一种改良的Grocott六胺银染色方法及其应用

摘要

本发明公开了一种改良的Grocott六胺银染色方法及其应用。该染色方法包括石蜡组织切片的制作步骤、染色步骤、脱水透明步骤以及封片步骤，其中，在所述石蜡组织切片的制作步骤中，将切好的蜡片粘附于经APES处理的载玻片上。该方法解决了染色过程容易脱片的缺陷，特别是对于体型较小的西花蓟马，未脱片率达到70％以上。另外，本发明染色方法得到的切片的虫体内部组织显红色，虫体内的芽生孢子呈现黑色，清晰可见，染色效果极佳。

说明书

技术领域

本发明涉及昆虫病原真菌的染色方法，具体涉及一种改良的Grocott六胺银染色方法，该方法特别适合在西花蓟马-白僵菌石蜡切片中应用。

背景技术

西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande)是一种世界性的农业害虫属于缨翅目，蓟马科，花蓟马属。其寄主范围较广，目前已知的有60个科的500多种植物。2003年西花蓟马首次在北京市发现，目前已成为我国露地和温室蔬菜生产的重要害虫。西花蓟马对化学杀虫剂有较强的抗药性，所以对西花蓟马采取生物防治是非常必要的。尤其是白僵菌经体壁感染昆虫，极其适合于锉吸式口器的西花蓟马的生物防治。因此探析白僵菌与西花蓟马之间侵染过程和免疫反应，可为获得高杀虫活性的生物农药提供理论基础。

Gomori氏六胺银染色(GMS)原为1946年Gomori氏为显示糖原及粘液而设计的一种组织染色。后经Grocott氏改良并推广应用到切片的真菌染色也得到较好的效果。其原理为：真菌的细胞壁富含多糖，经过高碘酸的氧化后释放出醛基，直接将硝酸银还原成金属银，从而使真菌染成棕黑色，有特异性强等特点。由于Grocott六胺银染色对温度有较高的要求，且染色时间长等特点，因此在石蜡切片的应用过程中极易造成脱片现象。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种改良的Grocott六胺银染色方法。

本发明的另一目的在于提供一种上述改良的Grocott六胺银染色方法在石蜡切片检测病原真菌侵染生物体方面的应用。

本发明的染色方法通过对石蜡切片制作过程中的粘片、Grocott六胺银染色的染色过程进行调整改变，从而克服石蜡切片的应用过程中极易造成脱片 的缺陷。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种改良的Grocott六胺银染色方法，包括石蜡组织切片的制作步骤、染色步骤、脱水透明步骤以及封片步骤，其中，

在所述石蜡组织切片的制作步骤中，将切好的蜡片粘附于经APES处理的载玻片上；

所述染色步骤，依次包括如下子步骤：

子步骤一，将脱蜡水化后的切片置于0.5-1％高碘酸溶液中氧化30-40min后水洗；

子步骤二，将切片置于1％亚硫酸钠溶液内1min后流水冲洗，然后再采用蒸馏水洗涤3次；

子步骤三，将切片放入预先预热的乌洛托品银应用液中，在58℃条件下染色90min，然后采用蒸馏水洗涤3-4次；

子步骤四，用黄金氯水调色液调色3-5min，然后用蒸馏水洗涤5min；

子步骤五，用2％硫代硫酸钠溶液固定5min，然后水洗； 

子步骤六，核固红对比染色液染色8min，水洗5min；

所述溶液的百分比均为相应溶质质量与溶剂水的体积的百分比。

在上述改良的Grocott六胺银染色方法中，作为一种优选实施方式，在所述石蜡组织切片的制作步骤中，所述蜡片的厚度为8μm。

在上述改良的Grocott六胺银染色方法中，作为一种优选实施方式，在所述石蜡组织切片的制作步骤中，将粘附于载玻片上的蜡片置于温箱内烤片7天。更优选地，在所述烤片结束后，先采用浓度梯度递减的酒精对切片进行脱蜡，然后用蒸馏水洗3min。

在上述改良的Grocott六胺银染色方法中，作为一种优选实施方式，在所述子步骤三中，所述预热是指在58℃恒温箱中预热15min。

在上述改良的Grocott六胺银染色方法中，作为一种优选实施方式，在所述脱水透明步骤中，采用浓度梯度递增的酒精脱水，采用二甲苯透明。

在上述改良的Grocott六胺银染色方法中，作为一种优选实施方式，在所述封片步骤中，采用中性树胶封片。

在上述改良的Grocott六胺银染色方法中，作为一种优选实施方式，所 述组织为白僵菌侵染的西花蓟马的组织

上述改良的Grocott六胺银染色方法在石蜡组织切片检测病原真菌侵染生物体方面的应用。

在上述应用中，所述病原真菌优选为白僵菌，所述生物体为西花蓟马。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的染色方法很好地解决了染色过程容易脱片的缺陷，特别是对于体型较小的西花蓟马，在采用未改良Grocott六胺银染色方法，染色过程极易脱片，而采用本发明的染色方法未脱片率达到70％以上。另外，本发明染色方法得到的切片的虫体内部组织显红色，虫体内的芽生孢子呈现黑色，清晰可见，染色效果极佳。本发明的方法可以用于其他昆虫病原真菌引起昆虫组织病理学变化的研究；用于医学病理切片；用于其他真菌的检测。

