固定化酶20mg，依次加入200μL浓度25mg/mL的NAPDH，1500μL浓度35μM的雄烯二酮，100μL浓度500μM的大黄素，震荡混匀后，平均分装成10管，于pH＝8.0的磷酸盐缓冲体系下，37℃温孵0min，15min，30min，1h，2h，4h，6h，10h，12h，24h，离心取上清液，利用高效液相色谱法测定各时间点产物的含量(扣除相应空白)，制备酶促曲线，计算酶促反应动力学系数V_m和K_m。

2)大黄素IC₅₀值的测定

取所述固定化酶160mg，依次加入160μL浓度25mg/mL的NAPDH，1200μL浓度35μM的雄烯二酮，震荡混匀后，平均分装成8管，分别标号0～7，0号管加入20μLPBS缓冲液，1～7号管分别加入20μL浓度为5mM，2mM，1mM，500μM，250μM，100μM，50μM的大黄素，再次震荡混匀后，于37℃温孵8h，测定产物睾酮的含量，计算不同浓度大黄素的抑制率，其计算公式为：I(％)＝(A₁-A₂)/A₁×100％，A₁为不加入抑制剂时产物的峰面积，A₂为加入抑制剂后产物的峰面积。以抑制剂浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，制定回归曲线，计算IC₅₀值。

本发明已以将较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。