附图说明

图1为经APES处理的玻片；

图2为未经APES处理的玻片；

图3为采用实施例1方法染色的西花蓟马及其体内侵染的白僵菌图片(尼康生物显微镜，100)；

图4为采用实施例1方法染色的西花蓟马及其体内侵染的白僵菌的另一图片(尼康生物显微镜，100)；

图5为采用对比例1-1方法染色的西花蓟马及其体内侵染的白僵菌的图片(尼康生物显微镜，100)；

图6为采用对比例2-1方法染色的西花蓟马及其体内侵染的白僵菌的图片(尼康生物显微镜，100)；

图7为采用对比例2-2方法染色的西花蓟马及其体内侵染的白僵菌的图片(尼康生物显微镜，100)。

具体实施方式

下面通过具体例对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。

本发明中所述溶液的百分比均为溶质质量(g)与溶剂水的体积(mL)的百分比，比如0.5％高碘酸溶液即为0.5g高碘酸溶于100mL水中得到的溶 液。

以下实施例和对比例中使用的各种化学试剂的配制方法及来源如下：

(1)六胺银染色液即乌洛托品银应用液的制备：乌洛托品银应用液依据乌洛托品银原液配制而成。

首先，配制乌洛托品银原液：

取3％乌洛托品水溶液100mL、5％硝酸银水溶液5mL，将二者混合立即出现沉淀，振荡沉淀溶解。4℃可保存数月。

然后，配制乌洛托品银应用液：

先将5％硼酸水溶液4mL加入50mL蒸馏水内，然后再加入50mL上述乌洛托品银原液，混匀。此乌洛托品银应用液应现配现用。

(2)核固红对比染色液的配制方法：

先将5g硫酸铝溶解于100mL蒸馏水中以配制硫酸铝水溶液，然后再将0.1g核固红溶于上述硫酸铝水溶液中，经煮沸、冷却，过滤后室温保存得到的核固红对比染色液。

(3)黄金氯水调色液的配制：取1克氯化金(购自上海生工公司)溶于10克水中，形成10％氯化金溶液；然后将10％氯化金溶液用水稀释100倍，得到1000mL0.1％的黄金氯水调色液。

(4)中性树胶：购自sigma。

(5)10％中性甲醛固定液：购自上海远慕生物科技有限公司。

本发明实施例和对比例中使用的白僵菌的获得方法：以自然感染白僵菌的草履蚧僵虫体为原材料，按王俊平等(王俊平、郑长英，对蓟马类害虫高致病性球孢白僵菌的分离、鉴定，茶叶科学，2011，31(4)：295～299)文献中记载的方法进行白僵菌的分离和培养。

本发明实施例和对比例中使用的试验材料为接种上述白僵菌后72h的西花蓟马成虫。采用喷雾法接种白僵菌，具体如下：将芸豆放入培养皿中，放入西花蓟马，将配好的白僵菌10⁸CFU/mL孢悬液均匀喷到培养皿中，晾干，用保鲜膜覆盖，封口，72h后得到上述试验材料。

本发明实施例和对比例中所采用的染色器皿均经过洗净、烘干处理。

实施例1

染色方法具体为：

(1)石蜡组织切片的制作步骤，主要包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、以及脱蜡和水化等工序，其中：

(a)取材的材料为接种白僵菌后72h的西花蓟马成虫；

(b)固定液采用10％中性甲醛固定液；

(c)切片采用莱卡切片机切片，切得的石蜡切片厚度为8μm；

(d)粘片前载玻片用APES(3-氨丙基-3-甲氧基硅烷)处理，具体处理方法如下：将载玻片用洗液(洗液的配制如下：将20g重铬酸钾溶于110mL蒸馏水中，然后逐滴加入浓硫酸90mL，加入浓硫酸的速度以溶液不发热为度。)处理后，用100％酒精浸泡，再用绸布擦干，清除表面的污渍；将干净的载玻片放入丙酮内5min，室温自然晾干后将载玻片用镊子夹住浸入APES试剂(1ml APES+50ml丙酮)1-2次，每次30s；然后在纯丙酮内洗2次，保持载玻片垂直，然后DEPC水清洗，37℃过夜，干燥；装盒，室温下存放，可存放半年。然后将8μm的石蜡切片粘附于APES处理过的载玻片上，之后放于温箱中在37℃烤片7天；

(e)烤片结束后，先采用二甲苯两次，二甲苯纯酒精(体积比为1:1)，浓度梯度酒精(依次经纯酒精、95wt％酒精、85wt％的酒精、70wt％的酒精、50wt％的酒精、30wt％的酒精)对切片进行脱蜡，然后用蒸馏水洗3min。

除上述(a)-(e)工序以外，在石蜡组织切片的制作步骤中的其他工序均为本领域常规石蜡切片制作工序。

(2)染色步骤，依次按照如下工序①-⑥进行：

①将脱蜡水化后的切片置于0.5％高碘酸溶液中氧化30min，用流动自来水洗5min，该种处理方法可以使着色强烈、持久，更为安全，相比其它氧化处理(比如采用铬酸氧化，需1h)，缩短了氧化时间。

②将切片浸入1％亚硫酸钠溶液内1min，流动水冲洗5min，然后再用蒸馏水洗3次；

③将切片放入已经提前置于58℃条件下预热15min的乌洛托品银应用液中，在58℃条件下染色90min，然后采用蒸馏水洗涤，更换4次。肉眼观察切片呈现黄褐色，置于显微镜下查片，呈棕色。

④将切片置于黄金氯水调色液中调色4min，然后放入蒸馏水中洗涤 5min；

⑤将切片置于2％硫代硫酸钠溶液中固定5min，然后充分水洗；

⑥将切片置于核固红对比染色液中染色8min，然后用自来水洗5min。

(3)脱水透明步骤：先采用系列浓度梯度酒精(依次经70wt％的酒精、85wt％的酒精、95wt％酒精、纯酒精)脱水，然后二甲苯透明。

(4)封片步骤：滴加1-2滴中性树胶封固，得到的切片参见图1。

按照上述染色方法共制作了20个石蜡切片，将其在37℃条件下保存了7天，其中，仅有8个切片中度脱片，其他切片仅轻度脱片。

采用该实施例得到的切片的染色效果参见图3和图4，染色效果非常好，虫体内黑色的虫菌体清晰可见如附图3，菌丝呈现黑色，虫体组织显红色如图4。

对比例1

该对比例的染色方法除染色步骤中的工序①不同于实施例1以外，其他步骤均与实施例1相同。该对比例中染色步骤中的工序①设计为以下一组试验：

第一组(对比例1-1)：将脱蜡水化后的切片置于0.5％高碘酸溶液中氧化60min，用流动自来水洗5min；

按照该对比例1-1的染色方法制作了20个石蜡切片，将其在37℃条件下保存了7天后进行脱片率统计。

对比例1-1得到的石蜡切片的染色效果参见图5，染色效果与实施例1相似，但由于氧化时间长，脱片率有所增加，具体参见表1。

对比例2

该对比例的染色方法除染色步骤中的工序③不同于实施例1以外，其他步骤均与实施例1相同。该对比例中染色步骤中的工序③设计为三组试验：

第一组(对比例2-1)：将切片放入已经提前置于58℃条件下预热15min的乌洛托品银应用液中，在58℃条件下染色60min，然后采用蒸馏水洗涤，更换4次。

第二组(对比例2-2)：将切片直接放入乌洛托品银应用液中，然后加 热至58℃并在58℃条件下染色90min，然后采用蒸馏水洗涤，更换4次。

第三组(对比例2-3)：将切片放入已经提前置于58℃条件下预热15min的乌洛托品银应用液中，在65℃条件下染色90min，然后采用蒸馏水洗涤，更换4次。

按照该对比例的三种染色方法分别制作了20个石蜡切片，将其在37℃条件下保存了7天。

对比例2-1得到的石蜡切片的染色效果参见图6，染色菌丝与图4相比，黑色着色相对较差，整体染色效果差些，脱片率具体参见表1。

对比例2-2得到的石蜡切片的染色效果参见图7，染色虫菌体与图3相比，清晰度差，黑色较浅，整体染色效果差，脱片率具体参见表1。

对比例2-3得到的石蜡切片的染色效果非常差，脱片严重，脱片率具体参见表1。

对比例3

该对比例的染色方法除石蜡组织切片的制作步骤的工序(d)不同于实施例1以外，其他步骤均与实施例1相同。该对比例中石蜡组织切片的制作步骤的工序(d)设计为一组试验：

第一组(对比例3-1)：将8μm的石蜡切片粘附于未经APES处理过的载玻片上，之后放于温箱中在37℃烤片7天，得到的切片参见图2；

按照该对比例的染色方法制作了20个石蜡切片，将其在37℃条件下保存。

对比例3-1得到的石蜡切片的染色效果非常差，脱片非常严重，脱片率具体参见表1。

将实施例1得到的脱片数据与三个对比例的脱片数据进行统计分析，参见下表1，从表1中可知，本发明的方法可以有效解决六胺银染色的易脱片问题。

统计脱片情况：分为3个等级。轻度脱片：切片边缘轻度卷曲和/或脱落面积≤10％；中度脱片：10％<切片脱落面积<80％；重度脱片：切片脱落面积≥80％。脱片是指组织从载玻片上脱下或组织已与载玻片分离，或组织悬浮但尚未脱下。

表1实施例1和对比例1至3的防脱片效果比较

未脱片率指在同一载玻片上，未脱片组织面积占组织总面积的百分比。